一種新的吲哚生物堿類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從延胡索的干燥塊莖中分離得到的一種具有 治療乳腺癌作用的吲哚生物堿類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 延胡索為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，是一味古 老的止痛良藥，又稱玄胡、元胡，為著名的浙八味之一，主產(chǎn)浙江省東陽、磐安一帶。延胡索 具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的臨床 效果。正因?yàn)檠雍餍Ч@著，臨床應(yīng)用廣泛，在《中國藥典》2010年版中，接近30%的復(fù)方 制劑中使用了延胡索。
[0003] 延胡索主要成分為生物堿，主要為叔胺、季胺類生物堿。叔胺類生物堿在原藥材中 的量約為0.65%，季銨類生物堿(如延胡索甲素、乙素)約為0.3%。到目前為止，從延胡索中 分離得到的生物堿類成分約有30種。從延胡索的塊莖中共提出生物堿10余種，其中經(jīng)鑒定 的有紫堇堿（Corydaline)、dl_四氫掌葉防己堿（dl-Tetrahydropalmatine)、原阿片堿 (Protopine )、L-四氫黃連堿、dl-四氫黃連堿、L-四氫非洲防己堿、紫堇鱗莖堿 (Corybulbine)、β-高白屈菜堿(β-Homoche-lidonine)、黃連堿(Coptisine)、去氫紫堇堿 (De-hydrocorydaline)，還有紫堇達(dá)明堿(Corydalmine即紫堇鱗莖堿）、去氫紫堇達(dá)明堿 等。除生物堿外，延胡索中尚含有大量淀粉，少量黏液質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油，另含無機(jī)微量元素。 還含有多糖、羥鏈霉素(reticulin)、豆留醇、谷留醇、油酸、亞油酸、亞麻酸、延胡索酸、10-二十九碳醇等。
[0004] 延胡索中的生物堿具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓和抗心律失常作用。目前，很多新 的研究表明，延胡索還具有其他廣泛的生理活性，如抗心肌缺血、抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍、抗腫瘤、 抗氧化、保肝等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從延胡索的干燥塊莖中分離得到的一種具有治療乳腺 癌作用的吲哚生物堿類化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將延胡索的干燥塊莖粉碎， 用80~90 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用80%乙醇洗脫8個(gè)柱 體積，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中80%乙醇洗脫 浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0011] 進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為85%。
[0012] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載 體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較；
[0020] 圖3為不同劑量化合物(I)對乳腺癌細(xì)胞增殖活力的影響；
[0021] 圖4為不同劑量化合物(I)對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0023] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0024] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0025]制備方法：（a)將延胡索的干燥塊莖（8kg)粉碎，用85 %乙醇熱回流提取（25L X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(359g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積， 再用80 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏 (138g);(c)步驟(b)中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱體 積）、50:1 (8個(gè)柱體積）、35:1 (6個(gè)柱體積）、15 :1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(32g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用 體積比為25:1(8個(gè)柱體積）、15:1(10個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純 的化合物（I)(29mg)。
[0026] 結(jié)構(gòu)確證：白色粉末;冊43頂3顯示[]\?^]+為111/2 387.1306，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C2iH22N2〇2，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ Η(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-3 (3.29， m)，H-3(3.41，m)，H-5(5.75，m)，Η-6(5· 10，m)，H-9(7.59，d，J = 7.7)，H-10(6.83，t，J = 7.7)，H-ll(7.06，t，J = 7.7)，H-12(6.74，d，J = 7.7)，H-14(5.79，m)，H-15(5.74，d，J = 9.9)，H-17(1.94，d，J = 15.4)，H-17(2.49，d，J=15.4)，H-18(0.68，t，J = 7.4)，H-19(0.92， m)，H-19( 1.01，m)，H-21 (4.28，d，J= 1.5)，16-C02Me(3·71，s)，NH( 10.68，br，s);核磁共振 碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS0-d6，150MHz): 166.1(C，2-C)，50.8(CH2,3-C)，145.2(CH，5-C)，108·9 (CH，6-C)，55.6(C，7-C)，134.5(C，8-C)，124.1(CH，9-C)，120.8(CH，10-C)，127.6(CH，11-C)，108.9(CH，12-C)，142.2(C，13-C)，119.1(CH，14-C)，141.8(CH，15-C)，93.4(C，16-C)， 25.0(CH2，17-C)，8.5(CH 3，18-C)，25.8(CH2，19-C)，40.1(C，20-C)，66.1(CH，2hC)，167.9 (C，16-C0 2Me)，50.7 (CH3，16-C02Me);碳原子標(biāo)記參見圖1。IR光譜表明該化合物含有胺基 (3446cm-〇和酯羰基（1726cm-Ο,ΗΜ?譜顯示四個(gè)芳族共振信號（δΗ6·74,6· 83，7· 06， 7.59)，一個(gè)吲哚順〇!11〇.68)，一個(gè)酯甲基0!13.71)，四個(gè)烯屬次甲基信號[6!15.10(111，!1- 6)，5.74((1，了 = 9.9!^，!1-15)，5.75(111，!1-5)，5.79(111，!1-14)]，以及一個(gè)乙基側(cè)鏈[3!10.68(七， 了 = 7.4抱，!1-18)，0.92(111，!1-18)，1.01(111，!1-19)]。130 NMR譜顯示了21 個(gè)碳信號，包括兩個(gè)甲 基(一個(gè)甲氧基），三個(gè)亞甲基，九個(gè)次甲基(八個(gè)烯屬次甲基），以及七個(gè)季碳。四個(gè)烯屬次 甲基質(zhì)子信號[SH5.75(m，H-5)，5.10(m，H-6)，5.79(m，H-14)，5.74(d，J = 9.9Hz，H-15)]，& 碳信號[δC145·2(C-5)，108·9(C-6)，119·l(C-14)，141·8(C-15)]表明C-5和C-6，C-14和C-l5之間存在雙鍵。HMBC譜中，H-5(δH5·75)與C-2(δC166·l)，C-3(δC50·8)，C-6(δC108·9)，C-7(SC55.6)和C-21 (SC66.1)的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。HMBC譜中，H2-l7(δΗΙ. 94和2.49)與 C-20C166.1)，C-160C93.4)和甲基酯的碳(δ(：167.9)的相關(guān)性表明甲基酯基位于C-16位。 R0ESY譜中，Η-21與Me-18,以及Η-21與H-19a的相關(guān)性表明了Η-21和C-20位的乙基為α構(gòu)型。 綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物 如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過Ε⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0027]實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn) [0028] 一、材料和儀器
[0029] DMEM/F12高糖培養(yǎng)液購于北京Hyclone公司。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購于北京 Hyclone公司。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購于天津TBD公司。CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑購于日本株式會(huì)社 同仁化學(xué)研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于上海炎彬化工科技有限公司。Κ-? 線粒體膜電位探針購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。二甲基亞礬 (DMSO) 和磷酸鹽緩沖溶 液(PBS)購于Sigma公司產(chǎn)品。化合物（I)自制，制備方法見實(shí)施例1，HPLC歸一化純度大于 98% 〇
[0030] -70°C低溫冰箱(FormaScientif iclnc ·公司，美國），電子天平（島津AEL-200型，日 本），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1C型，蘇州），恒溫振蕩器(THZ-C型），高壓蒸汽消毒鍋(YX-400B 型），C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Series Π，Thermalelectroncorp ·，美國），恒溫水浴鍋(BHW2-I 型，國產(chǎn)），倒置相差顯微鏡(CK40型，Olympus，日本），顯微鏡(BX51型，Olympus，日本），顯微 數(shù)碼采集系統(tǒng)(DP71型，Oly