一種檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)甲醛的熒光探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測細(xì)胞溶酶體中的甲醛的熒光探針，所述熒光探針的化學(xué)名稱為4?肼基?N?(2?嗎啉基乙基)萘酰亞胺，同時(shí)公開了其制備方法，本發(fā)明制備的熒光探針隨甲醛含量的增加熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，利用本發(fā)明的熒光探針通過熒光成像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)甲醛含量，尤其是細(xì)胞內(nèi)溶酶體中的甲醛含量可于評(píng)價(jià)和研究細(xì)胞中甲醛的生理功能。
【專利說明】
一種檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)甲醛的熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)甲醛的熒光探針及其制備方法，屬于有機(jī)小分 子熒光探針領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲醛在染料、木材加工、紡織工業(yè)等化學(xué)工程和制藥、食品工程中被廣泛使用。此 外，因?yàn)榧兹┚哂泻芎玫呐c蛋白質(zhì)、DNA相結(jié)合的能力，它還是一種常見的細(xì)胞和組織、活體 防腐試劑。然而，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將甲醛評(píng)價(jià)為第三種室內(nèi)化學(xué)污染物。接觸泄露的甲醛 會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，例如阿茲海默癥、癌癥、中風(fēng)和流產(chǎn)等。研究表明，內(nèi)源性甲醛主要是由 于組蛋白的脫甲基化和DNA的甲基化產(chǎn)生的，此外，甲胺類化合物經(jīng)過SSA0酶途徑也會(huì)代謝 產(chǎn)生甲醛。內(nèi)源性甲醛在不同細(xì)胞和組織內(nèi)分布是不一樣的，到目前為止，仍然沒有研究出 內(nèi)源性甲醛的生理功能，這主要是因?yàn)槟壳斑€沒有有效的工具來識(shí)別和檢測活細(xì)胞、組織、 活體內(nèi)的甲醛。基于此，評(píng)估細(xì)胞、組織和活體內(nèi)的甲醛產(chǎn)生、代謝途徑對(duì)于研究甲醛的生 理功能至關(guān)重要。
[0003]目前已報(bào)到的檢測甲醛的方法有：輻射度量法、氣相色譜法、質(zhì)譜法、高效液相色 譜法等，但是這些檢測操作很繁瑣，應(yīng)用不便，并且正在測試過程中還會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行不可修 復(fù)的破壞。因此，發(fā)展一種簡單快捷的測試甲醛含量的方法尤為重要。熒光探針具有高靈敏 性和專一性等特點(diǎn)，并且在檢測過程中不會(huì)破壞樣品而受到廣泛關(guān)注。
[0004] 近兩年，科研工作者陸續(xù)報(bào)道了一些甲醛熒光探針，例如我們2016年在德國應(yīng)用 化學(xué)(Angew. Chem. Int. Ed)中報(bào)道了一種識(shí)別細(xì)胞、組織內(nèi)源性甲醛的雙光子甲醛熒光 探針，但是目前能夠高度識(shí)別甲醛或者專一性識(shí)別甲醛的熒光探針還很少，尤其是能夠識(shí) 別細(xì)胞內(nèi)特殊細(xì)胞器(如溶酶體)的甲醛熒光探針還從未有人進(jìn)行報(bào)道，因此，現(xiàn)階段，開發(fā) 一些背景干擾小、散射干擾小、靈敏度和選擇性更高，能夠避免光漂白和光致毒現(xiàn)象產(chǎn)生的 甲醛熒光探針，尤其是能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)特殊細(xì)胞器(如溶酶體)的甲醛熒光探針尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測細(xì)胞溶酶體中甲醛的熒光探針 (Na-FA-Lyso)及其應(yīng)用。利用本發(fā)明的探針通過熒光成像技術(shù)檢測細(xì)胞溶酶體中的甲醛 可用于評(píng)價(jià)和研究細(xì)胞內(nèi)甲醛在溶酶體中的生理功能。
[0006] 本發(fā)明所述的檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)甲醛的熒光探針，該熒光探針命名為4-肼基-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺，簡稱Na-FA-Lyso,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（〗:）所示：
(f)。
[0007] 上述檢測細(xì)胞溶酶體中甲醛的熒光探針（Na-FA-Lyso)的制備方法是： 制備Na-FA-Lyso:在100 mL圓底燒瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐（1)，氨乙基嗎啉 (2)，再加入乙醇，加熱回流生成化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（3);將化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（3)與水合肼(80%) (4)混合，在乙醇中加熱回流攪拌，生 成化合物4-肼基-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（5)。簡稱:Na-FA-Lyso。
[0008] 上述Na-FA-Lyso的制備反應(yīng)式如下：
[0009]本發(fā)明所述的檢測細(xì)胞溶酶體中甲醛熒光探針Na-FA-Lyso應(yīng)用于檢測生物或者 環(huán)境中的甲醛。
[0010]上述應(yīng)用中：所述熒光探針Na-FA-Lyso能專一識(shí)別甲醛，并以熒光增強(qiáng)方式實(shí)現(xiàn) 對(duì)甲醛的識(shí)別，尤其是它還可以定位識(shí)別細(xì)胞溶酶體中甲醛。
[0011] 本發(fā)明所述檢測甲醛的熒光探針Na-FA-Lyso本身由于肼基的供電子能力導(dǎo)致a-PET效應(yīng)而淬滅分子的熒光，當(dāng)探針與甲醛分子作用后，化合物Na-FA-Lyso上的肼基與甲醛 發(fā)生縮合反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成亞甲基肼結(jié)構(gòu)，使得其供電子能力受到抑制，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度得到大幅 度提升。
[0012] 識(shí)別機(jī)理如下：
本發(fā)明提供的甲醛熒光探針屬小分子類熒光探針，目前針對(duì)甲醛識(shí)別的小分子熒光探 針報(bào)道的并不多，尤其是識(shí)別細(xì)胞溶酶體中甲醛的熒光探針并未有報(bào)道。
[0013] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的檢測甲醛的熒光探針溶液，當(dāng)向其加入甲醛后熒光顯著 增強(qiáng)，該結(jié)果及其現(xiàn)象為生物學(xué)成像應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，預(yù)示其在激光激發(fā)熒光生物標(biāo) 記領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。相應(yīng)的，利用本發(fā)明的探針通過熒光成像技術(shù)檢測甲醛可于 評(píng)價(jià)和研究細(xì)胞內(nèi)甲醛的含量和生理功能，尤其是其還可以檢測細(xì)胞溶酶體中的甲醛，對(duì) 研究細(xì)胞溶酶體中的甲醛生理功能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0014] 圖1:探針Na-FA-Lyso的核磁譜圖氫譜； 圖2:探針Na-FA-Ly so的核磁譜圖氫譜碳譜； 圖3:探針Na-FA-Lyso在水相中的選擇性。其中激發(fā)波長為440 nm;探針的濃度:5 μΜ， 選擇性離子(或氨基酸）的濃度為2.5 mM，活性氧(或者活性氮)濃度為100 μΜ，醛酮濃度為 40 μΜ;卜28加入的離子分別為:探針、乙二醛，甲基乙二醛，丙酮酸鈉，對(duì)羥基苯甲醛，三氯 乙醛，乙醛，對(duì)硝基苯甲醛，丙酮，甲醛，次氯酸鈉，過氧化氫，過氧化叔丁基，過氧化叔丁醇， 一氧化氮，氯化鈣，氯化鎂，亞硫酸鈉，亞硝酸鈉，亞硫酸氫鈉，硫氫化鈉，L-精氨酸，谷胱甘 肽，L-半胱氨酸，D-同型半胱氨酸，D-半胱氨酸，Ν-乙酰甘氨酸，Ν-乙酰-L-半胱氨酸； 圖4:探針Na-FA-Ly so與甲醛作用的滴定實(shí)驗(yàn)。其中激發(fā)波長為440 nm;探針的濃度:5 μΜ； 圖5:探針Na-FA-Ly so與甲醛作用的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。其中激發(fā)波長為450 nm;探針的濃度： 5 μΜ。甲醛濃度為0-1100 μΜ，測試時(shí)間：0.5 h; 圖6:探針Na-FA-Ly so的外源性甲醛細(xì)胞成像應(yīng)用。激發(fā)波長:488 nm，發(fā)射波段:500-55〇11111;其中：&)^^細(xì)胞的明場圖；13)!^1^細(xì)胞與甲醛共孵育的明場圖；(3)!^1^細(xì)胞 與甲醛、化合物Na-FA-Lyso共孵育的明場圖；d)HeLa細(xì)胞的熒光圖；e) HeLa細(xì)胞與甲醛共 孵育的熒光圖；f) HeLa細(xì)胞與甲醛、化合物Na-FA-Lyso共孵育的熒光圖；g)為a)和d)的 置加圖；h)為b)和e)的置加圖；i)為c)和f)的置加圖； 圖7:探針Na-FA-Lyso的內(nèi)源性甲醛細(xì)胞成像應(yīng)用。激發(fā)波長:488 nm，發(fā)射波段:500-550 nm;其中：a) HeLa細(xì)胞與亞硫酸氫鈉共孵育的明場圖；b) HeLa細(xì)胞與亞硫酸氫鈉、化 合物Na-FA-Lyso共孵育的明場圖；c) HeLa細(xì)胞與化合物Na-FA-Lyso共孵育的明場圖；d) HeLa細(xì)胞與亞硫酸氫鈉共孵育的熒光圖；e) HeLa細(xì)胞與亞硫酸氫鈉、化合物Na-FA-Lyso 共孵育的熒光圖；f) HeLa細(xì)胞與化合物Na-FA-Lyso共孵育的熒光圖；g)為a)和d)的疊加 圖；h)為b)和e)的置加圖；i)為c)和f )的置加圖； 圖8:探針Na-FA-Lyso的溶酶體共定位細(xì)胞成像成像應(yīng)用。激發(fā)波長:488 nm,發(fā)射波 段:500-550 nm;其中：a)HeLa細(xì)胞與溶酶體紅色定位染料、甲醛探針Na-FA-Lyso共孵育的 明場圖；b)HeLa細(xì)胞與溶酶體紅色定位染料、甲醛探針Na-FA-Lyso共孵育的紅色熒光圖；c) HeLa細(xì)胞與溶酶體紅色定位染料、甲醛探針Na-FA-Lyso共孵育的綠色熒光圖；d)為a)、b)和 c)的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限 制，實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)應(yīng)上述方案中化合物的號(hào)碼。
[0016] 實(shí)施例1 化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（3)的合成：
在100 mL圓底燒瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐（1) 1 mmol，氨乙基嗎啉（2) 1.2 mm〇l，再加入乙醇5 mL，加熱回流2-3 h后，冷卻至室溫，減壓過濾，濾餅用乙醇洗滌2-3次， 真空干燥，得淺灰色固體4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（3)。產(chǎn)率:81 %。核磁共振圖氫 譜和碳譜如圖1和圖2所示。
[0017] ΧΗ NMR (400 MHz, DMS〇-c/6) δ 8.57 (dd, J ι= 7.2 Hz, J 2 = 0.8 Hz, 1H), 8.55 (dd, /1 = 8.4 Hz, = 0.8 Hz, 1H), 8.34 (d, / = 7.6 Hz, 1H), 8.22 (d, / = 7.6 Hz, 1H), 8.00 (dd, /1 = 8.4 Hz, = 7.2 Hz, 1H), 4.18 (t, /=6.8 Hz, 2H), 3.53 (t, /= 4.8 Hz, 4H), 2.57 (t, /= 7.2 Hz, 2H), 2.47 (s, 4H); 13C 匪R (100 MHz, DMS〇-c/6 ): 163.30， 163.25， 133.09， 132.07， 131.82， 131.44， 130.20, 129.63, 129.27, 128.68, 123.11, 122.33, 66.68, 55.91, 53.87, 37.38〇 化合物4-肼基-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（5)的合成：
將化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（3) 0.2 mmol與水合肼(80%) (4) 0.5mL 混合，在1 mL乙醇中加熱回流攪拌4h，冷卻至室溫，減壓過濾，濾餅用乙醇洗滌2-3次，真空 干燥，殘?jiān)ㄟ^柱層析分離，淋洗劑為二氯甲烷/甲醇(V/V=30 :1)，得到化合物4-肼基-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺（5)。產(chǎn)率:77 %。
[0018] 4 NMR (400 MHz, DMSO-c/?； ) δ 9.16 (s，1H)，8.62 (d，/ = 8.4 Hz, 1H)， 8.42 (d, /= 7.6 Hz, 1H), 8.29 (d, /= 8.8 Hz, 1H), 7.64 (t, /= 7.6 Hz, 1H), 7.25 (d, /= 8.4 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.15 (t, /= 6.8 Hz, 2H), 3.54 (s, 4H), 2.53 (t, /= 6.8 Hz, 2H), 2.46 (s, 4H) ; 13C NMR (100 MHz, DMSO-c/e): 165.05, 164.14, 154.50, 133.52, 131.87, 130.59, 129.56, 125.39, 122.94, 119.68, 108.52, 106.27, 67.49, 57.09, 54.70, 37.63〇
[0019] 實(shí)施例2 化合物Na-FA-Lyso甲醛熒光探針對(duì)不同分子或離子的選擇性 配制5 mL濃度為40 mM的各種常規(guī)的離子及氨基酸的roS水溶液及濃度為1 mM的本發(fā) 明所述檢測甲醛的熒光探針母液作為備用。
[0020] 加入25 yL探針母液、225 yL DMS0和500當(dāng)量的各離子（或氨基酸）溶液，用磷酸 緩沖液PBS定容至5 mL，搖勻后進(jìn)行熒光檢測(λΜ= 440 nm，Aem= 543 nm)，建立熒光強(qiáng)度 與各離子（或氨基酸、活性氧、活性氮）的曲線圖（結(jié)果見圖3)。30 min后檢測溶液的熒光 發(fā)射光譜變化，由圖3可以發(fā)現(xiàn)，其他離子（或氨基酸）對(duì)化合物Na-FA-Lyso的熒光幾乎沒 有影響，而甲醛的加入使化合物Na-FA-Lyso的熒光顯著增強(qiáng)。
[0021] 實(shí)施例3 不同濃度的甲醛對(duì)化合物Na-FA-Lyso甲醛熒光探針的熒光滴定檢測 配制10 mL濃度為100 mM甲醛的水溶液及濃度為1 mM的本發(fā)明所述檢測甲醛的熒光探 針母液作為備用。
[0022] 配制探針濃度為5 μΜ，分別與不同濃度的甲醛(0 - 100 μΜ)相互作用，并進(jìn)行熒 光檢測(λ0Χ= 440 nm，Xem= 543 nm)，計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度，建立熒光強(qiáng)度與甲醛濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4所示，隨著甲醛濃度的增加，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)甲醛濃度達(dá)到 40 μΜ時(shí)，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和狀態(tài)。
[0023] 實(shí)施例4 化合物Na-FA-Lyso甲醛熒光探針與甲醛相互作用的動(dòng)力學(xué)測試 配制10 mL濃度為100 mM甲醛的水溶液及濃度為1 mM的本發(fā)明所述檢測甲醛的熒光探 針母液作為備用。
[0024] 配制探針和甲醛的溶液，其濃度分別為:探針5 μΜ;甲醛濃度:0-200 μΜ。進(jìn)行熒光 檢測（Xex = 440 nm, Aem = 543 nm)，每隔1 min測試一次，測試30 min，計(jì)算各體系中隨時(shí) 間變化的熒光強(qiáng)度，建立熒光強(qiáng)度與作用時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，大約反應(yīng)5 min，反應(yīng) 體系熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和狀態(tài)。
[0025] 實(shí)施例5 化合物Na-FA-Lyso甲醛熒光探針的外源性甲醛細(xì)胞成像測試 將密度為3 X 105個(gè)/mL的癌細(xì)胞接種到滅菌的鋪有蓋玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培養(yǎng)皿中，在C02培養(yǎng)箱(溫度為37 °C，5 % C02)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分成幾組實(shí)驗(yàn) 組進(jìn)行培養(yǎng)：（1)空白細(xì)胞組；（2)細(xì)胞外加40 μΜ甲醛孵育30 min; (3)細(xì)胞外加5 μΜ探 針孵育30 min后再外加40 μΜ甲醛孵育30 min;待培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次， 將培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的蓋玻片取出，制樣，用熒光顯微鏡分別拍攝這三組條件下培養(yǎng)的細(xì) 胞的熒光照片，發(fā)現(xiàn)第(3)組的癌細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈熒光。（結(jié)果見圖6)。
[0026] 實(shí)施例6 化合物Na-FA-Ly so甲醛熒光探針的內(nèi)源性甲醛細(xì)胞成像測試 將密度為3 X 105個(gè)/mL的癌細(xì)胞接種到滅菌的鋪有蓋玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培養(yǎng)皿中，在C02培養(yǎng)箱(溫度為37 °C，5 % C02)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分成幾組實(shí)驗(yàn) 組進(jìn)行培養(yǎng)：（1)細(xì)胞外加100 μΜ亞硫酸氫鈉孵育30 min; (2)細(xì)胞外加100 μΜ亞硫酸氫 鈉孵育30 min后再外加5 μΜ探針孵育30 min; (3)細(xì)胞外加5 μΜ探針孵育30 min;待培 養(yǎng)結(jié)束后，用緩沖液沖洗細(xì)胞3次，將培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的蓋玻片取出，制樣，用熒光顯 微鏡分別拍攝這三組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的熒光照片，發(fā)現(xiàn)第(3)組的癌細(xì)胞能夠發(fā)出明顯 熒光信號(hào)。（結(jié)果見圖7)。
[0027] 實(shí)施例7 化合物Na-FA-Ly so甲醛熒光探針的內(nèi)源性甲醛細(xì)胞成像測試 將密度為3 X 105個(gè)/mL的癌細(xì)胞接種到滅菌的鋪有蓋玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培養(yǎng)皿中，在C02培養(yǎng)箱(溫度為37 °C，5 % C02)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組培 養(yǎng):將溶酶體紅色定位染料加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中孵育20 min，然后用roS緩沖液沖洗細(xì)胞3 次，將探針Na-FA-Lyso 5μΜ加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用roS緩沖 液沖洗細(xì)胞3次，用熒光顯微鏡分別拍攝這三組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的熒光照片，發(fā)現(xiàn)所報(bào)道 的溶酶體靶向甲醛熒光探針Na-FA-Ly so能夠高度靶向細(xì)胞的溶酶體，經(jīng)過測試，細(xì)胞定位 系數(shù)Pearson' s Coefficient高達(dá)82%D (結(jié)果見圖8)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)甲醛的熒光探針，其特征在于，該熒光探針命名為4-肼基-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺，簡稱Na-FA-Lyso,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（f:)所示：(!：)〇2. -種權(quán)利要求1所述的檢測細(xì)胞溶酶體中甲醛的熒光探針的制備方法，其特征在于， 具體制備方法如下： 在100 mL圓底燒瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐，氨乙基嗎啉，再加入乙醇，加熱回流 生成化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺;將化合物4-溴-N-(2-嗎啉基乙基)萘酰亞胺 與80%水合肼混合，在乙醇中加熱回流攪拌，生成化合物4-肼基-N-( 2-嗎啉基乙基）萘酰亞 胺。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK106008342SQ201610338187
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】林偉英, 劉展榕, 徐安, 唐永和
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)