ra機(jī)器（Luminex Corporation) 上，通過計算每孔中100個事件，測定分離的Axin2蛋白的量。試驗(yàn)化合物對端錨聚合酶 的抑制作用導(dǎo)致較高水平的Axin2,其與可檢測熒光的增加直接相關(guān)。作為對照，僅用溶劑 (中性對照）和用端錨聚合酶參考抑制劑IWR-2 (3E-06 M)(其指作為對Axin2的最大增 加的對照）處理細(xì)胞。為了分析，將獲得的數(shù)據(jù)針對未處理的溶劑對照標(biāo)準(zhǔn)化并使用Assay Explorer軟件（Accelrys)進(jìn)行擬合，以確定EC 5q值。
[0123] PARPl測定的描述 PARP-I的生物化學(xué)活性測試：自動聚ADP核糖化測定 自動聚ADP核糖化測定以兩個步驟進(jìn)行：酶促反應(yīng)（其中His-標(biāo)記的Parp-I將生物 素化ADP-核糖/ADP-核糖由作為共同底物的生物素化NAD/NAD轉(zhuǎn)移至其自身）和檢測反 應(yīng)（其中分析了結(jié)合于酶的His標(biāo)簽的穴狀化合物標(biāo)記的抗-His抗體和結(jié)合生物素-聚 ADP核糖化殘基的)(1 ent?標(biāo)記的-鏈霉抗生物素之間的時間分辨FRET)。自動聚ADP核糖 化活性可經(jīng)由HTRF信號的增加直接檢測。
[0124] 自動聚ADP核糖化測定作為格雷納低量nb 384-孔微量滴定板中的384-孔HTRF? (Cisbio, Codolet, France)測定形式進(jìn)行。在試驗(yàn)化合物（10倍稀釋濃度）不存在或存 在下，將 35 nM His-標(biāo)記的 Parp-I (人，重組體，Enzo Life Sciences GmbH, L5rrach, Germany)和作為共同底物的 125 nM bio-NAD (Biolog, Life science Inst. , Bremen, Germany)和 800 nM NAD 的混合物以總體積 6 μL (100 mM Tris/HCl、4 mM 氯化鎂、0. 01 % IGEPAL? CA630、lmM DTT、0. 5 % DMS0, pH 8、13 ng/μL 激活的DNA (BPS Bioscience, San Diego, US))于23°C孵育150 min。通過加入4 μL的終止/檢測溶液（70 nM SA-Xlent? (Cisbio, Codolet, France)、2· 5 nM抗 _His_K? (Eu-標(biāo)記的抗-His, Cisbio, Codolet, France)在下列中：50 mM HEPES, 400 mM KF、0.1 % BSA、20 mM EDTA, pH 7.0)終止反 應(yīng)。于室溫下孵育I小時后，用Envision多模閱讀器（Perkin Elmer LAS Germany GmbH) 以激發(fā)波長340 nm (激光模式）和發(fā)射波長615 nm和665 nm測量HTRF。測定發(fā)射信 號的比率。所用的全值為無抑制劑的反應(yīng)。所用的藥理學(xué)零值為在1 μΜ的最終濃度中的 Olaparib (LClabs, Woburn, US)。抑制值（IC50)使用程序 Symyx Assay Explorer? 或者 來自 GeneData 的 Condosseo? 測定。
[0125] TNKSl 和 TNKS2 ELISA 測定的描述 TNKS 1和2的生物化學(xué)活性測試：活性ELISA (自動聚ADP核糖化測定） 為分析TNKS 1和2的自動聚ADP核糖化活性，進(jìn)行活性ELISA :在第一步中，在谷胱甘 肽涂布的板上捕獲GST標(biāo)記的TNKS。然后在化合物不存在/存在下，用生物素化NAD進(jìn)行 活性測定。在酶促反應(yīng)期間，GST標(biāo)記的TNKS將生物素化ADP-核糖由作為共同底物的生 物素化NAD轉(zhuǎn)移至其自身。為了檢測，加入結(jié)合于生物素化TNKS的鏈霉抗生物素-HRP綴 合物，由此被捕獲到板上。生物素化resp自動聚ADP核糖化TNKS的量用HRP的發(fā)光底物 檢測。發(fā)光信號的水平與自動聚ADP核糖化TNKS的量直接相關(guān)，由此也與TNKS活性直接 相關(guān)。
[0126] 活性ELISA在384孔谷胱甘肽涂布的微量滴定板（快速捕獲谷胱甘肽涂布的板 (Express capture Glutathione coated plate), Biocat, Heidelberg, Germany)上進(jìn) 行。用PBS預(yù)平衡各板。然后將板用50 μL 20 ng/孔GST-標(biāo)記的Tnks-I (1023-1327 aa，內(nèi)部制備），分別GST-標(biāo)記的Tnks-2 (873-1166 aa，內(nèi)部制備）在測定緩沖液（50 mM HEPES、4 mM氯化鎂、0. 05 %普流羅尼克F-68、2 mM DTT，pH 7. 7)于4°C孵育過夜。用 PBS-Tween-20洗滌各板3次。通過于室溫下用50 μL封閉緩沖液（PBS、0.05 % Tween-20、 0. 5 % BSA)孵育20分鐘封閉各孔。此后用PBS-Tween-20洗滌各板3次。酶促反應(yīng)在試 驗(yàn)化合物（10倍稀釋濃度）不存在或存在下，在50 μL反應(yīng)溶液（50 mM HEPES、4 mM氯 化鎂、0.05 % 普流羅尼克 F-68、1.4 mM DTT、0.5 % DMSO, pH 7.7)中，用 10 μΜ bio-NAD (Biolog, Life science Inst·, Bremen, Germany)作為共同底物于 30°C 進(jìn)行 1 小時。通過 用PBS-Tween-20洗滌3次終止反應(yīng)。為了檢測，加入在PBS/0. 05%Tween-20/0. 01%BSA中的 50 μL 20ng/Pl鏈霉抗生物素、HRP綴合物（MoBiTec, G5ttingen, Germany)并于室溫下將 各板孵育30分鐘。用PBS-Tween-20洗滌3次后，加入50 μL SuperSignal ELISA Femto最 大靈敏性（Maximum sensitivity)底物溶液（ThermoFisherScientific (Pierce), Bonn, Germany)。于室溫下孵育1分鐘后，用Envision多模閱讀器（Perkin Elmer LAS Germany GmbH)于700 nm測量發(fā)光信號。所用的全值為無抑制劑的反應(yīng)。所用的藥理學(xué)零值為在5 剛的最終濃度中的XAV-939 (Tocris)。抑制值（IC50)使用程序Symyx Assay Explorer? 或者來自GeneData的Condosseo?測定。
[0127] 在上下文中，所有的溫度以°(：表示。在以下實(shí)施例中，〃常規(guī)后處理（work-up) 〃 意指：必要時加入水，必要時調(diào)節(jié)pH值至2-10,這取決于終產(chǎn)物的組成，混合物用乙酸乙酯 或二氯甲烷萃取，分離各相，有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥并蒸發(fā)，殘留物經(jīng)硅膠色譜和/或結(jié)晶純 化。硅膠上的Rf值；洗脫液：乙酸乙酯/甲醇9:1。
[0128] 1H NMR在Bruker 400 MHz分光計上記錄，使用氖化溶劑的殘留信號作為內(nèi)標(biāo)?；?學(xué)位移（δ)以相對于殘留溶劑信號的ppm報告（對于在DMS0-d 6中的1H NMR，δ = 2.49 ppm)。1H NMR數(shù)據(jù)報告如下：化學(xué)位移（多重性，偶合常數(shù)和氫數(shù)）。多重性縮寫如下：s (單峰），d (雙峰），t (三重峰），q (四重峰），m (多重峰），br (寬峰）。
[0129] LCMS-分析： 方法 A:溶劑 A:水 + 0· 1 % TFA;溶劑 B: ACN + 0· 1 % TFA;流量：2 ml/min;梯 度：0 min: 5 % B, 8 min: 100 % B, 8. I min: 100 % B, 8. 5 min: 5% B, 10 min 5% B0 柱：XBridge C8, 3. 5 Mm, 4. 6 x 50 mm; 方法 B:溶劑 A: 10 mM NH4HCO3,溶劑 B: ACN;流速：I. 0 ml/min 柱：XBridge C8, 3· 5 Mm, 4· 6 x 50 mm; HPLC: 方法 A: Α-0· I % TFA/H20, Β-0· I % TFA/ACN:流量-2· 0 mL/min。 柱：XBridge C8 (50 χ 4· 6 mm, 3.5 μηι)〇 實(shí)施例
[0130] 苯基（哌啶-4-基）甲酮
將1-乙?；哙?4-甲酸（3.0 g, 0.018 mol)按小份添加至亞硫酰氯（10 mL, 0. 143 mol)并在室溫下攪拌4 h。在真空下濃縮該反應(yīng)并用甲苯（2 X 200 mL)共蒸發(fā)。將 殘余物溶解（微溶）在1，2-二氯乙烷中并添加至無水氯化鋁在苯（20 mL)中的攪拌懸浮 液中。將所得混合物回流2 h，傾倒至碎冰中并用氯仿（2 X 200 mL)萃取。用鹽水洗滌合 并的有機(jī)層，經(jīng)無水Na2SO4干燥并蒸發(fā)以獲得棕色膠。用6 N鹽酸（60 mL)將獲得的膠回 流6 h。將該反應(yīng)冷卻至室溫并用乙醚（100 mL)洗滌。用10%氫氧化鈉使水性部分呈堿 性并用乙醚（2 X 100 mL)萃取。用鹽水洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)無水Na2SO4干燥并蒸發(fā)至 干。通過柱層析法使用硅膠（60-120)和石油醚/乙酸乙酯作為梯度洗脫純化殘余物以提 供標(biāo)題化合物；收率：1.5 g (45%) ;LCMS (方法B): 190.3 (M+H)，Rt: 2.01 min,純度： 85. 3%;
[0131] 實(shí)施例1 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸甲基-間甲苯基-酰胺（"Al")
向苯基（哌啶-4-基）甲酮（0.15 g，0.79 mmol)在DCM (10 mL)中的懸浮液中添 加二異丙基乙胺（0.30 g，2. 37 mmol)，然后在0 °C下逐滴添加三光氣（0.23 g，0.79 mmol)。在攪拌30 min之后，將該反應(yīng)冷卻至0 °C并添加甲基-間甲苯基-胺（0.093 g, 0. 87 mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物16 h。用DCM (20 mL)稀釋該反應(yīng)混合物，用10% 碳酸氫鈉（50 mL)、L 5 N HCl (50 mL)、水（50 mL)和鹽水（50 mL)洗滌。經(jīng)無水 Na2SfVf1 燥有機(jī)層并蒸發(fā)至干。通過柱層析法使用硅膠（60-120)和石油醚/乙酸乙酯作為梯度洗 脫純化殘余物以提供標(biāo)題化合物；收率：58 mg (26%); LCMS (方法A): 337.2 (M+H)， Rt. 4. 93 min,純度 99. 8% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4. 84 min,純度 99. 8% (254 nm);
[0132] 實(shí)施例2 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸甲基-對甲苯基-酰胺（〃A2〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：79 mg (35%) ; LCMS (方法 A) : 337. 3 (M+H)，Rt. 5. 57 min,純度：98. 2% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 86 min,純度 97. 8% (254 nm);
[0133] 實(shí)施例3 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（3-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（"A3")
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：56 mg (29 %); LCMS (方法A): 367.0 (M+H), Rt. 4.73 min,純度96% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 57 min,純度 98. 5 % (254 nm);
[0134] 實(shí)施例4 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A4〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：28 mg (12%); LCMS (方法 A): 353.2 (M+H)，Rt. 4.47 min,純度 98. 9% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 45min, 99% (254 nm);
[0135] 實(shí)施例5 4-(4-甲基-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A5〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：132 mg (29%); LCMS (方法 A): 367.3 (M+H), Rt. 4.80 min,純度 99.9% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 74 min, 99. 8% (254 nm);
[0136] 實(shí)施例6 4-(4-甲氧基-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃八6〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法 A): 383.3 (M+H), Rt. 4.43 min,純度 99. 7% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 42 min, 99. 7% (254 nm);
[0137] 實(shí)施例7 4-(3-氟-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A7〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：77 mg (17%); LCMS (方法A): 371.3 (M+H)，Rt. 4.59 min,純度 98. 3% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 76 min, 98. 2% (254 nm);
[0138] 實(shí)施例8 4-(4-氟-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A8〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法A): 371.2 (M+H), Rt. 4.63 min,純度 99. 6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 60 min, 99. 8% (254 nm);
[0139] 實(shí)施例9 4-(4-氯-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A9〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：183 mg (16%); LCMS (方法 A): 387.0 (M+H), Rt. 4.93 min,純度 99. 5% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 90 min, 99. 6% (254 nm);
[0140] 實(shí)施例10 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（3-氰基-苯基）-甲基-酰胺（〃A10〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：4 mg (2%) ; LCMS (方法 A) : 405. 2 (M+H)，Rt. 4. 76 min,純度 96. 8% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 34 min, 94. 9% (254 nm);
[0141] 實(shí)施例11 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（4-氰基-苯基）-甲基-酰胺（"All")
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：12 mg (5%); LCMS (方法A): 348.0 (M+H)，Rt. 4.30 min,純度 98.6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 46 min, 94. 9% (254 nm);
[0142] 實(shí)施例12 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（3-氟-苯基）-甲基-酰胺（"A12")
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：23 mg (10%); LCMS (方法 A): 341.3 (M+H)，RT. 4.68 min,純度 99% (254 nm) ; HPLC (方法 B) : Rt. 6. 09 min, 94. 7% (254 nm);
[0143] 實(shí)施例13 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（4-氟-苯基）-甲基-酰胺（"A13")
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：26 mg (11%); LCMS (方法 A): 341.2 (M+H)，Rt. 4.70 min,純度 98. 8% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4.61 min, 98.6% (254 nm);
[0144] 實(shí)施例14 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸乙基-(4-甲氧基-苯基）-酰胺（〃A14〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：103 mg (42%); LCMS (方法 A): 367.2 (M+H)，Rt. 4.82 min,純度 100% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 75 min, 100% (254 nm);
[0145] 實(shí)施例15 4-苯甲?；?哌啶-1-甲酸（2-羥基-乙基）-(4-甲氧基-苯基）-酰胺（〃A15〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物，通過制備型HPLC純化；收率：13 mg (17%); LCMS (方法 A) : 383. 2 (M+H)，Rt. 4. 07 min,純度 98. 2% (254 nm) ; HPLC (方法八）：財· 4. 04 min, 98% (254 nm);
[0146] 實(shí)施例16 (4-苯甲酰基-哌啶-1-基）-(2, 3-二氫-吲哚-1-基）-甲酮（〃A16〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：59 mg (26%); LCMS (方法 A): 335.2 (M+H), Rt. 4.78 min,純度 98. 5% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 74 min, 98. 5% (254 nm);
[0147] 實(shí)施例17 (2,3-二氫-吲哚-1-基）-[4-(4-甲基-苯甲?；?哌啶-1-基]-甲酮〇\17〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：221 mg (52%); LCMS (方法 A): 349.2 (M+H), Rt. 5.11 min,純度 98.6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 5. 05 min, 97. 2% (254 nm);
[0148] 實(shí)施例18 (2, 3-二氫-吲哚-1-基）-[4- (4-甲氧基-苯甲?；?哌啶-1-基]-甲酮（〃A18〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法A): 365.0 (M+H)，Rt. 4.70 min,純度 99. 9% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4.71 min, 99.7% (254 nm);
[0149] 實(shí)施例19 (2, 3-二氫-吲哚-1-基）-[4-(3-氟-苯甲?；?哌啶-1-基]-甲酮（〃A19〃）
類似于實(shí)施例1制備該化合物。 收率：60 mg (14%); LCMS (方法 A): 3