一種新的吲哚生物堿類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的吲哚生物堿類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的吲哚生物堿類化合物，可以從延胡索的干燥塊根中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能夠抑制腎癌細(xì)胞株RC?2增殖，這種抑制呈濃度及時間依賴性，可以用來開發(fā)成治療腎癌的藥物。
【專利說明】
一種新的吲哚生物堿類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從延胡索的干燥塊根中分離得到的一種具有 治療腎癌作用的吲哚生物堿類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 延胡索為罌粟科植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖，是一 味古老的止痛良藥，又稱玄胡、元胡，為著名的浙八味之一，主產(chǎn)浙江省東陽、磐安一帶。延 胡索具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的 臨床效果。正因為延胡索效果顯著，臨床應(yīng)用廣泛，在《中國藥典》2010年版中，接近30%的復(fù) 方制劑中使用了延胡索。
[0003] 延胡索主要成分為生物堿，主要為叔胺、季胺類生物堿。叔胺類生物堿在原藥材中 的量約為0.65%，季銨類生物堿(如延胡索甲素、乙素）約為0.3%。到目前為止，從延胡索中分 離得到的生物堿類成分約有30種。從延胡索的塊莖中共提出生物堿10余種，其中經(jīng)鑒定的 有紫堇堿（〇0^(^1；[116)、(11-四氫掌葉防己堿（(11-161^3117(11'(^3111^1：；[116)、原阿片堿 (Protopine )、L-四氫黃連堿、dl-四氫黃連堿、L-四氫非洲防己堿、紫堇鱗莖堿 (00^1311113；[116)、0-高白屈菜堿（0-!101]1〇(3116-1丨(1〇11；[116)、黃連堿（&^1：丨8；[116)、去氫紫堇堿 (De-hydrocorydaline)，還有紫堇達(dá)明堿(Corydalmine即紫堇鱗莖堿）、去氫紫堇達(dá)明堿 等。除生物堿外，延胡索中尚含有大量淀粉，少量黏液質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油，另含無機(jī)微量元素。 還含有多糖、羥鏈霉素(reticulin)、豆甾醇、谷甾醇、油酸、亞油酸、亞麻酸、延胡索酸、10-二十九碳醇等。
[0004] 延胡索中的生物堿具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓和抗心律失常作用。目前，很多新 的研究表明，延胡索還具有其他廣泛的生理活性，如抗心肌缺血、抗實驗性胃潰瘍、抗腫瘤、 抗氧化、保肝等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從延胡索的干燥塊根中分離得到的一種具有治療腎癌 作用的吲哚生物堿類化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的： 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)延胡索的干燥塊根粉碎，用 80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫12個柱體積， 收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫物浸膏用 正相硅膠分離，依次用體積比為85 :1、55:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和10:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為80%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫 液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0008] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用85%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0009] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0010] -種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I)和 藥學(xué)上可接受的載體。
[0011] 所述的化合物(I)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0014] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0015] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0017] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試 劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0018] 制備方法：（a)將延胡索的干燥塊根（5kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提?。?5L X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L X 3次）、乙酸乙酯(3L X 3次)和水飽 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再 用75%乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（131g); (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1(8個柱體積）、55:1 (8個柱體積）、35:1 (6個柱體積）、15:1 (8個柱體積)和1:1 (5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(29g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 20:1(8個柱體積）、15:1(10個柱體積)和10:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個組分；（e)步驟(d)中組分2(llg)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為80%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (I)(278mg)〇
[0019] 結(jié)構(gòu)確證:黃色油狀物，冊43頂3顯示[1+!1]+為111/2 337.1863，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C21H24N2〇2，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ Η(ΡΡπι，CDC13，500MHz) :H-3(4.03， m),H-5(3.47,d,/=6.9Hz),H-6a(3.38,dd,/=16.1,6.9Hz),H-6b(2.63,d,/=16.1Ηz),Η-9 (7.49，dJ=8.2Hz)，H-10(7· 13，tdJ=8.2，l ·3Ηζ)，Η-11(7·23，?(1，/=8·2，1·3Ηζ)，Η-12 (7.31,d,/=8.2Hz),H-14a(2.73,d,/=13.2Hz),H-14b(1.82,d,/=13.2Hz),H-17a(4.34,d,/ =12.8Hz),H-17b(4.21,d,/=12.8Hz),H-18(2.14,s),H-20(2.86,d,/=3.1Hz),H-21a(3.74, (Μ，/=12·4,3·1Ηz)，Η-21?3(4·06，(1，/=12·4Ηζ)，Νι-Μ θ(3·66,8)，Ν4-Μθ(2·28,8);核磁共振碳 譜數(shù)據(jù)3。（口口111，〇0(：13，1251!^) :134.8((：，2-〇,53.7(〇1，3-〇,63.4((：!1，5-〇,23.9(〇12,6-C)，107.7(C，7-C)，128.6(C，8-C)，119.8(CH，9-C)，120.7(CH，10-C)，122.9(CH，n-C)， 109.4(CH，12-C)，132.1(C，13-C)，32.9(CH2，14-C)，126.8(C，15-C)，131.3(C，16-C)，64.5 (CH2，17-C)，28.6(CH 3，18-C)，207.4(C，19-C)，50.2(CH，20-C)，66.7(CH2,21-C)，29.3(CH 3， Ni-MehAUdA-Me)。紅外波譜中在1720CHT1尖銳吸收峰是由該化合物中的羰基產(chǎn)生； 且UV譜圖表明在228nm與286nm有紫外吸收，顯示該化合物含有吲哚發(fā)色基團(tuán)。 1H-NMR譜顯 示一組無取代吲哚片段的質(zhì)子信號 <8-9 7.49(lH，dJ=8.2Hz)、<8-?ο 7.13(lH，tdJ=8.2， 1·3Ηζ)、丨11 7.23(1!1汀(1，/=8.2，1.3抱）與丨12 7.31(1!1，(1，/=8.2抱）；兩個1013質(zhì)子信號<? !13.66(3!1，8，沁-]\^)與2.28(3H，s，N4_Me) ;兩組移向低場的連氧亞甲基質(zhì)子信號(g-17a4.34 (lH，d，/=12·8Ηζ)與 <8-m4.21(lH，d，/=12·8Ηζ)以及 <8-21a3.74(lH，ddJ=12.4,3.1Hz)與 <8-2ib4.06(lH，d，7=12·4Ηζ) ;兩組亞甲基質(zhì)子信號 <8-6a 3.38(lH，ddJ=16.1，6.9Hz)與 兩-乩2.63(1!1，(1，7=16.1?。┮约埃?- 1432.73(1!1，(1，7=13.2泡）與（8-1仙1.82(1!1，(1，7= 13.2Hz )。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有21個碳信號，包括三個甲基，四個亞甲基，七個次 甲基，以及七個季碳；以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為五環(huán)結(jié)構(gòu)。13C-NMR譜與 DEPT譜顯示該化合物中存在甲基酮結(jié)構(gòu)片段f19 207.4(C)與f18 28.6(CH3)，吲哚結(jié)構(gòu)片 段 2 134.8(C)、7 107.7(C)、8 128.6(C)、9 119.8(00、?ο 120.7(00、11 122.9(00、12 109.4(CH)與 13 132.1(C)，兩個N-甲基信號 C30.4(CH3，Ni-Me)與 C39.4(CH3，N4_Me)。另COSY與HSQC波譜數(shù)據(jù)揭示該化合物中含有-NCHCH2-結(jié)構(gòu)片段(-N4-C5-C 6-與-N4-C3-C14-)。進(jìn)一步分析 HMBC 譜，H-14a/H-14b 與 C-15/C-20、H-17a/H-17b 與 C-15/C-2UH3-18 與 C-19、H-21a/H-21b 與 C-17/C-20、H-20 與 C-19/C-21 存在相關(guān)信號，結(jié)合 13C-NMR 譜中相關(guān)碳信號暗示結(jié)構(gòu)中存在連氧六元環(huán)片段。同時，在HMBC譜中還顯示存在H-5與C-3/ C-7/C-17、H2-14與C-UAi-Me與C-2/C-13相關(guān)信號，可構(gòu)建該化合物的相關(guān)碳?xì)溥B接方式。 N0ESY譜中，H-3與H-5的相關(guān)信號表明兩者構(gòu)型一致；同時，H-20與H-14a/ H-21a的相關(guān)信 號表明H-20為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)， 可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一 致。
[0020]
[0021] 實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 一、材料和儀器 人腎癌RC-2細(xì)胞株購于ATCC細(xì)胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。 重水(D20)購于青島騰龍微波科技有限公司。Tris、SDS、30%丙烯酰胺單體、Tween20購于重 慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所實驗室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus離心 超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購于Millipore 公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學(xué)儀器廠。5XSDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖 液、BeyoECL熒光檢測試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250購于碧云天生物技術(shù)研究所。 化合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人HSP70單克隆抗體、兔抗人ICAM-1單克隆 抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武漢博士德生物 有限公司。
[0022] 超凈工作臺（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司），自動平衡離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器 廠），光學(xué)顯微鏡(NIKON，日本），透射電子顯微鏡(LeicaTCS-NT，德國），低溫高速離心機(jī)（日 立公司，日本），低溫超高速離心機(jī)H-80B(日立公司，日本）。垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽(北京六一 廠，中國）。臺式高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國）。96孔培養(yǎng)板(Corning公 司，美國）。凝膠儀、PCR擴(kuò)增儀(BI0-RAD，美國）。
[0023]二、試驗方法 1、MTT檢測化合物（I)不同濃度48h對腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含有0.1%青霉素、鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)人腎癌細(xì)胞 株RC-2，根據(jù)細(xì)胞生長密度1~2天換液一次，3天傳代一次。取對數(shù)期生長細(xì)胞，按照如下步 驟操作：（1)接種細(xì)胞：胰酶消化對數(shù)生長期的腎癌RC-2細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液lmL制成單細(xì)胞懸液，混勻后用移液管按照體積100μL孔，即接種腎癌細(xì)胞數(shù)目 5 X 103個/孔，加入96孔培養(yǎng)板中。每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔；（2)培養(yǎng)細(xì)胞:將培養(yǎng)板小心置入 孵箱中（37 °C、5%C02)培養(yǎng)3天；（3)處理細(xì)胞：分別按空白組（加5yL DMS0液）、0.25、0.5、 0.75、lymol/L化合物（I)處理組分組后加藥處理48h; (4)顯色:在各個時間點，予以每孔各 加入MTT溶液20yL，之后繼續(xù)放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔內(nèi)培養(yǎng)液用注射器吸去；對 于當(dāng)天接種的細(xì)胞而言，離心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后將孔內(nèi)培養(yǎng)液移除。之后把150yL DMS0加入每孔，使其充分振蕩10min后，把結(jié)晶物溶解完全；（5)比色：在全自動酶標(biāo)儀上檢 測各孔在580nm波長下的光密度值[(D580)]，按公式測定細(xì)胞活力:D(580)實驗孔/D(580) 對照孔X 100%。
[0024] 2、MTT檢測0.5μΜ化合物（I)不同時間對腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響 接種和處理細(xì)胞及顯色和比色步驟同上（1)、（2)、（4)、（5)，處理細(xì)胞:分別按空白組 (加5yL DMS0液）、0·5μΜ化合物（I)處理24h、48h、72h分組。
[0025] 3、制備 exosomes (1)細(xì)胞分組:取6份細(xì)胞計數(shù)相近的人腎癌RC-2細(xì)胞株體外常規(guī)培養(yǎng)，其中三份為對 照組(CE)，另外三份為實驗組(CE2)，等細(xì)胞呈對數(shù)生長時，兩組細(xì)胞株按照3 X 106/100mL 重新傳代至新的培養(yǎng)瓶，嚴(yán)格控制每組細(xì)胞培養(yǎng)基的體積一致;在實驗組，等細(xì)胞培養(yǎng)48h 后加入0.5μΜ的化合物（I)處理細(xì)胞48h，之后收集培養(yǎng)上清液各150 mL;對照組不加藥物， 加入與實驗組等量的DMS0,48h后收集培養(yǎng)上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提取 exosomes:培養(yǎng)上清液150mL，300g低溫離心（4°C )10min去除細(xì)胞;800g低溫離心30min獲取 上清10000g低溫離心30min獲取上清通過100kD MW⑶Centriplus離心超濾管濃縮超濾 (MWC0:分子量截留），以1000g離心30min，得到約20mL超濾液。將超濾液分別移至2mL含30g/ L的蔗糖重水墊的10mL的離心管中，100000g低溫超速離心lh。收集離心管底部的緩沖墊用 PBS稀釋，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超濾離心管中1000g離心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι濾膜過濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆迷O(shè)置對照組細(xì)胞(CE1)來源的exosomes為 EX1 組 exosomes，實驗組細(xì)胞(CE2)來源的 exosomes 為EX2 組 exosomes。
[0026] 4、BCA法檢測exosomes蛋白含量 (1)測定方法:取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取l〇yL樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200yL，輕搖，于37 °C保溫30min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清白蛋白含 量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對照，根據(jù)樣品的吸光 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)濃度；（2)計算方法:exosome濃縮液總蛋白質(zhì)含量(mg)= 濃縮后的總體積X BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。重復(fù)6次實驗，取平均值做統(tǒng)計學(xué)分析。
[0027] 5、統(tǒng)計學(xué)方法 使用軟件GRAGHPAD PRISM 5.0進(jìn)行圖表制作及統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以X ±s表示， 比較組間差異使用方差分析或t檢驗。
[0028]三、結(jié)果及結(jié)論 1、MTT顯示不同濃度化合物（I)作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化 MTT結(jié)果顯示當(dāng)化合物（I)濃度0.75μΜ作用細(xì)胞時，細(xì)胞活力(71.32 ± 4.68%)與化合物 (1)濃度0.5以1及0.25以1作用細(xì)胞時細(xì)胞組（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比，差異具有 統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈〇.〇5)。
[0029] 2、ΜΤΤ顯示0.5μΜ化合物（I)不同時間作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化 11'1'結(jié)果顯示當(dāng)0.5以]?化合物（1)作用細(xì)胞7211組(71.34±1.64%)與作用4811組(91.04± 6 · 23%)、24h組(94· 56± 1 · 13%)對比，細(xì)胞活力差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0 · 05)。
[0030] 3、Exosomes計數(shù)和蛋白定量 電鏡下實驗組(EX2)和對照組(EXl)exosomes計數(shù)和exosomes蛋白定量結(jié)果:經(jīng)化合物 (I)處理后，RC-2細(xì)胞產(chǎn)生的exosomes數(shù)量和exosome蛋白含量較未經(jīng)藥物處理組都明顯增 加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈〇. 05)。結(jié)果見表1。
[0031]結(jié)果說明，化合物（I)能夠抑制腎癌細(xì)胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時間依賴 性。經(jīng)化合物（I)處理后，透射電鏡觀察腎癌細(xì)胞株RC-12源性exosomes形態(tài)未見明顯改變， 其分泌量和蛋白含量較處理前明顯增加(P<〇. 05)，這些說明化合物（I)對腎癌細(xì)胞株RC-12的抑制作用與化合物（I)引起的腎癌細(xì)胞RC-2表達(dá)野生型p53mRNA上調(diào)有關(guān)。
[0032] 表1實驗組和對照組分泌exosomes數(shù)量及蛋白含量對比
實施例3 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或 甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例 加入賦形劑，制粒壓片。
[0033] 實施例4 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或 甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
[0034] 實施例5 膠囊劑或顆粒劑的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比 為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0035] 實施例6 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸 或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封 滅菌制成注射液。
[0036] 實施例7 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪 拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉 針劑。
[0037] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將延胡 索的干燥塊根粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、 乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用75% 乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟(b)中 75%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、55:1、35:1、15:1和1:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積 比為20:1、15:1和10:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八 烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為80%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用85%乙醇熱 回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于:該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化 合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P13/12GK105906645SQ201610320548
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐珍
【申請人】蘇州畢諾佳醫(yī)藥技術(shù)有限公司