一種抗菌帶魚四肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從帶魚蛋白中分離出的抗菌肽，屬于氨基酸提取工藝領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽是生物體內(nèi)的小分子多肽，是構(gòu)成生物體先天免疫系統(tǒng)的重要成分?？咕?肽具有廣譜抗菌及抗病毒等特性，細(xì)菌對抗菌肽比傳統(tǒng)抗生素更難產(chǎn)生抗性，是傳統(tǒng)抗生 素的理想替代品。目前已從各種生物中分離出了逾2000種抗菌肽。魚類種類繁多，生境復(fù) 雜，是抗菌肽的重要來源，目前已報道了 150余種魚源抗菌肽。劉超(基于酶法制備鯰魚抗菌 肽純化試驗，食品工業(yè)，2014)利用酶法水解鯰魚體表黏液蛋白制備抗菌肽，對大腸桿菌的 抑菌效果較好。他采用20%~60%飽和度的硫酸銨沉淀，3卯1161(1616-25凝膠過濾層析對 抗菌肽進行分離提純。并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電（SDSPAGE)對分離純化的效 果進行了檢驗。檢測出該抗菌肽分子量為27.7 ku，抑菌率達到2.9%。然而，上述工藝比較 復(fù)雜，制備研究還只能停留在實驗室階段，很難產(chǎn)業(yè)化實施。
[0003] 魚類是抗菌肽分離制備的重要來源。魚我國是水產(chǎn)大國，帶魚產(chǎn)量高，然而，目前 為止，還仍未對水產(chǎn)酶解制抗菌肽展開廣擴的研究，對于優(yōu)質(zhì)蛋白含量高的帶魚的蛋白的 分離和提取，未曾有相關(guān)文獻記載。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種新的抗菌肽--帶魚四 肽；
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供上述帶魚四肽的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來具體實現(xiàn)：
[0007] -種抗菌帶魚四肽，氨基酸序列為Gln-Ala-Glu-Gly?？咕鷰~四肽的編碼基因如 序列表中序列1所示，抗菌帶魚四肽如序列表中序列2所示。
[0008] 優(yōu)選的，上述抗菌帶魚四肽的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)帶魚預(yù)處理
[0010]帶魚去頭，去內(nèi)臟，清洗后用勻漿制成肉漿，用水漂洗、離心脫脂，沉淀物冷凍干 燥，得到脫脂帶魚蛋白，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 2)酶法水解帶魚蛋白制得帶魚四肽
[0012]將步驟1)得到的脫脂帶魚蛋白溶于水中，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的帶魚蛋白溶液，再調(diào) pH值7.0，水浴振蕩30 min后加入堿性蛋白酶開始水解，水解過程中控制溶液pH值維持8.5; 水解4h，滅活后冷凍離心，去除上清中微量油脂及沉淀，將中間部分清液真空濃縮；
[0013] 3)超濾分離
[0014] 在0.25 MPa壓力下超濾，依次透過分子質(zhì)量為10KD，5KD，3KD的超濾膜；得到〉 10KD，10KD~5KD，5KD~3KD，〈3KD四個不同分子量段組分，將〈3KD的組分真空濃縮，冷凍干 燥；
[0015] 4)凝膠過濾層析
[0016] 用SephalexG25色譜柱，加步驟3)中分離的溶液2mL，以pH 7·5,0·15 mol/L的磷酸 緩沖液作為洗脫液，以流動相溶液為10mL/h的流速進行洗脫，洗脫后有4個組分，經(jīng)抗菌實 驗檢測后得到第一個組分的抗菌活性最強，收集第一個組分的流出相真空濃縮，冷凍干燥； [0017] 5)RP_HPLC 分離提純
[0018]利用XBrigeTMPrep-C18柱將步驟4)的組分進行梯度洗脫，梯度洗脫條件如下： [0019] 色譜柱為XBrigeTMPrep_C18、250 _Χ4·6 _、5μηι色譜柱。流動相A:甲醇溶液，流 動相Β: 0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液;洗脫方式:梯度洗脫，A: Β = 5:95;流速：1.0ml/min;柱 溫:25°C ;進樣量：10ul;運行時間：15min;紫外檢測波長:254 nm;
[0020] 所述流動相中的磷酸二氫鈉的PH為7.25，所述梯度洗脫的程序為〇11^11451^114 15min-95min，甲醇 10%-30%-65%-95%。
[0021] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，所述肉漿:水的體積比為1:4;進一步優(yōu)選的，所述水為蒸 餾水；
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，所述勻漿于高速分散均質(zhì)機中進行。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，用水漂洗30min后4000r/min下離心脫脂15min。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，用5mol/L HC1溶液調(diào)pH值7.0;用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HC1溶液調(diào)節(jié)溶液pH值維持8.5。
[0025] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，堿性蛋白酶的加入量為2000U/g，酶解溫度為45°C，水解完 成后，90°C滅活10 min。
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述冷凍離心過程具體為于4°C下12000 r/min冷凍離心 30 min；
[0027] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述真濃縮過程具體條件為于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40°C下真空濃 縮。
[0028]優(yōu)選的，所述步驟3)中，膜分離條件是：帶魚肽水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，pH7.5，溫度 35。。。
[0029]優(yōu)選的，所述步驟4)和步驟5)中，真空濃縮的條件均為40°C下濃縮60min，冷凍干 燥的條件均為-50 °C下冷凍24h。
[0030] 本發(fā)明提供了一種新的抗氧化肽一帶魚四肽，具有很強的抗菌活性，本發(fā)明所得 帶魚四肽濾過液的抗菌活性達85.2%，抗氧化活性達77.8%。對金黃色葡萄球菌的最小抑 菌濃度(MIC)為0.20 mg/ml，對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)為0.26mg/ml。本發(fā)明 帶魚四肽制備方法簡單，只需一步水解即可，水解條件溫和，純化過程簡單，適何擴大化的 工業(yè)化生產(chǎn)。其中，水解過程是采用堿性蛋白酶水解，水解度為69.52 %，羥自由基清除率為 76.74%。
【附圖說明】
[0031] 圖1是凝膠過濾層析分離四個組分；
[0032]圖2是半制備RP-HPLC分離提純F1組分的色譜圖；
[0033]圖3是半制備RP-HPLC分離提純F1組分4個部分的抑菌圈照片(濃度0.5mg/ml); [0034]圖4是組分F1-1的分子量報告圖。
【具體實施方式】
[0035]以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0036] 實施例1:
[0037]為了說明本發(fā)明的實質(zhì)，申請人進行了如下實驗。
[0038]儀器與設(shè)備
[0039] U-2800紫外分光光度計，日本日立有限公司；PHS-3C pH計，上海蘭科儀器公司； FJ300SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；UPT-11-60L優(yōu)普超純水機，杭 州雷琪實驗器材有限公司。
[0040]試驗方法 [0041 ] 1、帶魚預(yù)處理
[0042]帶魚去頭，去內(nèi)臟，清洗后立即用高速分散均質(zhì)機勻漿，用蒸餾水(體積比1:4)漂 洗30min后4000 g離心脫脂15min，沉淀物冷凍干燥，得到脫脂帶魚蛋白，-20°C保存?zhèn)溆谩?[0043] 2、酶法水解脫脂帶魚蛋白
[0044]用堿性蛋白酶水解脫脂帶魚蛋白。
[0045] 具體方法如下：
[0046]將脫脂帶魚蛋白用水溶解，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的蛋白溶液，用5mol/L HC1溶液或 5mol/LNa0H溶液調(diào)pH值7.0，水浴振蕩30 min后加入堿性蛋白酶(加酶量為2000U/g)開始水 解。反應(yīng)過程中用0.1111〇1/1似0!1或0.1111 〇1/1!1(：1溶液調(diào)節(jié)溶液?!1值維持8.5。酶解溫度 45°C，水解4h，90°C滅活10 min后于4°C12000g冷凍離心30 min，去除上清中微量油脂及沉 淀，將中間部分清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40 °C真空濃縮。
[0047]帶魚堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度為69.52%，羥自由基清除率為76.74%。
[0048] 3、超濾分離
[0049]在0.25 MPa壓力下超濾，透過分子質(zhì)量為3ku超濾膜。最佳膜分離條件是：帶魚肽 質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 %，pH7.5，溫度3