專利名稱：一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法， 屬于生物學免疫方法的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
格列苯脲是磺脲類口服降血糖藥，適用于單用飲食控制療效不滿意的輕、中度非 胰島素依賴型糖尿病，病人胰島B細胞有一定的分泌胰島素功能，并且無嚴重的并發(fā)癥，用 于非胰島素依賴型(成年型、肥胖型)的糖尿病患者。近幾年來，一些不法生產(chǎn)企業(yè)為牟取 暴利，在未經(jīng)獲得批準的情況下，在治療糖尿病的中藥或是保健品中非法加入價格相對低 廉、起效快的格列苯脲等降糖西藥是十分普遍的現(xiàn)象，據(jù)五個省市對市面上銷售的32種宣 稱具有降糖作用中藥及中藥保健品進行的抽樣化驗檢查發(fā)現(xiàn)，70%的藥物中都非法添加有 降糖西藥成分。格列苯脲的降糖作用為甲苯磺丁脲的100-200倍，治療量范圍大，降糖作 用，半減期12-14小時，維持時間長，易引起低血糖昏迷，特別是老年人。因為老年人攝食 少，抗胰島素激素如胰高血糖素，腎上腺素分泌反應障礙均可誘發(fā)低血糖，再者老年人糖尿 病性植物神經(jīng)病變，急性低血糖癥狀可以被掩蓋，低血糖昏迷如持續(xù)6小時以上引起大腦 功能損害可能是不可逆的，主要是神經(jīng)元廣泛變性、壞死，大小神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤。神經(jīng)系 統(tǒng)中大腦皮質(zhì)、海馬回，小腦、尾狀核，蒼白球處低血糖最為明顯。所以格列苯脲必須由醫(yī)生 處方才可使用。在治療糖尿病的中藥或保健產(chǎn)品非法加入格列苯脲而不標明藥物成分和劑 量，使得醫(yī)生和患者都無法預知和掌握可能有的毒副作用，極易導致出現(xiàn)藥物不良反應；而 一些患者往往會在服用醫(yī)生治療用處方藥的同時服用保健食品，造成攝入過量藥物中毒， 加劇病情，嚴重的甚至危及患者生命。所以，為了保證人民群眾的飲食用藥安全，我們必須 加大力度打擊這種現(xiàn)象。然而近年來，不法分子非法生產(chǎn)的手段日趨隱蔽，而且由于中藥成 分比較復雜，檢測難度較大，需要精密的分析儀器和專業(yè)技術(shù)人員，因而造成監(jiān)管部門監(jiān)督 抽驗成本很大，收效卻不甚理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服以上的不足，提供一種能快速、靈敏、簡便地檢測格列苯 脲衍生物的格列苯脲膠體金層析檢測試紙條及制備方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金 層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，金 標結(jié)合墊為吸附格列苯脲衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用格列苯脲衍生 物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測線τ線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C 線，兩條線豎向平行排列。襯板為不吸水的PCV韌性材料。包被膜為硝酸纖維素膜，或混合 纖維素膜。吸水墊為植物纖維棉紙。格列苯脲衍生物的金標抗體為膠體金標記的抗格列苯 脲衍生物的單克隆抗體復合物，偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。
一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，制備偶聯(lián)格 列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線；制備偶聯(lián)格列苯脲衍 生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金標抗體，用于制備 吸附格列苯脲衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備對照線C線， 包括如下步驟
(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經(jīng)過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25 ；等所有反應結(jié)束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原。(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白 濃度，備膠體金標記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆
5抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min)，逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，重懸液為含5% 海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；
(E)將1 :20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標結(jié)合墊；
(F)在包被膜上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢測 線T線，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊、金標組合墊、包被膜和吸水墊依次粘附在襯板上，樣品墊 置于襯板的一端，吸水墊置于襯板的另一端，包被膜置于襯板的中間，金標結(jié)合墊置于樣品 墊和包被膜之間，即得到用于免疫檢測的格列苯脲衍生物膠體金層析檢測試驗紙大板，將 大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點
1、特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標記高特異性高親和力靜 電吸附的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成。2、簡便、快速、時效性強，使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試 劑和儀器，可現(xiàn)場操作，將樣品用提取液混合后，取上清液進行檢測，在5min即可判定檢測結(jié)果。3、結(jié)果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測 結(jié)果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時，表示在被檢樣品中含有被檢 物，顯示兩條紅色線T線和C線時，表示在被減樣品中不含被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準 確、簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。4、制備方法采用噴涂工藝，簡單快速，噴涂均勻，干燥快。


圖1為本發(fā)明的剖面結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明的俯視結(jié)構(gòu)示意圖中標號1-襯板、2-樣品墊、3-金標結(jié)合墊、4-包被膜、5-吸水墊、6-T線、7-C線。
具體實施例方式
為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳述，該實施 例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。如圖1、圖2所示一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯板 1和在襯板1上依次銜接的樣品墊2、金標結(jié)合墊3、包被膜4和吸水墊5組成，金標結(jié)合墊3 為吸附格列苯脲衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜4上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián) 的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線6，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線7， 兩條線豎向平行排列。襯板1為不吸水的PCV韌性材料。包被膜4為硝酸纖維素膜，或混 合纖維素膜。吸水墊5為植物纖維棉紙。格列苯脲衍生物的金標抗體為膠體金標記的抗格 列苯脲衍生物的單克隆抗體復合物，偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。制備偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線6 ；制備偶 聯(lián)格列苯脲衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金標 抗體，用于制備吸附格列苯脲衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制 備對照線C線7，包括如下步驟
(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清 白蛋白OVA進行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經(jīng)過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25 ；等所有反應結(jié)束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原。 (B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白 濃度，備膠體金標記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min),逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆茫传@得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，重懸液為含5% 海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；
(E)將1 :20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標結(jié)合墊3 ；
(F)在包被膜4上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢 測線T線6，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線7，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊2、金標組合墊3、包被膜4和吸水墊5依次粘附在襯板1 上，樣品墊2置于襯板1的一端，吸水墊5置于襯板1的另一端，包被膜4置于襯板1的中 間，金標結(jié)合墊3置于樣品墊2和包被膜4之間，即得到用于免疫檢測的格列苯脲衍生物膠 體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密 封干燥保存。格列苯脲膠體金層析試紙條的檢測反應原理格列苯脲屬于小分子物質(zhì)。本發(fā) 明采用競爭法，即樣品中的格列苯脲和固定在包被膜4上的包被抗原M2-BSA競爭膠體進標 記的抗格列苯脲單克隆抗體。當試紙條以樣品墊2末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條 通過毛細作用從下往上泳動，溶解金標墊上干燥的金標抗體，若待測樣品中不存在待測藥 物，則金標抗體會直接泳動到檢測線和硝酸纖維膜上的M2-BSA發(fā)生免疫反應，從而膠體金 顆粒發(fā)生聚集，形成紅色線條，然后其他未結(jié)合的金標抗體繼續(xù)通過毛細管作用向前泳動， 與對照線上的羊抗鼠二抗發(fā)生第二次免疫反應，同樣形成紅色線條，這樣包被膜4上就會 有兩條紅色線條，表示樣品為陰性。若待測樣品中存在待測藥品，則金標抗體首先會和樣品 中的檢測物發(fā)生免疫反應，當未發(fā)生反應的金標抗體有剩余時，才會在檢測線上與M2-BSA 發(fā)生免疫反應，形成紅色線條，其顏色強度弱于陰性時的線條強度；而當金標抗體全部和樣 品中的格列苯脲發(fā)生免疫結(jié)合時，就不會再有抗體與對照線包被原結(jié)合，從而檢測線就不 會有紅色線條出現(xiàn)。對照線是為檢驗金標免疫層析方法本身是否存在待測藥物，對照線都 應該顯現(xiàn)。如果對照線不顯色，則說明試紙否有效而設(shè)定的，所以無論樣品中是條失效。本發(fā)明特異性強，敏感度高，檢出最低限量可達到5ppb ；簡便、快速、時效性強， 無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定 檢測結(jié)果；結(jié)果顯示形象、直觀、準確；節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。
權(quán)利要求
一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于由襯板(1)和在襯板(1)上依次銜接的樣品墊(2)、金標結(jié)合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)組成，金標結(jié)合墊(3)為吸附格列苯脲衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜(4)上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線(6)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線(7)，兩條線豎向平行排列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特 征在于所述襯板(1)為不吸水的PCV韌性材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條， 其特征在于所述包被膜(4)為硝酸纖維素膜，或混合纖維素膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特 征在于所述吸水墊(5)為植物纖維棉紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，特 征在于格列苯脲衍生物的金標抗體為膠體金標記的抗格列苯脲衍生物的單克隆抗體復合 物，所述偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。
6.一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于 制備偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線(6)；制備 偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金 標抗體，用于制備吸附格列苯脲衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于 制備對照線C線(7)，包括如下步驟(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na2SO4 進行干燥，之后過濾，再經(jīng)過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止 加熱稍冷卻后，將反應液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na2SO4干燥， 過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的 溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反應完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0. 2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液 加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5°C條件下避光攪拌，待反應完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25;等所有反應結(jié)束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進行透 析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原；(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細胞株， 用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白濃 度，備膠體金標記用；(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min),逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶 液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆茫传@得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，所述重懸液為 含5%海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；(E)將1:20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標結(jié)合墊(3)；(F)在包被膜(4)上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式 檢測線T線(6)，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線(7)，兩條線豎向平行排列；(G)試紙條的組裝將樣品墊(2)、金標組合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)依次粘附在 襯板(1)上，樣品墊(2)置于襯板(1)的一端，吸水墊(5)置于襯板(1)的另一端，包被膜(4) 置于襯板(1)的中間，金標結(jié)合墊(3)置于樣品墊(2)和包被膜(4)之間，即得到用于免疫檢 測的格列苯脲衍生物膠體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm 寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速檢測格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，金標結(jié)合墊為吸附格列苯脲衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列。其具體步驟制備人工結(jié)合抗原；制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體；制成膠體金溶液；獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標記物和金標結(jié)合墊。本發(fā)明具有特異性強，敏感度高，簡便、快速、時效性強，結(jié)果顯示形象、準確的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/558GK101986156SQ201010516359
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者吳迪宏, 歐衛(wèi)軍 申請人:南通市伊士生物技術(shù)有限責任公司