一種近紅外gsh熒光探針的制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種近紅外GSH熒光探針的制備方法和應用，該熒光探針的結構式為：。一方面，用費舍爾氏醛來增加羅丹明的波長，使波長延長到750 nm；另一方面，利用分析物的SH與探針的醛基之間發(fā)生加成?水解反應，實現(xiàn)GSH與Cys、Hcy的區(qū)分。這是第一個基于羅丹明衍生物的能將GSH與Cys及Hcy高效區(qū)分的近紅外熒光探針，該探針對GSH表現(xiàn)出很高的靈敏度。而且，當pH值在6.0到8.0之間時，不影響熒光探針對GSH的測定，該熒光探針與GSH響應迅速，且該探針不受其他生物硫醇（Cys，Hcy）以及其它19種氨基酸的干擾，表現(xiàn)出很好的選擇性。最重要的是，該探針還可以應用于生物成像，檢測細胞內(nèi)及組織中的GSH。
【專利說明】
一種近紅外GSH熒光探針的制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于熒光探針技術領域，具體涉及一種近紅外GSH熒光探針的制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及同型半胱氨酸(Hey)統(tǒng)稱為生物硫醇，它們在 許多生理和病理過程中都發(fā)揮著重要的作用（文獻1: Shang，L. ; Qin，C. J. ; Wang，T. ; Wang， M. ;Wang，L.X. ;Dong，S.J.J.Phys.Chem.C.2007, 111 ,13414-13417·)。在細胞內(nèi)，GSH是這三 者中含量最豐富的，含量為1.〇-15111]\1(文獻2:!^88311，5.5.]\1. ;1^(^1^七2， G. A.Anal.Chem. 1982,54,1972-1976.)。研究表明，谷胱甘肽的水平異常與許多疾病有關， 包括癌癥，肝損傷，艾滋病，老年癡呆癥，以及疾病所造成的老化（文獻3^^^1 &，入1.; Ortega，A. ;0brador，E· Crit ·Rev· Clin ·Lab · Sci · 2006，43，143-181 ·文獻4 :Herzenberg， L.A.；De Rosa,S.C.；Dubs,J.G.；Roederer,M.；Anderson,M.T.；Ela,S.ff.；Deresinski , S.C. ;Herzenberg，L.A.Proc .Natl .Acad. Sc i.U.S. A. 1997，94,1967-1972.文獻 5: Banerjee，S.;Kar，S·;Perez，J.M.;Santra，S.J.Phys·Chem.C.2009，113，9659_9663·)〇因 此，設計一種有效檢測谷胱甘肽的方法，以便更好地了解其生理和病理功能，是具有重要意 義的。
[0003] 由于對檢測谷胱甘肽含量的需求越來越大，一些基于不同熒光團的熒光探針已經(jīng) 被合成，例如氟硼吡咯（文獻6:Li，X. ;Qian，S.J. ;He，Q.J. ;Yang，B. ;Li，J. ;Hu， Y.Z.Org.Biomol .Chem. 2010,8,3627-3630 ·)、香豆素類（文獻7 :Kim，G.J. ;Lee，K. ;Kwon， H. ;Kim，H. J.Org.Lett. 2011,13,2799-2801·)、方酸類（文獻8: Sreejith，S. ;Divya，K.P.; Ajayaghosh，A· Angew. Chem. 2008，120，8001 - 8005 ·)、花青素類（文獻9 :Niu，L· Y. ;Guan， Y.X. ;Chen，Y.Z. ;Wu，L.Z. ;Tung，C.H. ;Q.Z.Yang，Chem.Soc.Rev.2015,44,6143-6160)W& 焚光素類（文獻10:Chen，X. ;Ko，S·Κ· ;Kim，M. J. ; Shin，I · ; Yoon，J. Chem.Commun· 2010,46， 2751-2753.)等。我們注意到，盡管這些熒光探針對谷胱甘肽的檢測有著重要的意義，但他 們的缺點仍然存在。他們主要存在兩方面的問題，一方面，由于GSH、Cys和Hey結構上非常相 似，因此區(qū)分GSH、Cys和Hey是很困難的。另一方面，一般探針的發(fā)射波長都是在可見光區(qū) 域，這將阻礙探針在生物系統(tǒng)中的應用。因此，設計和合成一個近紅外探針且能區(qū)分GSH和 Cys/Hcy是迫在眉睫的。
[0004] 近紅外染料的波長范圍一般是在650-900nm，且在體外和體內(nèi)檢測小分子具有獨 特優(yōu)勢，如組織深層滲透，對生物樣品小的光損傷，背景熒光少，從而在生物體內(nèi)檢測小分 子時產(chǎn)生的干擾?。ㄎ墨I11:丫皿11，1^;1^11，￥.￥.;211&〇,5. ;6&〇，15.;〇1611，8.;!^，1^1; Zhu，S.S.J.Am.Chem.Soc. 2012,134,13510-13523·)。因此，到目前為止，已經(jīng)有少量的近紅 外焚光探針已被設計并用于檢測谷胱甘肽（文獻12:Yu,F. ;Li，P. ;Song,P. ;Wang,B. ;Zhao, J. ;Han，K.Chem.Comm.2012,48,4980-4982.文獻 13:Lim，S.Y. ;Hong，K.H. ;Kim，D. I. ;Kwon, H. Am.Chem. Soc. 2014,136,7018-7025 ·文獻 14:Xu，K. ;Qiang，M. ;Gao，W. ;Su, R. ;Li，N. ;Gao，Y. ;Tang，B.Chem.Sci .2013,4,1079-1086 ·文獻 15: Li, M. ;Wu，X. ;Wang，Y.; Li，Y. ;Zhu，W. ; James，T.D.Chem.Comm. 2014,50,1751-1753·)。值得我們注意的是，大多數(shù) 這些近紅外熒光探針是花菁染料。然而這些近紅外熒光探針存在著一些缺點。首先，大部分 的熒光探針具有低的熒光量子產(chǎn)率(通常遠小于0.25)。因此，由于這些探針有高背景信號 和低的熒光信號，故用于生物成像時對比度較低。其次，所報導的這些探針表現(xiàn)出較弱的熒 光變化（<25倍），所以當檢測生物體內(nèi)的谷胱甘肽時，這些探針的靈敏度往往是不夠的。因 此，設計一個能克服這些缺陷的并用于檢測谷胱甘肽的近紅外熒光探針是很重要的。
[0005] 近日，羅丹明染料由于其優(yōu)良的光譜性能如高的熒光量子產(chǎn)率、低的背景熒光而 備受關注（文獻16:Bei ja，M. ;Afonso，C·Α·Μ· ;Martinho，J.M.G· Chem. Soc ·Rev· 2009，38， 2410-2433)。此外，羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結構是沒有熒光的，而由檢測物引起的內(nèi)酰胺結 構開環(huán)會產(chǎn)生強烈的熒光發(fā)射。到目前為止，大部分羅丹明類熒光探針都用來檢測金屬陽 17:Zhao,Y.；Zhang,X.B.；Han,Z.X.；Qiao,L.；Li,C.Y.；Jian,L.X.；Shen,G.L.； Yu，R.Q.Anal ·Chem. 2009,81,7022-7030·文獻 18:Du，J.;Fan, J. ;Peng，X. ;Sun，P· ;Wang， J. ;Li，H. ;Sun,S.Org.Lett.2010,12,476-479)。然而，報道過的羅丹明類探針很少有用來 檢測谷胱甘肽的。此外，羅丹明類熒光探針的吸收和發(fā)射只在可見光區(qū)域(500-600nm)，這 限制了它們在生物成像中的應用。因此，使羅丹明類熒光探針的吸收和發(fā)射延長到近紅外 區(qū)是非常有必要的。
[0006] 本文利用羅丹明類染料具有高量子產(chǎn)率、低背景以及開關型的結構的優(yōu)點，同時 還利用了花菁染料長波長(發(fā)射峰在近紅外區(qū)）的優(yōu)點，設計并合成了一種基于羅丹明衍生 物的近紅外熒光探針，此探針具有高量子產(chǎn)率（Φ =0.432)，并用于檢測谷胱甘肽。一方面， 用費舍爾氏醛來延長波長，使之延長到750nm;另一方面，利用分析物的SH與探針的醛基之 間發(fā)生水解-加成反應，實現(xiàn)谷胱甘肽與半胱氨酸、同型半胱氨酸的區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供了一種近紅外GSH的熒光探針，該熒光探針具有長波長(在近 紅外區(qū)）、高熒光量子產(chǎn)率（Φ =0.432)、高靈敏度以及高選擇性的檢測GSH，并能夠應用于 活細胞和組織中的熒光成像。
[0008]本發(fā)明的技術方案是，一種近紅外GSH焚光探針，其結構式如下：
[0009]
[0010] 本發(fā)明的熒
光探針應用于GSH的檢測，其特征在于探針本身處于閉環(huán)狀態(tài)沒有熒 光，探針與GSH反應后螺環(huán)打開，從而導致熒光改變。
[0011] 所述的一種基于近紅外GSH熒光探針的制備方法。步驟如下：
[0012] 化合物1的合成:將環(huán)己酮逐滴加入到冷卻至0°C的濃硫酸中，隨后加入2-((4-二 乙氨基)-2_羥基苯甲酰基)苯甲酸，磁力攪拌回流1.5小時，停止反應;反應混合物冷卻至室 溫后，在攪拌下將反應混合物倒入盛有冰水的燒杯中，隨即加入70%高氯酸，立即產(chǎn)生大量 紅色沉淀。抽濾，用冰水洗滌固體，干燥后得到紅色的固體化合物1，其中環(huán)己酮和2-( (4-二 乙氨基)-2_羥基苯甲?；?苯甲酸的摩爾比為2:1。
[0013]化合物2的合成:將化合物1和費舍爾氏醛溶解在無水醋酸中，在氮氣保護下，磁力 攪拌回流1.5小時，加水停止反應，減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(CH2C12 和CH2C12/C2H50H = 200:1到20:1，V/V)得綠色固體(化合物2)，其中化合物1和費舍爾氏醛的 摩爾比為1:1.05。
[0014]化合物3的合成：將化合物2溶解在CH2C12中，攪拌下加入80%水合肼和卡特縮合 劑。在室溫下，磁力攪拌1.5小時;減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(CH2C12和 CH2C12/C2H50H = 200:1到20:1，V/V)得黃色固體(化合物3)，其中化合物2、80%水合肼和卡 特縮合劑的摩爾比為1:10:1.05。
[0015]熒光探針NIR-Rh的合成：將化合物3和乙二醛溶解在無水甲醇中攪拌。在室溫下， 磁力攪拌12小時；減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(CH2C12和CH2C1 2/C2H50H = 200:1到20:1，V/V)得淡黃色固體，為目標產(chǎn)物(化合物NIR-Rh)，其中化合物3和乙二醛的 摩爾比為1:2。制備反應式如下：
[0016]
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的近紅外熒光探針在GSH存在下熒光發(fā)生顯著變化， 熒光量子產(chǎn)率為0.432，可以用于高靈敏度的檢測GSH。該熒光探針的檢測范圍為0.5~25μ Μ，檢測限為0.15μΜ。其次，該近紅外熒光探針的檢測環(huán)境為生理范圍內(nèi)的ρΗ = 6-8。同時，該 熒光探針對GSH的響應迅速，響應時間在3min以內(nèi)。該近紅外熒光探針對GSH表現(xiàn)出很好的 選擇性，不受其它生物硫醇(^78，扮^)及其它氨基酸(413，116，1^11，]^1：，？116，？1'0，1'印，'\%1， Asn，Gln，Gly，361'，1111'，丁5^，八坪，]^8，1^8，八8卩，6111)的影響。
[0018] 本發(fā)明的近紅外探針不僅能檢測溶液中的GSH，還可應用于生物成像，檢測細胞內(nèi) 和組織中的GSH含量，這對于深入研究GSH在生物體內(nèi)生理和病理過程的動力學機理具有重 要意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1為焚光探針與不同濃度的GSH作用后的熒光光譜圖。
[0020] 橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。熒光探針的濃度均為ΙΟμΜ，GSH濃度分別為:0， 0·5,2·0,4·0,6·0,8·0,10.0,12.0,14.0,16.0,18·0,20·0,22·0,25·0μΜ。熒光激發(fā)波長為 690nm。插圖為探針對GSH濃度的線性響應圖。
[0021]圖2為熒光探針與GSH的作用機理圖。
[0022]圖3為熒光探針與GSH作用后的紫外可見吸收光譜圖。
[0023] 橫坐標為波長，縱坐標為吸光度。熒光探針的濃度均為100yM，GSH濃度分別為0， 0·5，1·0，1·5,2·0,3·0,4·0,6·0,7·0,9·0，10·0μΜ〇
[0024]圖4為pH對熒光探針的影響圖。
[0025]圖5為熒光探針在不同GSH濃度(2，4，8，12μΜ)下，熒光強度隨時間變化的關系曲線 圖。
[0026] 圖6為熒光探針的選擇性圖。Fo和F表示探針溶液加入GSH前后的熒光強度。黑色柱 表示探針溶液在空白或加入各種生物硫醇或氨基酸后的熒光變化情況，白色柱表示探針溶 液在加入GSH后，又加入各種生物硫醇或氨基酸的熒光變化情況。
[0027] 圖7為細胞毒性試驗。橫坐標為熒光探針的濃度，縱坐標為細胞的存活率。
[0028]圖8為GSH的細胞成像圖。
[0029] 圖9為GSH的組織成像圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不限于此。
[0031] 實施例1:
[0032] 熒光探針的合成
[0033] 化合物1的合成：將環(huán)己酮（6.4mmol，0.66mL)逐滴加入到冷卻至0°C的濃硫酸 (7.0mL)中，隨后加入2-( (4-二乙氨基)-2_羥基苯甲?；?苯甲酸(3.2mmol，1.003g)，磁力 攪拌回流1.5小時，停止反應;反應混合物冷卻至室溫后，在攪拌下將反應混合物倒入盛有 50g冰水的燒杯中，隨即加入0.7mL 70 %高氯酸，立即產(chǎn)生大量紅色沉淀。抽濾，干燥后得到 紅色的固體化合物1，產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應。1H NMR(400MHz，⑶C13) δ 8.30(d ,J = 8.0Hz,lH) ,7.78(t ,J = 7.2Hz 1H), 7.69(t ,J = 7.6Hz 1H), 7.22(d ,J = 7.5Hz , 1H),7.06-7.13(q,2H),6.89(s,lH),3.61-3.66(q,4H),3.07-3.18(m,2H),2.29-2.31(m, 2H),1.99(s,2H),1.79(s,2H),1.34(t,J=6.6Hz,6H).MS(T0F)m/z 376.2.
[0034] 化合物2的合成:將化合物1 (4.2mmo l，1.58g)和費舍爾氏醛(4.4mmo 1，0.88g)溶解 在25 . OmL無水醋酸中，在氮氣保護下，磁力攪拌回流1.5小時，往反應混合物中加入25. OmL 水淬滅反應，減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離（CH2C12和CH2C1 2/C2H50H = 200:1 到20:1，V/V)得綠色固體(化合物2)(0.59g,產(chǎn)率:25%)</H NMR(400MHz，CDC13)S8.51 (d，J= 12·0Hz，lH)，8.19(d，J = 8.0Hz，lH)，7.93(d，J = 7.6Hz，lH)，7.55-7.62(m，3H) ,7.16 (s,lH),7.06(q,2H) ,6.48-6.60(m, 3H), 5.92(d ,J = 8.0Hz , 1H), 3.57(s , 3H), 3.48(q,4H), 2.59(t,J = 8.0Hz,2H),2.45(t,J = 8.0Hz,2H),1.76(8H) ,1.13(t,J = 8.0Hz,6H) .MS(TOF) m/z 559.4.
[0035] 化合物3的合成:將化合物2(0.76mmol，0.55g)溶解在CH2C1 2中，攪拌下加入化合物 水合肼(7.6mmo 1，0.5ml)和卡特縮合劑(0.80mmo 1，0.36g)。在室溫下，反應混合物1.5小時； 減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(CH2C1 2和CH2C12/C2H50H=200:1到20:1，V/ V)得黃色固體(化合物3)(0.32g,產(chǎn)率:74%) </H NMR(400MHz,αχη3)δ7.81((1, J = 8.8Hz, 1H) ,7.34-7.43(m,3H) ,7.07-7.13(m,3H),6.76(d ,J = 7.2Hz,lH) ,6.54(d ,J = 7.6Hz , 1H), 6.29(d,J = 8.8Hz,2H),6.20(s,lH),5.30(d,J = 8.0Hz,lH),3.28(q,4H),3.07(s,3H) ,2.50 (2H), 1.63-1.65( 10H), 1.10(t,J = 8.0Hz,6H) ,MS(T0F)m/z 573.3.
[0036] 熒光探針NIR-Rh的合成：將化合物3(0.5mmol，0.29g)和乙二醛（1 .OOmmol, 0. 058g)溶解在25.OmL無水甲醇中攪拌。在室溫下，磁力攪拌反應混合物12小時；減壓蒸餾 除去溶劑。粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(CH 2C12和CH2C12/C2H 50H=200:1到20:1，V/V)得淡黃 色固體，得目標產(chǎn)物（化合物NIR-Rh) (0.26g，產(chǎn)率：85.8 % ).咕 NMR(400MHz，CDC13) δ9.44 (d ,J = 6.8Hz,lH),7.82(d ,J = 7.2Hz,lH),7.35-7.43(m,4H),7.08-7.13(m,3H),6.76(d ,J = 8.0Hz,lH) ,6.53(d ,J = 7.6Hz,lH) ,6.20-6.29(m, 3H), 5.29(d ,J = 8.0Hz , 1H), 3.27(q, 4H)，3.07(s，3H)，2.25(2H)，1.63-1.65(10H)，1.10(t，J = 8.0Hz，6H).13C 匪R(100MHz, CDC13):δ192·67,168.21，156.15,153.04,152.15,149.59,143.07,140.68,140.33， 134.16,132.92,131.47,129.16,128.82,128.26,125.29,124.53,123.80,122.15,121.26, 110.03,109.27,106.22,105.06,97.07,68.24,48.24,44.55,31.21,29.68,28.56,24.27, 22.19,12.51.MS(T0F)m/z 613.4. Anal.calcd. for C39H4〇N4〇3(1):C,76.44；H,6.58；N, 9.14 ;0,7.83.Found:C，76.73;H，6.43;N，9.61 ;0,7.93.結果表明，所得產(chǎn)物結構正確。 [0037] 實施例2:
[0038]熒光探針與GSH作用的溶液配制
[0039] 將一定量的熒光探針溶解在H20/Et0H(9:1，v/v)的混合溶液中，得到濃度為1.0 X ΙΟΛιοΙ · I/1探針的備用溶液。將一定量的GSH用水溶解后，轉移到500mL的容量瓶中，加水 至刻度線，得到濃度為1.0X10-Vol · L-1的GSH。將1.0X10-2mol · L-1的GSH溶液用水逐漸稀 釋，得到1.0 X 10-3-1.0 X 1〇Λιο1 · I/1的GSH水溶液。將1. OmL探針的備用溶液和1. OmL的GSH 水溶液加入到10mL的容量瓶中，用緩沖溶液定容后，得到濃度為1 .ΟΧ ΙΟΛιοΙ · I/1的熒光 探針和1.0 X 10_3-1.0 X ΙΟΛιοΙ · Γ1的GSH混合待測溶液。
[0040] 實施例3:
[0041] 熒光探針與GSH作用的熒光光譜的測定
[0042]用pH值為7.4的緩沖溶液為溶劑測定了熒光探針與GSH作用的熒光光譜，結果如圖 1。 熒光探針的濃度為l〇yM，GSH的濃度依次為0,0·5,2·0,4·0,6·0,8.0,10.0,12.0,14.0， 16.0，18.0，20.0，22.0，25. ΟμΜ，激發(fā)波長固定為690nm，發(fā)射波長范圍為720~800nm，狹縫 寬度為5. Onm/5.Onm。從圖1可以看出，加入GSH之前，熒光探針在750nm處沒有熒光發(fā)射峰。 隨著GSH的加入，在750nm處發(fā)射峰大幅度的增強，并且隨著GSH濃度的增大，探針的熒光強 度不斷增強，當加入20μΜ的GSH時，熒光強度增強至未加入GSH時的64倍。這是因為探針分子 的醛基與GSH反應生成開環(huán)的羅丹明衍生物。如圖1的插圖所示，焚光強度跟GSH的濃度呈現(xiàn) 線性關系，線性范圍是0.5~25. ΟμΜ，檢測限是0.15μΜ。所用的熒光測定儀器為Perkin Elmer LS 55熒光分光光度計。圖2為熒光探針與GSH作用的機理圖，從圖中可以看出熒光探 針與GSH發(fā)生反應后，使得螺環(huán)打開，從而導致熒光發(fā)生顯著變化。
[0043] 實施例4:
[0044] 熒光探針與GSH作用的紫外可見吸收光譜性質(zhì)的測定
[0045] 圖3為熒光探針與GSH作用后的紫外可見吸收光譜圖。從圖3中可以看出，沒有加入 GSH時，探針在698nm處幾乎沒有吸收峰，加入GSH之后，在該處的吸收峰大幅度增強。同時使 用吲哚菁綠為標準物質(zhì)，測得探針與GSH作用后的熒光量子產(chǎn)率為0.432。紫外可見吸收光 譜測定用的儀器為Perkin Elmer Lambda 25型紫外可見分光光度計。
[0046] 實施例5:
[0047] 溶液pH值對熒光探針測定GSH的熒光性質(zhì)的影響
[0048] 我們考察了pH值對熒光探針測定GSH的熒光強度的影響。我們研究的pH范圍為4.0 ~12.0,熒光探針的濃度為10yM，GSH的濃度為20μΜ。實驗結果如圖4所示，熒光探針隨著pH 的變化，熒光強度基本不變，說明pH對探針本身沒有很大的影響。然而，加入GSH之后，當pH <6,熒光探針隨著pH的降低熒光強度增大，這是因為在酸性條件下，探針發(fā)生質(zhì)子化，使得 探針的結構處于開環(huán)狀態(tài);在pH>8范圍內(nèi)，隨pH的增大，熒光強度逐漸降低。pH在6~8的范 圍內(nèi)熒光強度基本不變。綜上所述，當pH值在6.0到8.0之間時，不影響熒光探針對GSH的測 定，這非常有利于該探針用于實際樣品中GSH的測定。
[0049] 實施例6:
[0050]熒光探針與GSH作用的響應時間的測定
[00511為了研究熒光探針對GSH的響應時間，我們考察了熒光探針在不同GSH濃度下（2， 4，8，12μΜ)的熒光光譜的變化情況，其結果如圖5。從圖中可以看出，該探針對GSH的響應時 間不到3min，滿足在實際樣品中進行實時監(jiān)測時對響應時間的要求。從圖5我們還可以看 出，熒光強度一旦達到最大值后，在之后的時間里，熒光強度不再發(fā)生變化，會出現(xiàn)一個平 臺，這表明此熒光探針光穩(wěn)定性好。
[0052] 實施例7:
[0053] 熒光探針對GSH測定的選擇性
[0054] 在濃度為ΙΟμΜ的熒光探針溶液中加入GSH、CyS、Hcy及其它19種氨基酸(GSH的濃度 為20μΜ，其他的濃度均為ImM)前后的熒光強度變化。從圖6中黑色柱可以看出，除GSH外加入 其它的生物硫醇和其它19種氨基酸，熒光強度都沒有明顯的改變。盡管Asp和Glu有較小程 度的熒光增強，但這個改變幾乎可以忽略。而相同的條件下加入GSH，在750nm處出現(xiàn)一個很 強的熒光發(fā)射峰。另外，我們也探究了在GSH存在的條件下，其它對探針NIR-Rh的熒光測定 的影響，如圖6白色柱所示，探針幾乎不受其它生物硫醇和氨基酸存在的干擾。F〇和F表示探 針溶液加入GSH前后的熒光強度。這些現(xiàn)象表現(xiàn)探針NIR-Rh對GSH的測定表現(xiàn)出良好的選擇 性。
[0055] 實施例8:
[0056]熒光探針在活細胞中的應用
[0057] 首先，我們做了細胞毒性試驗，如圖7所示，當加入0~20μΜ GSH探針，20min之后， 細胞的成活率均在97%以上，因此可以說明，該熒光探針可應用于檢測活細胞內(nèi)的GSH，并 且毒性較小。
[0058] 一般情況下，細胞內(nèi)的GSH含量非常豐富，因此直接向細胞內(nèi)加入探針，也能檢測 到強的紅色熒光信號，如圖8a所示。但是，當在加入探針之前加入一定量的硫醇抑制劑NEM 時，如圖8b所示，細胞內(nèi)沒有熒光信號。然而當再向此細胞中加入GSH時，檢測到細胞內(nèi)又出 現(xiàn)了很強的紅色熒光信號（圖8c)。而加入Cys與Hey時，細胞內(nèi)沒有熒光（圖8d和8e)。因此可 以說明，該探針可高選擇性的檢測細胞內(nèi)的GSH。
[0059] 實施案例9:
[0060] 熒光探針在組織中的應用
[0061] 近紅外的探針具有背景低，穿透性強的優(yōu)點。如圖9所示，（a)圖是在小鼠肝冷凍切 片中加入ΙΟμΜ羅丹明B的熒光成像圖，（b)圖是在小鼠肝冷凍切片中先加入ΙΟμΜ探針NIR-Rh，再加入30μΜ GSH的熒光成像圖。從圖可以看出，探針NIR-Rh的穿透深度范圍為40-120μ m，而羅丹明Β的穿透范圍僅僅為45-70μπι，由此我們能得出探針NIR-Rh的穿透能力遠遠強于 羅丹明B。與此同時從圖9中可以得出探針NIR-Rh對GSH的響應的熒光強度遠遠強于羅丹明B 的熒光強度。由此說明，該熒光探針NIR-Rh具有良好的組織滲透和染色能力。
【主權項】
1. 一種近紅外巧光探針(NIR-化)的制備方法和應用，其結構式如下：2. 根據(jù)權利要求1所述的一種近紅外巧光探針的制備方法，其特征在于它的具體制備 步驟為： 1)將環(huán)己酬逐滴加入到冷卻至O °C的濃硫酸中，隨后加入2-((4-二乙氨基)-2-徑基苯 甲酯基)苯甲酸，磁力攬拌回流1.5小時，停止反應;反應混合物冷卻至室溫后，在攬拌下將 反應混合物倒入盛有冰水的燒杯中，隨即加入70%高氯酸，立即產(chǎn)生大量紅色沉淀，抽濾，用 冰水洗涂固體，干燥后得到紅色的固體化合物1，其中環(huán)己酬和2-((4-二乙氨基)-2-徑基苯 甲酯基)苯甲酸的摩爾比為2:1，化合物1的結構為：掌解在無水醋酸中，在氮氣保護下，磁力攬拌回流1.5小時， 1 間，粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(C此CI2和C此CI2/C2曲OH = 2 化合物2)，其中化合物1和費舍爾氏醒的摩爾比為1:1.05， i 3)將化合物2溶解在C也Cb中，攬拌下加入80%水合阱和卡特縮合劑，在室溫下，磁力攬 拌1.5小時；減壓蒸饋除去溶劑，粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離（CH2CI2和CH2CI2/C油50H = 200:1到20:1，V/V)得黃色固體(化合物3 )，其中化合物3、80%水合阱和卡特縮合劑的摩爾比 為1:10:1.05，化合物3的結構為：4)將化合物3和乙二醒溶解在無水甲醇中攬拌，在室溫下，磁力攬拌12小時;減壓蒸饋 除去溶劑，粗產(chǎn)品通過柱層析梯度分離(C也Cb和C也CI2/C2也OH = 200:巧lj20:l，V/V)得淡 黃色固體，為目標產(chǎn)物(化合物NIR-加），其中化合物3和乙二醒的摩爾比為1:2。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種近紅外巧光探針的應用，其特征在于：用于檢測溶液中的 谷脫甘膚。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種近紅外巧光探針的應用，其特征在于：用于檢測細胞內(nèi)的 谷脫甘膚。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種近紅外巧光探針的應用，其特征在于：用于檢測組織中的 谷脫甘膚。
【文檔編號】C07D491/107GK105906643SQ201610321434
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】李春艷, 謝俊英, 李勇飛
【申請人】湘潭大學