每孔加入50uL;d)重復(fù)上述10次。
[0150] (2)CD-J-1 和CD-J-2(分子量 257,使用濃度 500uM，即 0· 13mg/mL) :a)52mgCK22 溶 于1000uLDMS0中，濃度為0. 052mg/uL;b)40uLCK22溶液溶于4mL1640完全培養(yǎng)基中，濃 度為0· 52mg/mL，每孔加入50uL;c) 2mL濃度為0· 52mg/mL的CK22溶液溶于2mL1640完全 培養(yǎng)基中，濃度為o. 26mg/mL，每孔加入50uL;d)重復(fù)上述10次。
[0151] 試驗操作：
[0152]aCT3/⑶28抗體誘導(dǎo)的小鼠脾細朐增猜抑制實騎:每孔加入100uL細胞懸液，即 5*105/well，再加或不加入50uL濃度為2. 5ug/uL的ConA和50uL不同濃度的抑制劑，陰性 對照孔補足50uL完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時，收集細胞培養(yǎng)上清lOOuL/well用于后 續(xù)ELISA檢測，加入lOuL/wellCCK8試劑，檢測細胞增殖情況。顯微鏡觀察各組免疫細胞 增殖情況。劑量設(shè)置和實驗分組見表1。
[0153]絲裂原ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細朐增猜抑制實駘：無菌制各的C57BL/6小鼠脾細 胞，以完全1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5*106/mL，向5ug/mL⑶3預(yù)包板的板中每孔加入 100uL細胞懸液，即5*105/well，再加或不加入50uL濃度為8ug/mL的CD28和50uL不同 濃度的抑制劑，陰性對照孔補足50uL完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)144小時，收集細胞培養(yǎng)上清 lOOuL/well用于后續(xù)ELISA檢測，加入lOuL/wellCCK8試劑，檢測細胞增殖情況。顯微鏡 觀察各組免疫細胞增殖情況。劑量設(shè)置和實驗分組見表2。
[0154] 表1、α⑶3/⑶28抗體誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖抑制實驗劑量設(shè)置
[0155]
[0156] 表2、ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖抑制實驗劑量設(shè)置
[0157]
[0158] 三種化合物對ConA和α⑶3/⑶28抗體誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖抑制結(jié)果見表3。
[0159] 以α⑶3/⑶28抗體為刺激源，CK8 (泰瑞米特鈉）、⑶-J-1 (化合物1)和⑶-J-2 (化 合物2)均在10μΜ濃度時開始出現(xiàn)對淋巴細胞增殖抑制作用，并在100uM時，這一效應(yīng)更 為顯著。CK8和⑶-J-1對淋巴細胞增殖抑制稍強于⑶-J-2。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低劑量組（ΟμΜ、 0. 1μΜ、1μΜ)增殖顯著，細胞變大，并出現(xiàn)部分貼壁的現(xiàn)象，高劑量組（10μΜ、100μΜ)增 殖受抑，活化大細胞顯著減少，僅見圓形小細胞，且總細胞數(shù)也明顯減少。CK8(泰瑞米特 鈉）、CD-J-1 (化合物1)和CD-J-2 (化合物2)對aCD3/CD28誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖的抑制 活性圖如圖1所示。
[0160] 以ConA為刺激源，CK8 (泰瑞米特鈉）在10uM濃度時開始出現(xiàn)對淋巴細胞增殖抑 制作用，100uM時，這一效應(yīng)更為顯著。⑶-J-1 (化合物1)僅在100uM出現(xiàn)對淋巴細胞增殖 抑制作用，而⑶-J_2(化合物2)即使在100uM時也未見明顯的抑制淋巴細胞增殖作用。鏡 下結(jié)果類似，CK8從10uM組開始隨著濃度增加，細胞克隆數(shù)逐漸減少、細胞增殖集落逐漸變 小。⑶-J-1僅在100uM時鏡下出現(xiàn)克隆數(shù)減少和細胞增殖集落變小，而⑶-J-2各組之間未 見明顯差異。CK8 (泰瑞米特鈉）、⑶-J-1 (化合物1)和⑶-J-2 (化合物2)對ConA誘導(dǎo)的 淋巴細胞增殖的抑制活性圖如圖2所示。
[0161] 表3、三種化合物對ConA和α⑶3/⑶28抗體誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖的抑制效果
[0164] 本實驗結(jié)果表明，⑶-J-1、⑶-J-2主要抑制特異性免疫，對絲裂原誘導(dǎo)的非特異性 免疫抑制較弱。對絕大多數(shù)自身免疫病而言，特異性免疫（體液免疫和細胞免疫）紊亂在 疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，抑制特異性免疫應(yīng)答，糾正特異性免疫紊亂，可阻斷疾病 的進展和惡化。
[0165] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種如下式（I)所示結(jié)構(gòu)的化合物：其中，各自獨立地選自下組：H、鹵素、取代或未取代的C1-C10的烷基、取代或 未取代的C6-C10的芳基、取代或未取代的C1-C10的雜芳基； R4、R5、R6各自獨立地選自下組：H、-CN、-〇H、鹵素、取代或未取代的C1-C10的烷基、取代 或未取代的C6-C10的芳基、取代或未取代的C1-C10的雜芳基； η選自下組：0、1、2、3 ; 或R4與選自R5或R6中的一個取代基及相鄰雙鍵共同形成取代或未取代的5-7元雜環(huán)； 其中，所述的雜環(huán)指雜環(huán)中含有1-3個選自N、0、S的雜原子； 且所述的取代是基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代：鹵素、C1-C4 烷基。2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于， 氏、R2、R3各自獨立地選自下組：H、鹵素、取代或未取代的C1-C4的烷基、取代或未取代 的苯基、取代或未取代的C1-C10的雜芳基； 尺4、1?5、1?6各自獨立地選自下組：11、-0隊-0!1、鹵素 ；或1?4與選自1?5或1?6中的一個取代基 及相鄰雙鍵共同形成取代或未取代的5-6元雜環(huán)；其中，所述的雜環(huán)指雜環(huán)中含有1-3個選 自N、0、S的雜原子； η選自下組：0、1、2 ; 且所述的取代是基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代：鹵素、C1-C4 烷基。3. 如權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于，包括步驟： 在惰性溶劑中，用式II化合物與式III化合物反應(yīng)，得到式I化合物。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)在有機堿催化劑下進行；較佳地， 所述的有機堿催化劑選自下組：二甲基氨基吡啶（DMAP)、二異丙基乙胺（DIPEA)，或其組 合。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)在縛酸劑存在下進行；較佳地，所 述的縛酸劑選自下組：三乙胺、吡陡、二乙胺、哌陡，或其組合。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述惰性溶劑選自下組：二氯甲烷、三氯甲 烷、1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲苯，或其組合。7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟：將式II化合物、有 機堿、縛酸劑溶于惰性溶劑中，滴加所述式ΠΙ化合物進行反應(yīng)。8. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟；在惰性溶劑中，用所述式I化合物與堿進行反應(yīng)，得到式?；衔铮? 其中，R4'、R5'各自獨立地選自下組出、-0隊-0!1、鹵素、取代或未取代的(：1-(：10的烷基、 取代或未取代的C6-C10的芳基、取代或未取代的C1-C10的雜芳基； R4與選自R5或R6中的一個取代基及相鄰雙鍵共同形成5-7元雜環(huán)；其中，所述的雜環(huán) 指雜環(huán)中含有1-3個選自N、0、S的雜原子。9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括：治療有效量的式I化合物或 其藥學(xué)上可接受的鹽，及藥學(xué)上可接受的載體。10. 如權(quán)利要求1所述的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于： (a) 制備免疫抑制劑； (b) 制備治療自身免疫相關(guān)疾病的藥物組合物； (c) 制備淋巴細胞增殖抑制劑； (d) 體外非治療性地抑制淋巴細胞增殖。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種脫氮嘌呤類化合物及其衍生物的制備方法和應(yīng)用，具體地，本發(fā)明提供了一種如下式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物；其中，各基團的定義如說明書中所述。本發(fā)明的化合物具有很好的淋巴細胞增殖抑制作用，尤其適合用于制備與自身免疫相關(guān)的疾病的藥物組合物。
【IPC分類】A61P43/00, A61P19/02, A61P37/06, A61P1/00, A61P37/02, A61P29/00, C07D487/04, A61P1/16, A61K31/519, A61P11/06, A61P27/02, A61P17/00, A61P37/08, A61P3/10, A61P17/06
【公開號】CN105461722
【申請?zhí)枴緾N201410448906
【發(fā)明人】肖飛, 李秋實, 劉娜, 戴聰聰, 李春, 尹銀華, 袁西倫
【申請人】欣凱醫(yī)藥化工中間體（上海）有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年9月4日