一種新的生物堿類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的附子中分離得到的一種具有血管保 護(hù)作用的生物堿類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 附子為毛茛科植物烏頭aconitum carmichaeli debx.的子根的加工品。6月下旬 至8月上旬采挖，除去母根、須根及泥沙，習(xí)稱"泥附子"。加工炮制為鹽附子、黑附子（黑順 片）、白附片、淡附片、炮附片。屬溫里藥。中藥中"回陽救逆第一品"。主產(chǎn)于四川、湖北、湖南 等地。附子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品。陶弘景謂："烏頭與附子同根，附子八月采，烏頭 四月采，春時莖初生有腦頭，如烏鳥之頭，故謂之鳥頭。"韓保升謂："正者為烏頭，兩歧者為 烏喙，細(xì)長三、四寸者為天雄，根旁如芋散生者為附子，旁連生者為側(cè)子，五物同出而異名， 苗高二尺許，葉似石龍芮及艾"。蘇頌謂："五者今并出蜀土，都是一種所產(chǎn)，其畝高三、四尺， 莖作四棱，葉如艾，其花紫碧色作穗，其實細(xì)小如桑椹狀，黑色，本只種附子一物，至成熟后 乃有四物。"《本草綱目》載："烏頭有兩種，出彰明者即附子之母，今人謂之川烏頭是也，其產(chǎn) 江左山南等處者，乃本經(jīng)所列烏頭，今人謂之草烏頭是也。"
[0003] 附子的化學(xué)成分主要是生物堿類物質(zhì)，此外還有脂類及多糖等。附子的毒性成分 是雙酯型生物堿，其中主要是烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等。在二萜類生物堿中，以烏頭堿 的研究最全面，它的毒性和藥理作用均有不少報道。烏頭堿的主要毒性作用是抑制呼吸及 引起心律失常，其對心臟的直接毒性作用是使心肌細(xì)胞鈉離子通道開放，加速鈉離子內(nèi)流， 促使細(xì)胞膜去極化，從而引起心律失常。二萜類醇胺為烏頭堿，中烏頭堿和次烏頭堿相應(yīng)生 物堿的水解產(chǎn)物。它們的毒性很小，大劑量只引起竇房傳導(dǎo)阻滯而不引起異位節(jié)律和室顫。 附子的特點在于炮制，炮制的過程也即是將原來生品中所含毒性很強(qiáng)的雙酯類生物堿水解 為毒性較小的單酯類堿，如繼續(xù)水解則轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿〉陌反碱悏A。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的附子中分離得到的一種具有血管保護(hù)作用的 生物堿類化合物及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0006] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0008]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的附子粉碎，用75~ 85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙 酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫10個柱體積， 收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏 用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25 :1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用80 %乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0010]進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0011]藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 所述的化合物(I)在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的藥物組合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0015] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0016] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0017]圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0018] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0020]實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0021 ] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0022]制備方法：（a)干燥的附子（10kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提取（25LX3次），合并 提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水飽和的正丁 醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用75% 乙醇洗脫10個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（163g);(c) 步驟(b)中75 %乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體積比為85 :1 (8個柱體 積）、45:1 (8個柱體積）、25:1 (8個柱體積）、12:1 (10個柱體積)和1:1 (5個柱體積)的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(49g)用200-300目正相硅膠進(jìn)一步分 離，依次用體積比為20:1 (8個柱體積）、12:1 (10個柱體積)和5 :1 (5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中組分2(30g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠 0DS-C18分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (143mg)。
[0023] 結(jié)構(gòu)確證：淺黃色油狀物;HR-ESMS顯示[M+Na]+為m/z305.1612，結(jié)合核磁特征 可得分子式為C18H22N20，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ΡΡπι，DMS〇-d6，400MHz):H-3 (1.92，td，J=12,3)，H-3(2.74，m)，H-7(6.21，br，s)，H-9(7.46，br，d，J= 7.5)，H-10(7.01， td，J= 7.5，l)，H-ll(7.08，td，J= 7.5，l)，H-12(7.25，br，d，J= 7.5)，H-14(1.47，m)，H-14 (1.54，m)，H-15(2.43，m)，H-16(3.11，m)，H-17(3.82，dd，J=12,9)，H-17(3.94，dd，J=12， 3.5)，H-18(3.41，m)，H-18(3.46，m)，H-19(2.09，m)，H-19(2.20，m)，H-21(5.57，s)，N4-Me (2 · 24，s)，NH( 8 · 41，br，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ。（ppm，DMS〇-d6，100MHz): 139 · 2 (C，2-C)， 55.3(CH2,3-C)，99.4(CH，7-C)，128.1(C，8-C)，119.6(CH，9-C)，119.4(CH，10-C)，121.1 (CH，11-C)，110.3(CH，12-C)，135.2(C，13-C)，32.4(CH2，14-C)，43.8(CH，15-C)，46.2(CH， 16-C)，72.9(CH2，17-C)，70.5(CH2，18-C)，38.2(CH2，19-C)，115.1(C，20-C)，134.3(CH，2卜 C)，45.2(CH3，N4_Me);碳原子標(biāo)記參見圖UIR光譜表明該化合物含有胺基，（3339CHT1)基 團(tuán)；UV光譜顯示出吲哚的特征吸收帶219,281和288nm</HNMR譜顯示出四個芳族共振信號（δ !17.〇1，7.〇8,7.25,7.46)，一個吲哚順信號0!18.41)，一個^]\^信號0!12.24)，一個烯烴質(zhì) 子信號（SH5.57)，以及一個芳香族質(zhì)子單峰信號（δΗ6.21)。上述芳香族質(zhì)子單峰信號（δ Η6.21)與吲哚ΝΗ信號（δΗ8.41)的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明該化合物為6,7_開環(huán)的單萜吲哚生物堿化 合物。13C匪R譜顯示了 18個共振碳信號，包括一個甲基，五個亞甲基，八個次甲基，兩個季 碳，以及與吲哚氮相連的兩個叔碳(C-2和C-13)。核磁數(shù)據(jù)顯示兩個烯屬碳信號δα?5.1和 134.3，以及一個烯屬氫質(zhì)子信號δΗ5.57，表明C-20和C-21之間存在雙鍵。此外，還觀察到兩 個含氧亞甲基信號3〇7〇.50!13.41，3.46)和72.90!13.82,3.94)。綜合氫譜、碳譜、圓8(：譜和 N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一 步通過Ε⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0024]實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 [0025] 一、材料和儀器
[0026]血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室饋贈?；衔铮↖)自制，制 備方法見實施例1，HPLC歸一化純度大于98 %。RPMI-1640干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國 Gibeo公司。胎牛血清購于天津TBD公司。MTT、瓊脂糖、AnnexinV-FITC購于美國Sigma公司。 0)!1、10^、500、65!?^測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。0150購于中國醫(yī)藥(集團(tuán)） 上?；瘜W(xué)試劑有限公司。蘇木素購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。Rhodaminel23購于美國 Solarbic公司。陽性藥川考嗪購自上海源葉生物科技有限公司。
[0027] 倒置光學(xué)顯微鏡（日本OlymPus公司），二氧化碳培養(yǎng)箱(美國FormaScientific公 司），電子分析天平(ER-182A型）（日本A&D公司），超凈工作臺（ZHJH-1209型）（上海智城分析 儀器制造有限公司），流式細(xì)胞儀(FACSVantage型）（美國BeetonDiehnson公司），恒溫振 蕩器（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠），1420Vietor3多標(biāo)記分析儀（美國PerkinElmer Lifescience公司），721型可見紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)有限公司），電熱恒溫水 浴箱(上海醫(yī)療儀器三廠生產(chǎn)），酶聯(lián)免疫檢測儀(11(3 11111^81^111)(上海1'1161'1]1〇]^385^七6111 分析儀器公司）。
[0028]二、試驗方法
[0029] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0030] ECV-304細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基于37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。鏡下觀察，待 細(xì)胞匯合率達(dá)到70%以上時用胰蛋白酶消化傳代，以生長穩(wěn)定的第3-5代細(xì)胞制備細(xì)胞懸 液。
[0031 ] 2、細(xì)胞分組及處理
[0032]取生長良好的ECV-304細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板