一種熒光標(biāo)記探針及其制備方法及對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種熒光標(biāo)記探針及其制備方法及對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記應(yīng)用。采用有機(jī)合成的方法，直接在羅丹明B骨架結(jié)構(gòu)的底環(huán)上引入具有熒光性質(zhì)的、多個(gè)雜原子的噁二唑雜環(huán)。引入的噁二唑雜環(huán)，既作為第二熒光團(tuán)拓展羅丹明類(lèi)熒光探針的光譜性質(zhì)，又通過(guò)引入多個(gè)雜原子增加形成氫鍵的位點(diǎn),利于與生物體作用。在化合物RH?MCl中，噁二唑環(huán)一側(cè)由羅丹明B取代，另一側(cè)由氯甲基取代?；衔颮H?MCl具有良好的水溶性，其對(duì)細(xì)菌的熒光標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，容易操作，便于觀察、檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種熒光標(biāo)記探針及其制備方法及對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記應(yīng)用
[0001 ]本發(fā)明是在天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(合同編號(hào)：14JCYBJC23900)的 資助下進(jìn)行的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記探針的制備及細(xì)菌熒光標(biāo)記方法，屬于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0003] 熒光探針在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)、化工和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域 也有著廣泛地應(yīng)用。同時(shí)它的發(fā)展與生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、診斷醫(yī)學(xué)等學(xué)科緊密相關(guān)。隨著 化學(xué)、物理學(xué)和生物技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展與進(jìn)步，誕生了越來(lái)越多的與熒光探針相關(guān)的 技術(shù)，這些技術(shù)極大的拓展了熒光探針的應(yīng)用范圍和研究深度，使得熒光探針日益成為現(xiàn) 代新技術(shù)領(lǐng)域強(qiáng)有力研究手段。這些新研究手段的日益多樣化也對(duì)熒光分子探針的種類(lèi)提 出了更高的要求。
[0004] 細(xì)菌是一類(lèi)原核細(xì)胞型微生物，因?yàn)榫w小、半透明，要想更清楚的觀察其大小和 形態(tài)，需經(jīng)標(biāo)記和顯微鏡放大后才能看到。常用的細(xì)菌標(biāo)記方法有染料標(biāo)記法，例如單染 法、復(fù)染法和鑒別染色法，主要有革蘭氏染色、美藍(lán)染色、抗酸染色、瑞氏染色和姬姆薩染色 等方法，但是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記的報(bào)道還不多見(jiàn)。開(kāi)發(fā)熒光探針用于細(xì)菌的標(biāo)記具有重 要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有分子式I的熒光探針及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該熒光探針對(duì)幾種細(xì)菌抹片及細(xì)菌懸液進(jìn)行熒光標(biāo) 記的方法，該方法具有操作方法簡(jiǎn)單，便于觀察、檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是公開(kāi)了氯甲基噁二唑羅丹明化合物在制備細(xì)菌熒光探針 標(biāo)記方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是公開(kāi)了熒光探針對(duì)幾種細(xì)菌熒光標(biāo)記的兩種方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容： 具有結(jié)構(gòu)式I的氯甲基羅丹明噁二唑(簡(jiǎn)稱(chēng)RH-MC1)，化學(xué)名稱(chēng)為2-氯甲基-5-[羅丹明 B-9'-(2' 苯甲酰)基]-1，3,4-噁二唑；
本發(fā)明公開(kāi)了氯甲基噁二唑羅丹明熒光探針的制備方法： (1)羅丹明酰肼的制備： 取無(wú)水乙醇（100ml)置于250ml的燒瓶中，將羅丹明B(5g, 10.4mmol)溶解于乙醇。然后 將80%水合肼(8ml，133mmol)在室溫條件下緩慢滴加于混合體系中。滴加完畢后將混合物 加熱回流。當(dāng)溶液由暗紫色逐漸變?yōu)槌吻?，TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢冷卻至室溫，減壓除去部分溶 劑、倒入冰水中，有沉淀產(chǎn)生，抽濾，得到暗黃色固體。
[0010] (2)氯甲基噁二唑羅丹明的制備： 將氯乙酸0.76g(0. lg, 1. lmmol)和三氯氧磷（5 ml)混合，加熱回流0.5-1小時(shí)，之后， 分批加入羅丹明B酰肼(0.5g，1. lmmo 1)，TLC監(jiān)測(cè)，待反應(yīng)完成后將其冷卻，加入少量二氯甲 烷到室溫并倒入冰水混合物中，調(diào)節(jié)pH為8,以二氯甲烷萃取粗產(chǎn)物至無(wú)機(jī)層溶液顏色比有 機(jī)層溶液顏色深時(shí)為止，合并有機(jī)層，以5ml X 2飽和食鹽水洗滌，分離有機(jī)相。用無(wú)水硫酸 鎂干燥并靜置過(guò)夜，濾出干燥劑，減壓旋蒸除去多余溶劑，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20: 1，柱色譜分離，得到目標(biāo)化合物RH-MC1。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了氯甲基噁二唑羅丹明做為熒光探針對(duì)幾種細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo) 記的應(yīng)用 一、細(xì)菌抹片的焚光標(biāo)記方法，可用于焚光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌 ① 稱(chēng)取0.275gRH-MCl溶于100mlpH7.4的PBS緩沖溶液中，配制成濃度為5000uM的探針 母液，將母液用PH7.4的PBS緩沖溶液稀釋成濃度分別為5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、 200uM、500uM、1000uM、2000uM的探針溶液。另配制LB液體培養(yǎng)基100ml備用： ② 從菌種庫(kù)獲得菌種，各取2ul單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌分別接入10mL LB液 體培養(yǎng)基中，在37°C，169轉(zhuǎn)/min，過(guò)夜培養(yǎng)。取3ml菌液加入離心管中，離心，棄去上清液，用 PBS洗滌并重懸菌液。準(zhǔn)備透明，潔凈，無(wú)油漬的載玻片及蓋玻片。用滅菌接種環(huán)溝取重懸菌 液1-2環(huán)，在玻片上做直徑lcm的涂面，涂片在室溫下自然干燥，將干燥好的涂片涂面向上， 在火焰上來(lái)回通過(guò)數(shù)次(一般3次），以手背觸及玻片微燙為宜。
[0012] ③將制備好的單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌抹片各9張放置于載玻片架上，每 張片上分別滴加濃度為5碰、10碰、20碰、50碰、100碰、200碰、500碰、1000碰、2000碰的熒光 探針溶液，室溫下放置20min，用去離子水沖洗至抹片上無(wú)探針溶液。熒光顯微鏡下觀察標(biāo) 記結(jié)果，激發(fā)光為綠光波段，發(fā)射光為紅色，可清晰觀察到熒光標(biāo)記后的細(xì)菌。
[0013] ④將制備好的單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌抹片各8張放置于載玻片架上，每 張片上滴加濃度為100uM的熒光探針溶液，室溫下分別放置0.5min、2min、5min、10min、 15min、20min、25min、30min，用去離子水沖洗至抹片上無(wú)探針溶液。焚光顯微鏡下觀察標(biāo)記 結(jié)果，激發(fā)光為綠光波段，發(fā)射光為紅色，可清晰觀察到熒光標(biāo)記后的細(xì)菌。
[0014] 檢測(cè)的結(jié)果說(shuō)明： RH-MC1熒光探針能夠標(biāo)記單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌。探針的最佳濃度范圍為 50-100uM，最佳標(biāo)記時(shí)間為20min。由圖5、圖6說(shuō)明。
[0015] 二、細(xì)菌懸液的熒光標(biāo)記方法，可用于焚光光譜或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌 ①稱(chēng)取RH-MC1 0.055g溶于100mlpH7.4的PBS緩沖溶液中，配制成濃度為1000uM的探針 母液，將母液用PH7.4的PBS緩沖溶液稀釋成濃度分別為5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、 200碰、400碰、600碰、800碰的探針溶液。另配制1^液體培養(yǎng)基1001111備用。
[0016]②取10ul酵母菌接入50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。分別取3ml菌液加入 10支離心管中，12000 r/min離心3min，棄去上清液，各管分別加入pH7.4的roS緩沖溶液 lml，吹洗細(xì)菌，離心后去掉上清液，重復(fù)吹洗3次。
[0017] ③在10支吹洗后的酵母菌中分別加入濃度為〇(空白對(duì)照）、5uM、10uM、20uM、50uM、 100碰、200碰、400碰、600碰、800碰的冊(cè)-]\?：1探針溶液11111，吹打成細(xì)胞懸液，37°(：水浴放置 20min，12000 r/min離心3min，棄去上清液，各管分別加入pH7.4的PBS緩沖溶液lml，吹洗細(xì) 菌，離心后去掉上清液，重復(fù)吹洗3次。對(duì)此細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光光譜掃描測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā) 波長(zhǎng)500nm，記錄發(fā)射波長(zhǎng)520-650nm區(qū)間的光譜圖，讀最大焚光強(qiáng)度值。
[0018]檢測(cè)的結(jié)果說(shuō)明： (1 )RH-MC1熒光探針能夠?qū)湍妇鰺晒鈽?biāo)記。
[0019] (2)隨著RH-MC1探針濃度從0增加到50uM，細(xì)菌熒光強(qiáng)度值急劇增大，當(dāng)濃度達(dá)到 50uM時(shí)，熒光強(qiáng)度值最大;濃度繼續(xù)增加至800uM，熒光強(qiáng)度變化趨緩并逐漸降低。結(jié)果由圖 11、圖12說(shuō)明。
[0020] (3)RH-MC1熒光探針標(biāo)記細(xì)菌的最佳濃度范圍為20-50UM。
[0021] 本發(fā)明公開(kāi)的熒光標(biāo)記探針及其制備方法及對(duì)細(xì)菌的熒光標(biāo)記方法與現(xiàn)有技術(shù) 相比所具有的積極效果在于： (1)優(yōu)化了羅丹明B類(lèi)熒光染料性能，新型熒光探針引入噁唑雜環(huán)，使羅丹明探針骨架 具有雙熒光團(tuán)的同時(shí)引入N、0雜原子，提供氫鍵位點(diǎn)，改進(jìn)探針熒光量子產(chǎn)率及水溶解性； 引入芐位氯原子，使探針能夠快速進(jìn)入細(xì)菌使細(xì)菌具有熒光標(biāo)記性能。
[0022] (2)新型熒光標(biāo)記探針敏感性強(qiáng)，效率高，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記后容易觀察結(jié)果。 與羅丹明B相比較，標(biāo)記時(shí)間短，所需探針濃度低，對(duì)細(xì)菌的影響小且標(biāo)記效果好。
[0023] (3)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行的熒光標(biāo)記法可應(yīng)用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察以及 熒光光譜法、流式細(xì)胞術(shù)，以便對(duì)細(xì)菌進(jìn)行深入研究。
[0024]
【附圖說(shuō)明】： 圖1、RH-MC1的核磁氫譜； 圖2、RH-MC1的核磁碳譜； 圖3、RH-MC1的飛行時(shí)間質(zhì)譜； 圖4、RH-MC1(濃度為20uM)的熒光光譜； 圖5熒光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的單核增生李斯特菌（白光和熒光對(duì)照）； 圖6熒光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的的銅綠假單胞菌（白光和熒光對(duì)照）； 圖7熒光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的肺炎鏈球菌（白光和熒光對(duì)照）； 圖8焚光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的的枯草芽孢桿菌（白光和焚光對(duì)照）； 圖9熒光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的的志賀氏菌（白光和熒光對(duì)照）； 圖10熒光顯微鏡下RH-MC1標(biāo)記的的酵母菌（白光和熒光對(duì)照）； 圖11、不同濃度的RH-MC1標(biāo)記的酵母菌懸液的熒光光譜，其中探針RH-MC1濃度1-9 依次為0、5、10、20、50、100、200、400、800uM; 圖12、不同濃度的RH-MC1標(biāo)記的酵母菌懸液的熒光強(qiáng)度值； 圖13、幾種細(xì)菌標(biāo)記前后的熒光強(qiáng)度比較； 圖14、氯甲基羅丹明噁二唑的結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其中的氯乙酸、三氯氧磷、羅丹明B均為市售。
[0026] 實(shí)施例1
熒光探針氯甲基噁二唑羅丹明化合物RH-MC1 熒光探針的合成：
(1)羅丹明酰肼的制備： 取無(wú)水乙醇（100ml)置于250ml的燒瓶中，將羅丹明B(5g, 10.4mmol)溶解于乙醇。然后 將80%水合肼(8ml，133mmol)在室溫條件下緩慢滴加于混合體系中。滴加完畢后將混合物 加熱回流。當(dāng)溶液由暗紫色逐漸變?yōu)槌吻?，TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢冷卻至室溫，減壓除去部分溶 劑、倒入冰水中，有沉淀產(chǎn)生，抽濾，得到暗黃色固體。
[0027] (2)氯甲基噁二唑羅丹明的制備： 將氯乙酸0.76g(0. lg, 1. lmmol)和三氯氧磷（5 ml)混合，加熱回流0.5-1小時(shí)，之后， 分批加入羅丹明B酰肼(0.5g，1. lmmo 1)，TLC監(jiān)測(cè)，待反應(yīng)完成后將其冷卻，加入少量二氯甲 烷到室溫并倒入冰水混合物中，調(diào)節(jié)pH為8,以二氯甲烷萃取粗產(chǎn)物至無(wú)機(jī)層溶液顏色比有 機(jī)層溶液顏色深時(shí)為止，合并有機(jī)層，以5ml X 2飽和食鹽水洗滌，分離有機(jī)相。用無(wú)水硫酸 鎂干燥并靜置過(guò)夜，濾出干燥劑，減壓旋蒸除去多余溶劑，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20: 1，柱色譜分離，得到目標(biāo)化合物RH-MC1。熔點(diǎn)：228-230°C ;結(jié)構(gòu)確定見(jiàn)圖1、RH-MC1的核磁氫 譜;圖2、RH-MC1的核磁碳譜。
[0028] 實(shí)施例2 采用上述方法一以l〇〇uM濃度的RH-MC1探針依次對(duì)①肺炎鏈球菌，②枯草芽孢桿菌，③ 志賀氏菌，④酵母菌進(jìn)行了熒光標(biāo)記20min，并在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記結(jié)果。菌種均為南 開(kāi)大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)研究院從合作單位或部門(mén)獲得后自行保藏的菌種。
[0029]檢測(cè)的結(jié)果說(shuō)明： RH-MC1熒光探針可以對(duì)肺炎鏈球菌、單核李斯特菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，銅 綠假單胞菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌及酵母菌等真菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可 以清晰的觀察細(xì)菌的形態(tài)和輪廓。
[0030] 實(shí)施例3 采用上述方法二以濃度為50uM的探針溶液依次對(duì)①肺炎鏈球菌，②單核增生李斯特 菌，③枯草芽孢桿菌，④銅綠假單胞菌，⑤志賀氏菌進(jìn)行了熒光標(biāo)記，并進(jìn)行熒光光譜掃描 測(cè)定熒光強(qiáng)度。菌種均為南開(kāi)大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)研究院從合作單位或部門(mén)獲得后自行保藏 的菌種。
[0031]檢測(cè)的結(jié)果說(shuō)明： RH-MC1熒光探針可以對(duì)肺炎鏈球菌、單核李斯特菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，銅 綠假單胞菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌或陽(yáng)性菌及酵母菌等真菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，經(jīng)熒光分 光度計(jì)掃描，其熒光強(qiáng)度與未標(biāo)記細(xì)菌的熒光強(qiáng)度比較均顯著增高。圖13說(shuō)明。
[0032]上述方法中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑 等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。所用常規(guī)溶液配制方法如下： (1知117.4的1^5溶液配制： A、0.2M Na2HP〇4:稱(chēng)取 71.6g Na2HP〇4-12H2〇,溶于 1000ml 水 B、0.2M NaH2P〇4:稱(chēng)取 31.2g NaH2P〇4-2H2〇,溶于1000ml 水 取A液190ml，B液810ml，混勻即得。
[0033] (2)LB液體培養(yǎng)基： 稱(chēng)取胰蛋白胨10. 〇g，酵母提取物5.0g，氯化鈉10.0g，溶于800.0 mL蒸餾水，NaOH調(diào)pH值 至7.5，加蒸餾水定容至1000.〇111]^，121°(^，高壓滅菌2〇111；[11。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 巧光探針氯甲基嗯二挫羅丹明化合物RH-MCl2. 權(quán)利要求1所述巧光探針氯甲基嗯二挫羅丹明化合物的制備方法，其特征在于按如 下的步驟進(jìn)行： 巧光探針的合成： (1) 羅丹明酷阱的制備：取無(wú)水乙醇置于燒瓶中，將羅丹明B 10.4mmo 1溶解于乙醇，然 后將80%水合阱133mmol在室溫條件下緩慢滴加于混合體系中，滴加完畢后將混合物加熱回 流，TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢冷卻至室溫，減壓除去部分溶劑、倒入冰水中，有沉淀產(chǎn)生，抽濾，得 到暗黃色固體； (2) 氯甲基嗯二挫羅丹明的制備：將氯乙酸l.lmmol和Ξ氯氧憐5 ml混合，加熱回流 0.5-1小時(shí)，之后，分批加入羅丹明B酷阱1. Immol，TLC監(jiān)測(cè)，待反應(yīng)完成后將其冷卻，加入少 量二氯甲燒到室溫并倒入冰水混合物中，調(diào)節(jié)pH為8, W二氯甲燒萃取粗產(chǎn)物至無(wú)機(jī)層溶液 顏色比有機(jī)層溶液顏色深時(shí)為止，合并有機(jī)層，W5ml X 2飽和食鹽水洗涂，分離有機(jī)相，用 無(wú)水硫酸儀干燥并靜置過(guò)夜，濾出干燥劑，減壓旋蒸除去多余溶劑，所得粗品用二氯甲燒/ 甲醇的體積比20:1，柱色譜分離，得到目標(biāo)化合物RH-MC1。3. 權(quán)利要求1所述氯甲基嗯二挫羅丹明化合物在制備細(xì)菌巧光探針標(biāo)記方面的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中的細(xì)菌包括:肺炎鏈球菌，單核增生李斯特菌，枯草芽抱 桿菌，銅綠假單胞菌，志賀氏菌，酵母菌。5. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中巧光探針對(duì)幾種細(xì)菌巧光標(biāo)記的兩種方法如下： (1)細(xì)菌抹片的巧光標(biāo)記方法： ①稱(chēng)取畑-MCI 0.275g溶于100mlpH7.4的PBS緩沖溶液中，配制成濃度為5000UM的探針 母液，將該母液用pH7.4的PBS緩沖溶液稀釋成濃度分別為5uM、10uM、20uM、50uM、lOOuM、 200uM、500uM、1000uM、2000uM的探針溶液；另配制LB液體培養(yǎng)基500ml備用;②從菌種庫(kù)獲 得菌種，各取化1接入lOmL LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C，169轉(zhuǎn)/min，過(guò)夜培養(yǎng);取1ml菌液加入 1.5ml離屯、管中，離屯、，棄去上清液，用PBS洗涂并重懸菌液;準(zhǔn)備透明、潔凈、無(wú)油潰的載玻 片及蓋玻片；用滅菌接種環(huán)溝取重懸菌液1-2環(huán)，在玻片上做直徑1cm的涂面，涂片在室溫下 自然干燥，將干燥好的涂片涂面向上，在火焰上來(lái)回通過(guò)3次； ③ 將制備好的單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌抹片各9張放置于載玻片架上，每張片 上分別滴加濃度為加]?、10碰、20碰、50碰、100碰、200碰、500碰、1000碰、2000碰的巧光探針 溶液，室溫下放置20min，用去離子水沖洗至抹片上無(wú)探針溶液，巧光顯微鏡下觀察標(biāo)記結(jié) 果，激發(fā)光為綠光波段，可清晰觀察到巧光標(biāo)記后的細(xì)菌，探針最佳濃度為50-lOOuM; ④ 將制備好的單核增生李斯特菌、銅綠假單胞菌抹片各則長(zhǎng)放置于載玻片架上，每張片 上滴加濃度為lOOuM的巧光探針溶液，室溫下分別放置0.5min、2min、5min、10min、15min、 2〇111111、25111111、3〇111111，用去離子水沖洗至抹片上無(wú)探針溶液，巧光顯微鏡下觀察標(biāo)記結(jié)果， 激發(fā)光為綠光波段，可清晰觀察到巧光標(biāo)記后的細(xì)菌，最佳標(biāo)記時(shí)間為20min; ⑤用濃度為lOOuM的探針溶液依次對(duì)肺炎鏈球菌，枯草芽抱桿菌，志賀氏菌，酵母菌進(jìn) 行了巧光標(biāo)記，巧光顯微鏡下觀察標(biāo)記結(jié)果，激發(fā)光為綠光波段，可清晰觀察到巧光標(biāo)記后 的細(xì)菌； 此標(biāo)記方法也可用于共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)菌的觀察； (2)細(xì)菌懸液的巧光標(biāo)記方法： ① 稱(chēng)取畑-MCI 0.055g溶于100mlpH7.4的PBS緩沖溶液中，配制成濃度為lOOOuM的探針 母液，將母液用pH7.4的PBS緩沖溶液稀釋成濃度分別為5uM、10uM、20uM、50uM、lOOuM、 200碰、400碰、600碰、800碰的探針溶液;另配制1^8液體培養(yǎng)基5001111備用； ② 取lOul酵母菌接入50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)； 分別取3ml菌液加入10支離屯、管中，12000r/min離屯、3min，棄去上清液，各管分別加入 pH7.4的PBS緩沖溶液1ml，吹洗細(xì)菌，離屯、后去掉上清液，重復(fù)吹洗3次； ③ 在10支吹洗后的酵母菌懸液樣品中分別加入濃度為0 (空白對(duì)照）、5uM、1 OuM、20uM、 50uM、100uM、200uM、400uM、600uM、800uM 的畑-MCI 探針溶液 1ml，吹打成細(xì)胞懸液，37°C 水浴 放置20min，1200化/min離屯、3min，棄去上清液，各管分別加入抑7.4的PBS緩沖溶液1ml，吹 洗細(xì)菌，離屯、后去掉上清液，重復(fù)吹洗3次，對(duì)此細(xì)胞懸液進(jìn)行巧光光譜掃描，激發(fā)波長(zhǎng) 500nm，記錄發(fā)射波長(zhǎng)520-650nm區(qū)間的光譜圖，讀取最大巧光強(qiáng)度值； 最佳探針濃度范圍為20-50UM; ④ 用濃度為50uM的探針溶液依次對(duì)肺炎鏈球菌，單核增生李斯特菌，枯草芽抱桿菌，銅 綠假單胞菌，志賀氏菌進(jìn)行了巧光標(biāo)記，并進(jìn)行巧光光譜掃描測(cè)定巧光強(qiáng)度，此標(biāo)記方法也 可應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌性能。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105968105SQ201610381014
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】尹春燕, 樊麗, 史學(xué)芳
【申請(qǐng)人】南開(kāi)大學(xué)