本發(fā)明涉及微生物及生物降解技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種鹽單胞菌及其在降解苯酚中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

苯酚及其衍生物對人和動植物的毒性很強(qiáng)，已被列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物名單。含酚廢水主要來源于造紙、煉油、合成纖維、合成橡膠、農(nóng)藥等行業(yè)，是工業(yè)排放廢水中主要的污染物。在這些含酚廢水中除了含苯酚類污染物之外，往往還含有大量鹽分而使之成為高鹽含酚廢水，這類廢水排放到環(huán)境中會對土壤、地表水和地下水造成嚴(yán)重污染。由于高鹽環(huán)境對微生物生長具有抑制和毒害作用，使得常規(guī)的生物降解技術(shù)在處理這類廢水時存在瓶頸問題。嗜鹽菌能直接用于去除高鹽工業(yè)廢水中的有機(jī)污染物而無需先降低廢水鹽度，因而逐漸受到人們的廣泛關(guān)注。

鹽單胞菌(halomonastaeanensis)革蘭氏陽性桿狀，成單或雙。有鞭毛，位置因菌種而異，周身或極端。有動力。在含鹽8％的培養(yǎng)基上，菌落白色或奶酪色，光滑，直徑小于2mm。兼性厭氧菌。還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。觸媒陽性。kovas氏氧化酶通常陽性，細(xì)胞色素氧化酶陰性。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸?？稍诤}量達(dá)8％的培養(yǎng)基中生長，耐鹽范圍0-32％。適合ph5-9生長。生長溫度：15-45c。目前有對鹽單胞菌在正常條件下對污染物降解特性的研究，但是在高鹽條件下對污染物降解的研究，尤其是對酚類物質(zhì)的降解特性未見相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株能夠降解苯酚的鹽單胞菌。

本發(fā)明從鹽湖淤泥中分離到一株能夠降解苯酚的菌株。通過菌株形態(tài)學(xué)特征，生理生化特征和16srrna序列分析將該菌株鑒定為鹽單胞菌，命名為h17，該菌株于2016年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱，地址：中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號為cctccno.m2016306，分類名為鹽單胞菌halomonastaeanensis。

本發(fā)明提供了含有鹽單胞菌h17的菌劑。

本發(fā)明提供了含有鹽單胞菌h17的生物清潔劑。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在清潔環(huán)境中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在降解苯酚中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在處理工業(yè)廢水中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在處理醫(yī)用廢水中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17在制備生物清潔劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17在制備生物降解劑中的應(yīng)用。

所述生物降解劑為苯酚降解劑。

本發(fā)明的鹽單胞菌h17能夠在50h內(nèi)，濃度5％-10％的環(huán)境下，可降解濃度為200mg/l苯酚達(dá)到90％以上，當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到15％時，對苯酚的降解率也可達(dá)到80％以上，表明該菌具有很好的抗鹽效果。本發(fā)明提供的鹽單胞菌h17及其菌劑在使用過程中無污染，無公害，能夠應(yīng)用于苯酚污染環(huán)境的生物修復(fù)或高鹽環(huán)境下的苯酚的降解，可廣泛應(yīng)用于環(huán)境清潔領(lǐng)域，含苯酚的工業(yè)廢水或醫(yī)用廢水處理領(lǐng)域，具有較好的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為菌株h17與相近種16srdna序列進(jìn)化樹，通過菌株h17的16srrna序列比對分析，與其最相近的是泰安郡鹽單胞菌(halomonastaeanensisbh539)，相似性為99％。

圖2為菌株h17的生長及對苯酚降解的特性圖。

圖3為菌株h17在不同鹽濃度下對苯酚的降解圖。

圖4為苯酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(od270)。

圖5為菌株h17在不同初始苯酚濃度中的生長及降解苯酚特性圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1鹽單胞菌h17的分離和鑒定

1、鹽單胞菌h17的分離

a、將采集到的固體樣品(鹽湖淤泥、海底淤泥、高鹽廢水處理污泥等)1-5g或500ml的液體樣品(鹽湖水、海水、高鹽廢水等)過濾物，溶于10-50ml液體培養(yǎng)基(10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl15％、蒸餾水添加至1000ml。調(diào)節(jié)ph為7.2左右，121℃滅菌15min)，室溫下，轉(zhuǎn)速80-160rpm振蕩30-120分鐘，取出靜置20-40分鐘，用移液器吸取100μl，均勻涂布在固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上(上述液體培養(yǎng)基加2％瓊脂得)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)。

b、直到培長出可見菌落時，用接種環(huán)挑取單個菌落，在平板固體培養(yǎng)基表面上連續(xù)劃線；

c、如此反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。

d、挑取純培養(yǎng)的單個菌落，轉(zhuǎn)接于含有苯酚的液體培養(yǎng)基中，在28℃、150rpm的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，菌液至渾濁；

本步驟中的液體培養(yǎng)基1l配方為nacl100g、tris2g、kcl2g、kno31g、nh4cl5g、mgso4·7h2o24g、mnso4·h2o0.688g、cacl20.12g、葡萄糖1g，蒸餾水添加至1000ml。100ml上述液體培養(yǎng)基中加入滅過菌的0.05mol/lna2hpo42ml、0.01mol/lfeso42ml、10mg/ml酵母提取物2ml、10mg/ml胰蛋白胨2ml、10mg/ml苯酚2ml(換算后為200mg/l苯酚溶液)。

e、用移液器吸取200μl菌液轉(zhuǎn)接于步驟d所述的含有苯酚的液體培養(yǎng)基中，如此反復(fù)5-8次，獲得一株穩(wěn)定高效的降解苯酚的嗜鹽菌，命名為h17。

2、菌株的形態(tài)學(xué)特征

該菌菌落呈乳白色，圓形，隆起，表面濕潤，比較光滑，菌落邊緣很整齊，革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性桿菌。

3、16srdna鑒定

該菌株的16srdna部分序列長為1285bp，將該序列在ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行blast比對分析，通過在genbank中進(jìn)行blastn序列比對，挑選與菌株h17同源序列相似性最高的有代表性的菌株，采用鄰位相接法(neighbor-joining)利用mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖1，自展檢驗(bootstrap)1000次。顯示菌株h17為鹽單胞菌，與目前已發(fā)表的鹽單胞菌序列相似性達(dá)99％。

綜合菌體形態(tài)、生理生化特性和16srdna基因序列，該菌株h17于2016年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱，地址：中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號為cctccno.m2016306，分類名為鹽單胞菌halomonastaeanensis。

實施例2鹽單胞菌h17的降解苯酚性能試驗

采用高效液相色譜法檢測鹽單胞菌h17對培養(yǎng)基中苯酚降解作用。

1、菌株h17的生長及對苯酚降解的特性

菌株h17在苯酚濃度為200mg/l，氯化鈉濃度為10％的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基1l的配方為10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10％、蒸餾水添加至1000ml。調(diào)節(jié)ph為7.2左右，121℃滅菌15min。

中隨時間變化菌株的生長與苯酚濃度變化曲線如圖2所示。菌株h17在經(jīng)過8h左右的停滯期后進(jìn)入對數(shù)生長期，在此期間，菌株隨時間幾乎進(jìn)行線性生長，接近30h及以后菌株處于穩(wěn)定生長期。菌株對苯酚的降解主要在對數(shù)穩(wěn)定期，菌株在此期間增殖能力強(qiáng)，對碳源需求大，苯酚降解速度快。此后，培養(yǎng)基中的碳源苯酚已相對較少，沒有新的碳源補(bǔ)充，代謝產(chǎn)物也不斷積累，菌株生長受到抑制，數(shù)量不再增加，此時菌株對苯酚降解達(dá)到最大，苯酚降解率為90％。

2、菌株h17在不同鹽濃度下對苯酚的降解

一般微生物在處理高鹽含苯酚廢水時，由于廢水中鹽濃度會隨著季節(jié)及水流量而變化，使其在處理上遇到瓶頸，這又考驗微生物對變化的鹽環(huán)境的適應(yīng)性，增大了此類廢水的處理難度。因此，鹽濃度成為微生物降解苯酚的關(guān)鍵因素。

見圖3，隨著nacl濃度的增大，菌株的生長和對苯酚的降解是先升高后降低的趨勢。當(dāng)nacl濃度為10％時，菌株h17的對苯酚的降解達(dá)到最大，為90％；當(dāng)nacl濃度大于15％時，菌株h17對苯酚的降解也可達(dá)到85％左右。

3、菌株在不同苯酚濃度下的降解特性研究

試驗方法：將菌株分別接種到苯酚濃度為0mg/l，100mg/l，200mg/l，400mg/l，600mg/l，800mg/l的液體的培養(yǎng)基中(配方為10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10％、蒸餾水添加至1000ml)。調(diào)節(jié)ph保持在7.0，以165r/min的轉(zhuǎn)速在溫度為30℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，其他條件不變。測初始生物量和苯酚濃度以及在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)72h后的生物量和苯酚濃度。

測定方法：吸取培養(yǎng)0h和60h后的培養(yǎng)液1ml，加入到5ml的離心管中，再向離心管中加入3ml的無菌培養(yǎng)液，稀釋混勻后，使用紫外可見分光光度計檢測其生物量od600。同時，吸取培養(yǎng)0h和60h后的培養(yǎng)液1ml，加入到1.5ml的離心管中，將其在6000r/min條件下離心10min，取上清液0.8ml加入到5ml的離心管中，再向離心管加入2.4ml無菌培養(yǎng)液，混勻后將紫外可見分光光度計波長設(shè)定為270nm，進(jìn)行苯酚吸光度的測定，根據(jù)苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)計算苯酚初始濃度和60h濃度，從而計算苯酚降解率。

結(jié)果分析：通過數(shù)據(jù)分析可知，苯酚濃度的變化對菌株h17的生長和降解苯酚的能力有顯著性影響(p<0.01)。由圖5可知，菌株的生長和對苯酚的降解隨苯酚濃度的變化有相似的規(guī)律，均隨苯酚濃度的增大有先升高后降低的趨勢。當(dāng)苯酚濃度為200mg/l時，菌株h17的生長及對苯酚的降解均達(dá)到最大，其生物量od600為1.8，苯酚降解率為90％以上。通過多重比較可知，當(dāng)苯酚濃度大于或小于200mg/l，菌株h17的生長和對苯酚的降解均顯著變化(p<0.01)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。