1,3-茚滿二酮類化合物山芝麻堿及其藥物用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及一種從藥用植物山芝麻中分離得到的1，3-茚滿二酮 類新化合物山芝麻堿及其在制備抗乙肝病毒藥物和抗炎藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 山芝麻為梧桐科植物山芝麻（HelicteresangustifoliaL.)的干燥根或全株，味 苦、性寒，歸肺、大腸經，可解表清熱、解毒消腫，用于治療感冒發(fā)熱、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、 泄瀉痢疾、癰腫。山芝麻作為民間用藥已有悠久的歷史，有大量關于山芝麻抗乙肝病毒及治 療多種炎癥的文獻報道，且大量的臨床試驗證明其療效確切，因此國內許多學者對其抗乙 肝病毒及抗炎效果展開了大量研究，但多停留于粗提物上，到目前為止，其抗乙肝病毒及抗 炎藥效物質基礎和作用機制尚未明確。而山芝麻在我國資源非常豐富，本申請的發(fā)明人擬 對其進行深入研究，確定其抗乙肝病毒和抗炎作用物質，闡明其作用機理，并在此基礎上開 發(fā)出抗乙肝病毒和抗炎藥物，不僅可以充分利用山芝麻資源，還可以減少感染乙肝病毒患 者和炎癥病人的痛苦，創(chuàng)造出較大的經濟效益和社會效益。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種從山芝麻中分離得到的1，3-茚滿二酮類新化合物山芝 麻喊（helicterine, 1) 〇
[0004] 本發(fā)明的進一步目的還在于提供上述化合物作為制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
[0005] 本發(fā)明的進一步目的還在于提供上述化合物作為制備抗炎藥物中的用途。
[0006] 本發(fā)明從山芝麻屬植物山芝麻（H.angustifolia)干燥根的乙醇提取物乙酸乙酯 萃取部位中分離得到1個1，3_茚滿二酮類生物堿（由無法分離的E和Z兩種構型以1:1 比例組成），并應用現(xiàn)代藥理研究方法，對分離得到的化合物進行了抗乙肝病毒和抗炎活 性評價，結果證實其具有較強的體外抗乙肝病毒活性和對內毒素（LPS)以及聚肌胞苷酸 [poly(I:C)]誘導的巨噬細胞系RAW264. 7生成一氧化氮（N0)均有較強的抑制作用，所述的 化合物可用于制備抗乙肝病毒藥物和制備抗炎藥物。
[0007] 本發(fā)明所述的1，3-茚滿二酮類化合物具有以下化學結構：
[0008]
[0009] 本發(fā)明所述的化合物通過下述方法制備：
[0010] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并濃縮得浸膏〇.95kg，加水（4L)混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物200g。將乙酸乙酯萃取部 位經硅膠（200-300目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫， 得到11個流份（Fr. 1-11)，其中流份Fr.3(32g)再經硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脫）和s印hadex LH-20柱色譜等方法純化，分離得到化合物山芝麻堿（helicterine, 1，由無法分離的E和Z 兩種構型以1:1比例組成）。
【附圖說明】
[0011] 圖1是山芝麻根中山芝麻堿的提取分離流程圖。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1制備山芝麻堿
[0013] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合并提 取液并濃縮得浸膏〇.95kg，加水（4L)混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5 次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物200g。將乙酸乙酯萃取部位經硅膠（200-300 目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫，得到11個流份（Fr. 1-11)， 其中流份Fr. 3 (32g)再經硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1, 10:1,5:1,3:1，1:1)、 MPLC(甲醇-水，20:80-80:20梯度洗脫）和s印hadexLH-20柱色譜等手段純化，分離得到 由E和Z兩種構型以1:1比例組成的山芝麻堿（helicterine, 1)組成；
[0014] 化合物1為黃色塊狀結晶（氯仿-甲醇）；m.P. 205-208°C;Μ釅+71.4 (￡· 0.35, MeOH);分子式：C14H16N03;ES頂S:245;UV(Me0H):Xnax(l〇ge):239.5(3.41)，301.4( 3. 27)nm；IR(KBr) υ nax(cm :3318, 2955, 2920, 2356, 1694, 1635, 1558, 1419, 1308； !11?5頂5(口〇8行"6)111/2246.1129[]\1+!1] + ((：14!116勵3，。&1。(1.246.1125) ;其中2構型（1&)的 NMR數(shù)據(jù)為"H-NMR^OOMHz，DMS0-d6)δΗ:8· 89 (2H，dd，J=15. 7, 10. 6Hz，12-NH2)，7. 62( 1H，m，H-12)，7. 43 (1H，d，J = 7. 9Hz，H-6)，7. 32 (1H，d，J = 7. 9Hz，H-5)，4. 27 (1H，m，H-10) ，3. 59 (1H,m,H-lla)，3. 47 (1H,overlapped,H-llb)，2. 56 (3H,s, 4-0CH3)，1. 16 (3H,d,J= 7. 0Hz, 10-0CH3) ;13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)δc:194.l(C-l), 191. 6(C-3), 151. 1(C-12), 14 1. 9 (C-7)，136. 1 (C-9)，136. 0 (C-5)，135. 6 (C-8)，133. 4 (C-4)，132. 0 (C-6)，104. 9 (C-2)，6 6.3(C-11)，34.8(C-10)，18.0(10-0CH3)，17.8(4-0CH3);所含E構型（lb)的NMR數(shù)據(jù)為： iH-NMR^OOMHz.DMSO-df；)SH:8.89(2H，dd，J= 15.7，10.6Hz，12-NH2)，7.62(lH，m，H-12)，7 ?43(lH，d，J= 7.9Hz，H-6)，7.32(lH，d，J= 7.9Hz，H-5)，4.23(lH，m，H-10)，3.59(lH，m，H-1la)，3. 47 (1H，overlapped,H-llb)，2. 58 (3H，s，4-0CH3)，1. 17 (3H，d，J= 7. 0Hz，10-0CH3); 13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)δc: 193.9 (C-3)，191.4 (C-l)，151.0 (C-12), 141. 6 (C-7)，136.5(C -8),136. 0 (C-5),136. 0 (C-9),133. 7 (C-4) ,131.9 (C-6),104. 9 (C-2),66. 3 (C-ll),34. 9 (C-10)，18. 0 (10-0CH3)，17. 7 (4-0CH3)〇
[0015] 實施例2體外抗乙肝病毒（HBV)實驗
[0016]應用ifepG2的2. 2. 15細胞株（教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室， 上海），以每孔10X1〇5個細胞接種于24孔板，培養(yǎng)基為DMEM，生長液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各lOOyg/ml，在5%C02孵箱中37°C培 養(yǎng)，48小時后，換成用二甲基亞砜助溶的含藥培養(yǎng)液，每種藥物設3~5個濃度，每個濃度設 4個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)9天（每3天換液一次），收集上清液用ELISA檢測HBsAg及HBeAg 含量。同樣條件下以不含藥物的培養(yǎng)液上清液作為對照組。同時用上述細胞株，用MTT法 測定藥物的細胞毒性。陽性對照為拉米呋啶。結果證實本發(fā)明所述化合物山芝麻堿具有顯 著的抗HBV活性，且有效濃度低，細胞毒性較小，對HBsAg的IC5。值為58. 3μg/ml，顯著高 于陽性對照拉米呋啶（3TC)，對HBeAg有一定程度的抑制作用，在濃度為100μg/ml時抑制 率為27. 7% (表1)。
[0017] 表1.山芝麻堿對HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0018]
[0019] /:當細胞毒性> 25%時不進行抑制率測試
[0020] 實施例3體外抑制巨噬細胞（RAW264. 7)N0生成試驗
[0021] 取小鼠巨噬細胞細胞系（RAW264. 7)細胞，以1.OX106/ml濃度接種在96孔板中， 在 37°C下培養(yǎng) 2h。然后將供試品（1、2.5、5、10 和 20μΜ)與LPS(lng/ml)或poly(I:C) (lyg/ml) -同加入到細胞培養(yǎng)液中，共同在37°C下培養(yǎng)24h，將細胞培養(yǎng)液迅速在冰 中冷卻。取細胞培養(yǎng)液的上清液按每孔50μ1置于新的96孔板中，在每孔中加入50μ1 Griess試劑（25μ11 %對氨基苯磺酰胺2. 5%磷酸溶液和25μ10. 1 %萘乙二胺2. 5%磷酸 溶液）。室溫下放置lOmin后，用酶標儀在570nm測定反應產物的吸光度（Α)值。在同 一塊96孔板中，要同時加入NaN02的標準溶液用以繪制計算N02濃度的標準曲線，以未 加LPS或p〇ly(I:C)和樣品的細胞培養(yǎng)液作為空白，以未加樣品的細胞培養(yǎng)液為陰性對 照，以地塞米松為陽性對照。用MTT法測定細胞毒作用。結果表明，本發(fā)明所述化合物對 1^5和？〇17(1 :〇誘導的巨噬細胞勵生成均有較強的抑制作用，其1(：5。值分別為15.96和 8. 96μM，以地塞米松（DEX)為陽性對照，結果表明山芝麻堿具有抗炎活性（如表2所示）。
[0022] 表2.山芝麻堿對巨噬細胞Ν0生成的抑制作用
[0023]
[0024] 本發(fā)明中實驗采用的試劑均為本領域公知技術，可市購。
【主權項】
1. 一種1，3-茚滿二酮類化合物山芝麻堿（helicterine)，其具有以下化學結構：2. 按權利要求1所述的1，3-諱滿二酮類化合物山芝麻堿（helicterine)，其特征在 于，通過下述方法制備： 取山芝麻干燥根，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液并濃縮得浸 膏，加水混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液并濃縮至干，得乙 酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取部位經硅膠200-300目柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲 醇50:1-0:1梯度洗脫，得到11個流份Fr. 1-11，其中流份Fr. 3再經硅膠柱色譜（二氯甲 烷-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脫）和 sephadex LH-20柱色譜方法純化，分離得到化合物山芝麻堿，該山芝麻堿由無法分離的E 和Z兩種構型以1:1比例組成。3. 權利要求1所述的化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。4. 權利要求1所述的化合物在制備抗炎藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及一種1,3-茚滿二酮類新化合物及其在制備抗乙肝病毒和抗炎藥物中的用途。本發(fā)明從山芝麻屬植物山芝麻(Helicteres.angustifolia)干燥根中分離得到1個由E和Z兩種構型以1:1比例組成的1,3-茚滿二酮類生物堿山芝麻堿(helicterine)，并采用現(xiàn)代藥理研究方法證實其具有較強的抗乙肝病毒活性，對HBsAg的IC50值為58.3μg/ml，顯著高于陽性對照拉米呋啶，對HBeAg有一定程度的抑制作用；另外，體外抑制一氧化氮生成試驗結果表明其對內毒素(LPS)和聚肌胞苷酸[poly(I:C)]誘導的巨噬細胞一氧化氮生成均有很強的抑制作用，IC50值分別為15.96和8.96μM。所述的山芝麻堿可用于制備抗乙肝病毒和抗炎藥物。
【IPC分類】A61P29/00, A61P31/20, C07C225/18, C07C221/00
【公開號】CN105439878
【申請?zhí)枴緾N201410505723
【發(fā)明人】陳道峰, 殷翔, 凌麗君, 史訓龍, 朱海燕, 盧燕
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月28日