羅丹明酰肼衍生物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了羅丹明酰肼衍生物及其制備方法和應(yīng)用，羅丹明酰肼衍生物由羅丹明酰肼與對羥基苯乙酮在乙醇溶液中通過席夫堿縮合反應(yīng)制得，該化合物在pH 2?5范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度具有很好的線性關(guān)系，因此可以作為pH響應(yīng)熒光探針，并用于篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，如高產(chǎn)聚蘋果酸菌株，利用該方法篩選高產(chǎn)菌株具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，快速和高通量等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
羅丹明酰肼衍生物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種羅丹明酰肼衍生物，還涉及羅丹明酰肼衍生 物的制備方法和在pH響應(yīng)熒光探針中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚蘋果酸（Polymalic acid，PMA)由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)發(fā)酵 生產(chǎn)的一種新型高分子聚合物，以L-蘋果酸為唯一單體在體內(nèi)聚合而成，聚蘋果酸具有高 度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，在藥物載體、組織工程、食 品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。
[0003] 當(dāng)前，由于聚蘋果酸菌株產(chǎn)酸能力低下，一直制約其工業(yè)化生產(chǎn)，因此采用篩選經(jīng) 過誘變或代謝工程改造的高產(chǎn)聚蘋果酸菌株是當(dāng)務(wù)之急。如喬長晟等報(bào)道(一種大量產(chǎn)生 聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培養(yǎng)方法，授權(quán)專利號200910071018.X)， 在含碳酸鈣的固體平板上通過透明圈大小篩選紫外復(fù)合誘變的聚蘋果酸高產(chǎn)菌株，但該方 法準(zhǔn)確度低，透明圈不易觀察，初篩會導(dǎo)致大量高產(chǎn)菌株丟失。因此，亟需一種靈敏和準(zhǔn)確 度高、快速、高通量篩選高產(chǎn)聚蘋果酸的探針或方法，用于快速、準(zhǔn)確篩選經(jīng)物理、化學(xué)方法 誘變或代謝工程改造的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于避免高產(chǎn)菌株篩選過程中隨機(jī)盲目、工作量大等技 術(shù)缺陷，合成一種在pH值2~5范圍內(nèi)敏感的熒光探針，具體技術(shù)方案如下：
[0005] 羅丹明酰肼衍生物，化學(xué)名：（E)-3'，6'_雙(二甲氨基)-2-((1-(4-羥基苯基)亞乙 基)氨基)螺[異二氫吲哚_1，9'_咕噸]-3-酮，其結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0006]
[0007] 本發(fā)明還提供了羅丹明酰肼衍生物的制備方法，具體如下：以羅丹明酰肼與對羥 基苯乙酮為原料，以乙醇作為溶劑，通過席夫堿縮合反應(yīng)得羅丹明酰肼衍生物。
[0008] 優(yōu)選的，將羅丹明酰肼與對羥基苯乙酮按摩爾比1:4溶于乙醇，加熱回流6~24h至 羅丹明酰肼反應(yīng)完全，然后除去溶劑，加水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，經(jīng)重結(jié)晶得羅丹明 酰肼衍生物。
[0009] 利用合成的羅丹明酰肼衍生物的熒光強(qiáng)度與酸性pH值響應(yīng)的良好線性關(guān)系，可以 用于制備pH響應(yīng)熒光探針，該探針用于響應(yīng)的pH范圍為2~5的測試液。菌株的產(chǎn)酸能力越 強(qiáng)，pH值越低，因此適用于篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，產(chǎn)酸可以為有機(jī)酸也可以為無機(jī)酸，由 于有機(jī)酸的pH范圍為2~4,所以更適合產(chǎn)有機(jī)酸菌株的篩選，其有機(jī)酸選自蘋果酸、富馬 酸、丁二酸、α_酮戊二酸、檸檬酸、葡萄糖酸中的一種或多種。
[0010]本發(fā)明還用于篩選高產(chǎn)聚蘋果酸菌株，利用菌株的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，pH值越低，在深 孔板中通過高通量篩選pH低的菌株，篩選獲得突變株AH-21，通過發(fā)酵驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)pH低的菌株 聚蘋果產(chǎn)量得到提高，比原始出發(fā)菌株聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量提高了 13.8%，表明利用本發(fā)明 公開的羅丹明酰肼衍生物篩選高產(chǎn)菌株具有靈敏高、準(zhǔn)確度高、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)。
[0011 ] 本發(fā)明中使用的原始出發(fā)菌為產(chǎn)聚蘋果酸菌種Aureobasidium pullulans CCTCC N0:M2012223,或者來源于美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心（NRRL)，美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)等機(jī)構(gòu)保藏或自然分離產(chǎn)聚蘋果酸的 Aureobasidium屬或 Physarum 菌種。
[0012] 本發(fā)明中，ARTP是常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma)的簡稱，能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子(包括處于激 發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、0H自由基等)濃度的等離子體射流。本發(fā)明使用ARTP技術(shù)誘 變出芽短梗霉菌株，具體誘變參數(shù)為:處理功率50-200W，氦氣氣流量5-30SLM，處理距離0-10mm，誘變時(shí)間10-120S。稀釋后，均勻涂布于YH)平板上，產(chǎn)生大量突變株。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明合成了新的羅丹明酰肼衍生物，熒光強(qiáng)度在pH值 2-5范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，可以作為pH響應(yīng)熒光探針，由于菌株的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，pH值 越低，因此可以通過羅丹明酰肼衍生物熒光強(qiáng)度間接的反映出菌株的產(chǎn)酸能力。結(jié)合高通 量篩選裝置，可快速篩選得到高產(chǎn)的正突變株。利用本發(fā)明提供的篩選方法，相比傳統(tǒng)的溴 甲酚綠變色圈顯色法等篩選方法，篩選準(zhǔn)確度大幅度提高，并減少工作量，提高了篩選效 率，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0015] 圖1為熒光探針L的合成路線圖。
[0016]圖2為探針L熒光強(qiáng)度與pH值響應(yīng)關(guān)系。
[0017] 圖3為部分突變株的焚光強(qiáng)度和pH值變化結(jié)果(Xex = 563nm)〇
[0018] 圖4為5L發(fā)酵罐突變株AH-21發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果（?表示出發(fā)菌株CCTCC M2012223聚蘋 果酸含量；?表示突變株AH-21聚蘋果酸產(chǎn)量；Λ表示出發(fā)菌株CCTCC M2012223菌體生物 量；▲表示突變株ΑΗ-21菌體生物量；□表示出發(fā)菌株CCTCC Μ2012223葡萄糖濃度；表示 變株AH-21葡萄糖濃度）。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0020] 實(shí)施例1、羅丹明酰肼衍生物熒光探針的合成
[0021] 羅丹明酰肼衍生物熒光探針的合成，包括如下步驟：
[0022] (1)羅丹明酰肼的合成:取1.5g羅丹明B溶于100mL乙醇中，常溫（18~25°C)攪拌滴 加5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的水合肼;加熱回流12~48h，然后將反應(yīng)液濃縮至反應(yīng)液總體積的 八分之一，靜置過夜;次日抽濾白色沉淀、烘干，收集得到羅丹明酰肼；
[0023] (2)取步驟（1)所得的羅丹明酰肼0.1688(0.37111111〇1)和對羥基苯乙酮0.201 8 (1.48mmol)溶于10~100mL乙醇中，加熱回流6~24h至羅丹明酰肼反應(yīng)完全(TLC檢測羅丹 明酰肼反應(yīng)是否完全），然后在真空狀態(tài)下加熱除去溶劑，加入5~50mL水后，用20~100mL 乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取三次后從乙酸乙酯中重結(jié)晶得到羅丹明酰肼衍生物熒光探針，化 學(xué)名為：（E)-3'，6'_雙(二甲氨基)-2-((1-(4-羥基苯基)亞乙基)氨基）螺[異二氫吲哚-1， 9 咕噸]_3_酮，簡稱為探針L，總反應(yīng)路線如圖1。
[0024] 本實(shí)施例重結(jié)晶得到探針1^0.1428，產(chǎn)率為84.5%。
[0025] 以DMS0為溶劑，配制濃度為50μΜ的探針L溶液，然后在pH值為1.82、2.25、2.98、 3.52、4.07、4.65、5.47和6.23的緩沖液中，以激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為563nm和580nm檢 測熒光探針L在不同pH條件下熒光強(qiáng)度(v/v = l:l)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，合成的探針 L在pH在2~5范圍內(nèi)，具有很好的線性范圍(R2 = 0.9951 )，可以作為pH值在2~5范圍內(nèi)的pH 響應(yīng)熒光探針。由于產(chǎn)酸類菌株的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，pH值越低，由此可以通過熒光強(qiáng)度間接的 反應(yīng)出菌株的產(chǎn)酸能力，結(jié)合高通量篩選裝置(深孔板），可快速篩選得到高產(chǎn)菌株。由于有 機(jī)酸屬于弱酸，pH值通常在2~4范圍內(nèi)，因此合成的探針L特別適用于高產(chǎn)有機(jī)酸菌株篩 選，如蘋果酸、富馬酸、丁二酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、葡萄糖酸等的菌株。
[0026]實(shí)施例2、利用探針L篩選高產(chǎn)聚蘋果酸菌株
[0027] 首先，構(gòu)建聚蘋果酸菌株突變庫：以出芽短梗霉以.？1111111&1^)〇^〇：12012223為 出發(fā)菌株，搖瓶培養(yǎng)48h后，玻璃珠打碎制備單細(xì)胞懸液，采用常壓室溫等離子體 (Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)技術(shù)誘變菌株，具體誘變參數(shù)為：處 理功率120W，氦氣氣流量10SLM，處理距離2mm，誘變時(shí)間50s;稀釋后，均勻涂布于YPD平板 上，產(chǎn)生大量突變株。
[0028]然后，利用探針L篩選高產(chǎn)聚蘋果酸菌株，將ARPT所有的突變株接種于含2mL種子 培養(yǎng)基的48孔深孔板中25°C培養(yǎng)48h后，然后取200yL種子液移種至含2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的48 孔深孔板中培養(yǎng)48h。深孔板離心，取100yL上清液到96孔板，然后加入溶劑為DMSA、濃度為 50μΜ的100yL探針L溶液混勻，利用多功能酶標(biāo)儀(Tecan Infinite 200PR0)，在激發(fā)波長和 發(fā)射波長分別為563nm和580nm檢測其熒光強(qiáng)度，部分菌株的熒光強(qiáng)度如圖3所示。結(jié)果顯 示，AH-21熒光強(qiáng)度最高，pH值最低，預(yù)測該菌株的聚蘋果酸產(chǎn)量最高。
[0029] 本實(shí)施例中，所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L、KH2P〇4 0.05g/L、NH4N03 2g/L、ZnS〇4 0.05g/L、MgS〇4 0.05g/L、玉米漿lg/L和CaC03 20g/L。
[0030] 實(shí)施例3、發(fā)酵驗(yàn)證
[0031] 采用5L發(fā)酵罐工藝，發(fā)酵配方為葡萄糖90g/L、氯化銨2g/L、KH2P〇4 0.2g/L、ZnS〇4 0· 15g/L、MgS〇4 0·2g/L，在發(fā)酵罐通氣比（1:1，v/v)以上，攪拌轉(zhuǎn)速400~700rpm，將突變株 AH-21與原始出發(fā)菌株CCTCC M2012223進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為76小時(shí)，然后檢測聚蘋果酸產(chǎn) 量，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，突變株AH-21產(chǎn)聚蘋果酸42g/L，比出發(fā)菌株CCTCC M2012223 提高了 13.8%。結(jié)果表明，通過熒光探針篩選到的高產(chǎn)菌株經(jīng)發(fā)酵后聚蘋果酸產(chǎn)量也得到 提高，因此可以通過利用探針L作為pH響應(yīng)熒光探針能夠篩選得到高產(chǎn)聚蘋果酸的菌株。 [0032]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 羅丹明酷阱衍生物，其特佈在于:其結(jié)構(gòu)化式I所示：2. 權(quán)利要求1所述羅丹明酷阱衍生物的制備方法，其特征在于：W羅丹明酷阱與對徑基 苯乙酬為原料，W乙醇作為溶劑，通過席夫堿縮合反應(yīng)得羅丹明酷阱衍生物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述羅丹明酷阱衍生物的制備方法，其特征在于，將羅丹明酷阱與對 徑基苯乙酬按摩爾比1:4溶于乙醇，加熱回流6~2地至羅丹明酷阱反應(yīng)完全，然后除去溶 劑，加水溶解，然后用乙酸乙醋萃取，經(jīng)重結(jié)晶得羅丹明酷阱衍生物。4. 權(quán)利要求1所述羅丹明酷阱衍生物在制備P剛向應(yīng)巧光探針中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述pH響應(yīng)巧光探針響應(yīng)的pH范圍為2~ 5。6. 權(quán)利要求1所述羅丹明酷阱衍生物作為pH響應(yīng)巧光探針篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述酸為有機(jī)酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述有機(jī)酸為蘋果酸、富馬酸、下二酸、a- 酬戊二酸、巧樣酸、葡萄糖酸。9. 權(quán)利要求1所述羅丹明酷阱衍生物作為pH響應(yīng)巧光探針篩選高產(chǎn)聚蘋果酸菌株中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C09K11/06GK105906642SQ201610278567
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】鄒祥, 李虹慶, 左華, 李天夫
【申請人】西南大學(xué)