本發(fā)明涉及一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針的制備方法及其在殺菌方面的應(yīng)用，尤其涉及通過熒光信號變化監(jiān)測抗菌多肽與細(xì)菌的結(jié)合方式及結(jié)合動力學(xué)過程方面的用途。

背景技術(shù)：

由外傷或疾病引起的骨缺損或骨缺失在臨床上十分常見。傳統(tǒng)的臨床治療主要是通過自體骨移植或植入生物相容性好的植入體材料。但是，盡管在手術(shù)前對患者進(jìn)行抗生素預(yù)防和材料無菌處理，在植入手術(shù)初期因細(xì)菌感染引發(fā)的植入體失效率仍然較高。據(jù)臨床統(tǒng)計，細(xì)菌感染導(dǎo)致的植入體實效比例約為4％－6％，如此高的比例已經(jīng)在國際上引起廣泛的關(guān)注。植入體細(xì)菌感染后果十分嚴(yán)重，這些細(xì)菌會直接導(dǎo)致周圍組織壞死，甚至使病人殘疾或死亡。

為預(yù)防植入體細(xì)菌感染，當(dāng)前最常使用的方法為無機(jī)離子抗菌和抗生素抗菌。無機(jī)離子多為重金屬離子，在隨植入體進(jìn)入體內(nèi)之后無法正常排出體外；抗生素由于其廣泛的使用，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響了其抗菌性能。抗菌多肽是最新研究出的一種氨基酸抗生素，由12～50個氨基酸殘基組成，具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌性等特點(diǎn)。抗菌多肽具有優(yōu)異的抗菌性能，可以快速殺死細(xì)菌；并且由于其為氨基酸形成的肽鏈，可以迅速成為潛在的治療藥物?？咕嚯牡闹委煼秶鸀椋焊锾m氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等。

當(dāng)前對抗菌多肽的作用方式的研究方法主要包括掃描電鏡(sem)、投射電鏡(tem)、原子力顯微鏡(afm)、大型單層囊泡模擬(guv)、熒光成像等。相對于sem、afm和tem成像技術(shù)，熒光成像具有成本低、易于操作及可以直接觀察等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有的熒光成像主要是采用熒光素等小分子有機(jī)染料，但是傳統(tǒng)的小分子有機(jī)染料的熒光具有聚集誘導(dǎo)猝滅的缺陷，在高密度染色細(xì)菌時，其熒光會發(fā)生明顯的自我猝滅，同時，其光穩(wěn)定性差，難以實時監(jiān)測抗菌多肽與細(xì)菌的結(jié)合過程及殺菌方式。

近年來，聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)材料作為新一代熒光材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域日益獲得廣泛應(yīng)用。聚集誘導(dǎo)發(fā)光材料具有強(qiáng)抗光漂白能力、高發(fā)光效率、大的斯托克位移和低毒性等優(yōu)點(diǎn)。由于分子內(nèi)運(yùn)動受限，aie材料在聚集態(tài)具有高發(fā)光效率。由于aie材料可以通過化學(xué)反應(yīng)接枝到抗菌多肽上，可通過其特有的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性，實現(xiàn)對細(xì)菌的高信噪比熒光成像，有效揭示抗菌多肽與細(xì)菌結(jié)合的動力學(xué)過程及殺菌方式，且具有光穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，適于長期實時監(jiān)測抗菌多肽對細(xì)菌的殺滅過程。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)性質(zhì)的熒光抗菌多肽探針以研究抗菌多肽的殺菌作用原理及過程。本發(fā)明的抗菌多肽探針抗菌活性高、聚集態(tài)發(fā)光效率高，通過熒光強(qiáng)度變化可以實時觀測抗菌多肽對大腸桿菌作用過程。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針，由聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物與抗菌多肽連接而成；所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物的通式為式(i)：

其中，x選自n、s、o雜原子；r¹、r²相同或不同，且分別獨(dú)立地選自氫、鹵素、取代或未被取代的芳基、取代或未被取代的雜芳基、烴基、取代或未被取代的芳氧基(如：c6h5-o-)、取代或未被取代的烷氧基(如：ch3-o-)、取代或未被取代的芳硫基、取代或未被取代的烷硫基。

所述芳基是指具有6-20個碳原子的單環(huán)或多環(huán)芳族基團(tuán)，所述芳基優(yōu)選為苯基、萘基、1,2,3,4-四氫萘基、蒽基、芘基或菲基。

所述雜芳基是指具有1-20個碳原子、1-4個選自n、s、o雜原子的單環(huán)或多環(huán)雜芳族基團(tuán)；且當(dāng)碳原子的個數(shù)為1時，雜原子的個數(shù)≥2；當(dāng)雜原子的個數(shù)為1時，碳原子的個數(shù)≥2。

所述雜芳基優(yōu)選為吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮雜萘基、氮雜蒽基、氮雜芘基等。

所述烴基為直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈烯烴基、直鏈或支鏈炔基；優(yōu)選為甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基、烯丙基、炔丙基。

r(y)選自以下任意一種：被官能團(tuán)y取代的芳基，其結(jié)構(gòu)為-ar-y；被官能團(tuán)y取代的雜芳基，其結(jié)構(gòu)為-雜芳基-y；含有官能團(tuán)y的烷基，其結(jié)構(gòu)為-r-y，r為亞烷基；被官能團(tuán)y取代的芳氧基，其結(jié)構(gòu)為-o-ar-y；含有官能團(tuán)y的烷氧基，其結(jié)構(gòu)為-o-r-y，r為亞烷基；被官能團(tuán)y取代的芳硫基，其結(jié)構(gòu)為-s-ar-y；含有官能團(tuán)y的烷硫基，其結(jié)構(gòu)為-s-r-y，r為亞烷基；鹵素；

官能團(tuán)y選自：-n3、-nh2、-cooh、-ncs、-sh、炔基(-c≡ch)、-cho、-oh、鹵素、n-羥基丁二酰亞胺酯基團(tuán)、馬來酰亞胺基團(tuán)、酰肼基團(tuán)、含有硝酮基的基團(tuán)。

所述n-羥基丁二酰亞胺酯基團(tuán)的結(jié)構(gòu)為馬來酰亞胺基團(tuán)的結(jié)構(gòu)為酰肼的結(jié)構(gòu)為含有硝酮基的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)為

所述抗菌多肽與聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物中的r(y)反應(yīng)。

所述抗菌多肽為krwwkwwrr、krwwkwwrrc、llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes、gigkflhsakkfgkafvgeimns、trssraglqfpvgrvhrllrk中一種以上。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針中，聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物的式(i)中r¹、r²分別為氫；所述r(y)為-och2cooh。

所述多肽優(yōu)選為krwwkwwrr。

所述抗菌多肽探針優(yōu)選為以下結(jié)構(gòu)式的化合物：

所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針的制備方法，包括以下步驟：

在溶劑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺的體系中，將聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物和抗菌多肽進(jìn)行反應(yīng)，分離，干燥，得到聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針。

所述溶劑為水或具有水溶性的有機(jī)溶劑；所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜、乙醇、甘油，優(yōu)選為二甲基亞砜。

所述反應(yīng)為酰胺反應(yīng)時，需在堿的環(huán)境下進(jìn)行，所述堿為二異丙基乙基胺。

所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺的摩爾比為1:1～1:2，聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物和抗菌多肽的摩爾比為1:1～5:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺的總用量與聚集誘導(dǎo)發(fā)光化合物的摩爾比為(5:1～10:1)；

所述反應(yīng)時間為1～15h；所述分離為通過高效液相色譜進(jìn)行分離，洗脫液優(yōu)選含1％體積三氟乙酸的乙腈和1％體積三氟乙酸的水組成的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。

所述干燥為冷凍干燥。

所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針在實時監(jiān)測抗菌多肽殺滅細(xì)菌的結(jié)合方式和動力學(xué)過程的用途。

本發(fā)明所述的聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針是通過聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)實現(xiàn)實時監(jiān)測抗菌多肽結(jié)合及殺滅細(xì)菌的過程。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“聚集誘導(dǎo)發(fā)光”或“aie”是指熒光化合物在稀溶液中幾乎不發(fā)光，但在聚集態(tài)或固態(tài)發(fā)出強(qiáng)熒光的現(xiàn)象。

本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗菌多肽”是指一種帶有正電荷并呈現(xiàn)出疏水性、由4-50個氨基酸組成的新型抗菌劑。它對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有優(yōu)異的抗菌效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明的探針抗菌活性高，短時間內(nèi)即可殺死細(xì)菌，且不易產(chǎn)生耐藥性；

(2)本發(fā)明的抗菌多肽探針聚集態(tài)發(fā)光效率高，克服了傳統(tǒng)染料高密度染色時熒光自我淬滅的問題；

(3)本發(fā)明的aie化合物的制備容易，易于修飾，聚集態(tài)發(fā)光效率高，且在水溶液中發(fā)光微弱，對細(xì)菌成像的信噪比高；

(4)本發(fā)明的制備方法簡單，易于實現(xiàn)。

附圖說明

圖1為抗菌多肽探針amp-2hbt的制備流程圖；

圖2為抗菌多肽探針amp-2hbt的質(zhì)譜圖；

圖3為抗菌多肽探針amp-2hbt的hplc圖；

圖4中(a)為抗菌多肽探針amp-2hbt在四氫呋喃中的紫外吸收光譜圖；(b)為抗菌多肽探針amp-2hbt在thf溶液條件和薄膜條件下的uv-pl光譜；圖b中內(nèi)插圖為amp-2hbt在溶液條件和薄膜條件下的光學(xué)照片；

圖5中(a)-(d)為不同時間條件下抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌之后的熒光強(qiáng)度變化圖；(e)-(h)不同時間條件下hbt-cooh作用于大腸桿菌之后的熒光強(qiáng)度變化圖；其中hbt-cooh作為對照組；(a)、(e)為15min，(b)、(f)為30min，(c)、(g)為45min，(d)、(h)為60min；

圖6為抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌，不同時間下的細(xì)菌熒光比例曲線圖；其中的熒光比例是指熒光強(qiáng)度高于檢測限的細(xì)菌數(shù)量占設(shè)定總細(xì)菌量的百分比，圖中縱坐標(biāo)為細(xì)菌數(shù)量，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度的log值，其中高于10¹的均為高于檢測限的細(xì)菌；

圖7為抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌后，大腸桿菌的熒光照片；a、b為不同部位的大腸桿菌的熒光照片；

圖8中(a)為與amp-2hbt探針作用前的大腸桿菌的透射電鏡圖片；(b)為與amp-2hbt探針作用后的大腸桿菌的透射電鏡圖片；(c)為與amp-2hbt探針作用前的大腸桿菌的掃描電鏡圖片；(d)為與amp-2hbt探針作用后的大腸桿菌的掃描電鏡圖片；

圖9為hhc36抗菌肽(amp)與amp-2hbt探針在不同濃度下的殺菌效率對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

aie熒光分子hbt-cooh的合成：

(1)化合物3合成：將690mg(5mmol)2,4-二羥基苯甲醛(化合物1)與830mg(5mmol)2-溴乙酸乙酯(化合物2)加入到反應(yīng)瓶中，然后加入1.38g(10mmol)k2co3、30ml乙腈，80℃回流反應(yīng)過夜，待反應(yīng)結(jié)束，萃取除去體系中的無機(jī)鹽，然后旋干，使用硅膠柱進(jìn)行分離，產(chǎn)率68％(762mg)；

(2)化合物4合成：將224mg(1mmol)化合物3與150mg(1.2mmol)2-氨基苯硫酚溶解到15ml乙醇中，之后，逐滴加入100mg(37wt.％,1mmol)的濃鹽酸，攪拌10min，然后將113mg(30wt.％,1mmol)雙氧水滴加到混合溶液中，并在室溫繼續(xù)攪拌2h，反應(yīng)完全后，將溶液旋干，殘留物質(zhì)通過乙醇重結(jié)晶即可得到化合物4，產(chǎn)率70％(230mg)；

(3)化合物hbt-cooh合成：將165mg(0.5mmol)化合物4溶解于5mlthf溶液中，同時將40mg(1mmol)naoh溶解于2ml水中，然后將thf溶液加入到naoh溶液中，將混合溶液加熱回流3h，將反應(yīng)溶液冷卻到室溫后，通過抽真空方法排除體系中的有機(jī)溶劑，然后加入5ml水，逐滴滴加1m的hcl(aq)，使得產(chǎn)物沉淀出來，將產(chǎn)物濾出，分別用水、乙酸乙酯清洗，然后旋干，得到化合物hbt-cooh，產(chǎn)率52％(78mg)。

hbt-cooh結(jié)構(gòu)式為：

實施例1

(1)將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(11.5mg,0.06mmol)、n-羥基琥珀酰亞胺(6.9mg,0.06mmol)、aie熒光分子hbt-cooh(6mg,0.02mmol)溶解在1ml二甲基亞砜中，在氮?dú)鈼l件下室溫攪拌4小時；然后加入二異丙基乙基胺(1.3mg,0.01mmol)和抗菌多肽hhc36(生產(chǎn)廠家為上海吉爾生化有限公司)(7.4mg,0.005mmol)，再次在氮?dú)鈼l件下室溫攪拌12小時；反應(yīng)之后，將混合溶液通過0.2μm的過濾頭過濾，然后利用液相色譜儀進(jìn)行分離純化，其中分離溶劑a為含有體積分?jǐn)?shù)為0.1％三氟乙酸的hplc級別水，分離溶劑b為含有體積分?jǐn)?shù)為0.1％三氟乙酸的hplc級別乙腈；冷凍干燥(-50℃)，得到amp-2hbt抗菌多肽探針(即聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針)，產(chǎn)率36％(3.9mg)。本實施例中amp-2hbt抗菌多肽探針的制備流程圖如圖1所示；質(zhì)譜圖如圖2所示；hplc圖如圖3所示。

本實施例制備的amp-2hbt抗菌多肽探針在四氫呋喃中的紫外吸收光譜圖如圖4a所示，薄膜條件下的uv-pl光譜如圖4b所示，圖4b中內(nèi)插圖為amp-2hbt在溶液條件和薄膜條件下的光學(xué)照片。

本實施例制備的amp-2hbt抗菌多肽探針薄膜態(tài)的熒光量子產(chǎn)率為20.0％，本實施例制備的amp-2hbt抗菌多肽探針分子量為2052.88，高效液相色譜分離結(jié)果說明所合成的抗菌多肽探針的出峰時間為19.3-19.7min，監(jiān)測波長為350nm。

抗菌測試：

(1)抗菌效果測試：將不同體積的實施例1制備的抗菌多肽探針與大腸桿菌溶液混合，抗菌多肽探針的最終濃度為0，20，50和100μm，大腸桿菌的最終濃度為10⁷cfuml^-1。將混合溶液置于霉菌搖床中37℃下避光輕搖2小時，然后將菌液進(jìn)行梯度稀釋，并涂附于瓊脂板上培養(yǎng)。14小時后取出，讀取不同抗菌多肽探針條件下瓊脂板表面的細(xì)菌菌落數(shù)量。其中采用未修飾aie分子的amp作為陽性對照，同樣測試不同濃度下，抗菌多肽對大腸桿菌的抗菌效果，測試結(jié)果如圖9所示，圖9為hhc36抗菌肽(amp)與amp-2hbt探針在不同濃度下的殺菌效率對比圖。最終濃度為20μm的抗菌多肽探針與大腸桿菌作用前后的表征圖如圖8所示，其中(a)為與amp-2hbt探針作用前的大腸桿菌的透射電鏡圖片；(b)為與amp-2hbt探針作用后的大腸桿菌的透射電鏡圖片；(c)為與amp-2hbt探針作用前的大腸桿菌的掃描電鏡圖片；(d)為與amp-2hbt探針作用后的大腸桿菌的掃描電鏡圖片。從圖8和9可知，抗菌多肽修飾了aie分子之后，依然保持了其原有的抗菌性能，隨著其濃度的增加，抗菌效果越好。

(2)基于抗菌多肽探針優(yōu)異的抗菌效果，選擇對于不同的時間(15，30，45，60min)下細(xì)菌的熒光強(qiáng)度以及抗菌多肽探針的作用效率進(jìn)行評估：

熒光探針amp-2hbt(20μm)與hbt-cooh(20μm)分別加入到相同數(shù)量(10⁷cfuml^-1)的大腸桿菌(廣東省微生物研究所,atcc8739)中，避光培養(yǎng)到設(shè)定的時間(15，30，45，60min)時，通過倒置熒光顯微鏡對熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。不同時間下(培養(yǎng)時間)，抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌之后的熒光強(qiáng)度變化圖如圖5所示(圖中(a)-(d)為不同時間條件下抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌之后的熒光強(qiáng)度變化圖；(e)-(h)為不同時間條件下hbt-cooh作用于大腸桿菌之后的熒光強(qiáng)度變化圖；其中hbt-cooh作為對照組；(a)、(e)為15min，(b)、(f)為30min，(c)、(g)為45min，(d)、(h)為60min)。實驗組amp-2hbt在不同的時間下均有熒光，對照組hbt-cooh在不同的時間下均沒有熒光，同時，隨著時間的延長，細(xì)菌表面的熒光強(qiáng)度也逐漸的增加。該結(jié)論說明熒光探針可以快速作用于細(xì)菌表面，隨著時間延長，探針在細(xì)菌表面的聚集程度加深，熒光強(qiáng)度加強(qiáng)。同時，隨著聚集程度的加深，探針在細(xì)菌膜上形成的孔洞越大，細(xì)菌內(nèi)容物流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

通過流式細(xì)胞儀(統(tǒng)計50000個細(xì)菌)對抗菌多肽探針的作用效率進(jìn)行評估：將20μm的熒光探針amp-2hbt加入到大腸桿菌中，避光培養(yǎng)到設(shè)定的時間，然后測定熒光含量高于空白組(未加入熒光探針amp-2hbt)的細(xì)菌占整體計數(shù)細(xì)菌的比例，測試結(jié)果如圖6所示。圖6為抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌，不同時間下的細(xì)菌熒光比例曲線圖；其中的熒光比例是指熒光強(qiáng)度高于檢測限的細(xì)菌數(shù)量占設(shè)定總細(xì)菌量的百分比，圖中縱坐標(biāo)為細(xì)菌數(shù)量，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度的log值，其中高于10¹的均為高于檢測限的細(xì)菌。在設(shè)定的0，15，30，45和60min條件下，熒光強(qiáng)度高于空白組的細(xì)菌比例分別為14.02％，40.85％，64.96％和84.99％。該結(jié)果表明，抗菌多肽熒光探針隨著時間的延長，熒光信號增加，可被流式細(xì)胞儀識別的含熒光的細(xì)菌比例增加。

(3)為了進(jìn)一步研究抗菌多肽探針在細(xì)菌上的分布位置，選擇使用超級顯微鏡來觀察微觀形貌下抗菌多肽探針的聚集狀態(tài)：

抗菌多肽探針amp-2hbt作用于大腸桿菌后，大腸桿菌的熒光照片如圖7所示；其中a、b為不同位置的大腸桿菌的熒光照片。在超級顯微鏡觀察下，抗菌多肽探針在細(xì)菌表面呈現(xiàn)出點(diǎn)狀分布。該結(jié)果表明，抗菌多肽在殺死細(xì)菌的時候，會先在細(xì)菌膜上聚集形成孔洞，使得細(xì)菌內(nèi)容物流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌凋亡。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光抗菌多肽探針及制備與應(yīng)用

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