慢滴加103mg5-甲基異惡唑-4-甲酰氯溶于5ml的二氯甲烷溶液，滴加完畢后，自然緩慢 升至室溫反應(yīng)5h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束。加20ml水淬滅反應(yīng)，分液萃取，水相用二氯甲烷洗 滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯/正己烷=1/1體系洗脫， 控溫在20°C以下旋干得100mg產(chǎn)物，收率為58%，低溫保存。MS(Tof，ES+) :145. 2,258. 1， 259. 1,280. 0。
[0125] 方法實(shí)施例2制備化合物2
[0126] 分別稱取100mg4-甲氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶，16mgDMAP于三口燒瓶中， 加入20ml二氯甲烷攪拌溶解，冷卻至-20°C左右，滴加100mg三乙胺于反應(yīng)液中。然后緩慢 滴加112mg5-甲基異惡唑-4-乙酰氯溶于5ml的二氯甲烷溶液，滴加完畢后，自然緩慢升 至室溫反應(yīng)5h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束。加20ml水淬滅反應(yīng)，分液萃取,水相用二氯甲燒洗滌 3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯/正己烷=1/1體系洗脫，控 溫在20°C以下旋干得110mg產(chǎn)物，收率為60%，低溫保存。1HNMR(DMS0-D6,400MHz) :δ8. 94 (1Η,s), 8. 21 (1H,s), 7. 85 (1H,s), 7. 68 (1H,d), 6. 92 (1H,d), 3. 15 (2H,s), 2. 95 (3H,d), 2. 61(3H,s)。
[0127] 方法實(shí)施例3制備化合物3
[0128] 分別稱取100mg4-乙氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶，15mgDMAP于三口燒瓶中， 加入20ml二氯甲烷攪拌溶解，冷卻至-20°C左右，滴加lOOmg三乙胺于反應(yīng)液中。然后緩慢 滴加94mg5-甲基異惡唑-4-甲酰氯溶于5ml的二氯甲烷溶液，滴加完畢后，自然緩慢升至 室溫反應(yīng)5h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束。加20ml水淬滅反應(yīng)，分液萃取，水相用二氯甲燒洗滌3 次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯/正己烷=1/1體系洗脫，控 溫在20°C以下旋干得95mg產(chǎn)物，收率為57%，低溫保存。1HNMR(DMS0-D6, 400MHz) :δ8. 8 5 (1Η,s), 8. 16 (1H,s),7. 87 (1H,s),7. 65 (1H,d), 6. 85 (1H,d),2. 95 (2H,q),2. 62 (3H,s),L2 2 (3H,t)。
[0129] 方法實(shí)施例4制備化合物4
[0130]分別稱取100mg4-乙氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶，15mgDMAP于三口燒瓶中， 加入20ml二氯甲烷攪拌溶解，冷卻至-20°C左右，滴加lOOmg三乙胺于反應(yīng)液中。然后緩慢 滴加103mg5-甲基異惡唑-4-乙酰氯溶于5ml的二氯甲烷溶液，滴加完畢后，自然緩慢升 至室溫反應(yīng)5h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束。加20ml水淬滅反應(yīng)，分液萃取,水相用二氯甲燒洗滌 3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯/正己烷=1/1體系洗脫，控 溫在20°C以下旋干得102mg產(chǎn)物，收率為58%，低溫保存。1HNMR(DMS0-D6, 400MHz) :δ8. 9 2 (1Η,s),. 21 (1H,s), 7. 82 (1H,s), 7. 71 (1H,d), 6. 92 (1H,d), 3. 18 (2H,s), 2. 98 (2H,q), 2. 61 (3H,s), 1. 24 (3H,t).
[0131] 表二給出了結(jié)構(gòu)式如式2所示的化合物的實(shí)施例
[0135] 實(shí)施例5制備化合物5
[0136] 稱取100mg化合物1于三口燒瓶中，加入30ml甲醇攪拌溶解，冷卻至0°C，緩慢滴 加lml飽和碳酸氫鈉水溶液，滴加完畢后，在此溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié) 束。減壓蒸除甲醇，加入20ml水，分液萃取，水相用二氯甲烷洗滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水 NaS04干燥，硅膠柱層析分離，甲醇/二氯甲烷=1/20體系洗脫，得到9. 8mg產(chǎn)物，收率為 9. 8%〇
[0137] 4匪1?(0)(：13, 400MHz) :δ9. 68(1H,s), 8. 73(1H,s), 7. 41 (1H,s), 7. 68(1H,d), 7. 31 (1H,q), 6. 30 (1H,q), 3. 65 (3H,s), 2. 59 (3H,s).
[0138] 方法實(shí)施6制備化合物6
[0139] 稱取lOOmg化合物2于三口燒瓶中，加入30ml甲醇攪拌溶解，冷卻至0°C，緩慢滴 加lml飽和碳酸氫鈉水溶液，滴加完畢后，在此溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié) 束。減壓蒸除甲醇，加入20ml水，分液萃取，水相用二氯甲烷洗滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水 NaS04干燥，硅膠柱層析分離，甲醇/二氯甲烷=1/20體系洗脫，得到10. 5mg產(chǎn)物，收率為 10.5%。蟲NMR(CDC13,400MHz) :δ9.71 (lH，s), 8.74 (lH，s), 7.43 (lH，s), 7.65 (lH，d), 7. 3 4 (1H,q), 6. 28 (1H,q), 3. 65 (3H,s), 2. 92 (2H,s), 2. 59 (3H,s).
[0140] 實(shí)施例7制備化合物7
[0141] 稱取90mg化合物3于三口燒瓶中，加入30ml甲醇攪拌溶解，冷卻至0°C，緩慢滴加 lml飽和碳酸氫鈉水溶液，滴加完畢后，在此溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束。 減壓蒸除甲醇，加入20ml水，分液萃取，水相用二氯甲烷洗滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04 干燥，硅膠柱層析分離，甲醇/二氯甲烷=1/20體系洗脫，得到8. 6mg產(chǎn)物，收率為9. 6%。 蟲NMR(CDC13,400MHz):δ9. 68 (1H,s)，8. 73 (1H,s)，7. 41 (1H,s)，7. 68 (1H,d)，7. 31 (1H,q)， 6. 30 (1H,q), 3. 04 (2H,q), 2. 59 (3H,s), 1. 22 (3H,t).
[0142] 實(shí)施例8制備化合物8
[0143]稱取lOOmg化合物4于三口燒瓶中，加入30ml甲醇攪拌溶解，冷卻至0°C，緩慢滴 加lml飽和碳酸氫鈉水溶液，滴加完畢后，在此溫度下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié) 束。減壓蒸除甲醇，加入20ml水，分液萃取，水相用二氯甲烷洗滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水 NaS04干燥，硅膠柱層析分離，甲醇/二氯甲烷=1/20體系洗脫，得到11. 6mg產(chǎn)物，收率為 11.6%。蟲NMR(CDC13, 400MHz) :δ9.69 (lH，s), 8.71 (lH，s), 7.45 (lH，s), 7.69 (lH，d), 7. 2 8 (1H,q), 6. 34 (1H,q), 3. 02 (2H,q), 2. 94 (2H,s), 2. 62 (3H,s), 1. 24 (3H,t).
[0144] 實(shí)施例9藥物對(duì)絲裂原ConA和α⑶3/⑶28抗體誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖抑制能力
[0145] 本實(shí)驗(yàn)旨在觀察受試化合物CD-J-1 (化合物1)和CD-J-2 (化合物5)的體外免疫 抑制活性，所用陽(yáng)性對(duì)照為CK8。CK8為來(lái)氟米特活性代謝物的鈉鹽（泰瑞米特鈉），體外具 有較強(qiáng)的免疫抑制活性。
[0146] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡C57BL/6和BALB/c純系小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)上海斯萊克實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。
[0147] 小鼠脾細(xì)胞的制備：C57BL/6或BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡3分鐘， 取出小鼠置于無(wú)菌紙上，剪開小鼠腹部皮膚和腹膜，無(wú)菌鑷子取出脾臟放入盛有5mLPBS的 培養(yǎng)皿中。將分離好的脾臟放置在尼龍指套中，以無(wú)菌注射器內(nèi)芯輕輕研磨（同一方向）， 獲得細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液并離心后，棄上清，加入3mL左右的ACK，混勻，室溫放置3~ 4分鐘以破除紅細(xì)胞，以PBS清洗兩遍，離心所得即為小鼠脾細(xì)胞。
[0148] 實(shí)驗(yàn)試劑的制備：
[0149] (1)CK8(分子量 310. 2,使用濃度 500uM，即 0· 16mg/mL) :a)64mgCK8 溶于 1000uL DMS0中，濃度為0. 064mg/uL;b)40uLCK8溶液溶于4mL1640完全培養(yǎng)基中，濃度為 0. 64mg/mL，每孔加入50uL;c) 2mL濃度為0. 64mg/mL的CK8溶液溶于2mL1640完全培養(yǎng)基 中，濃度為〇. 32mg/mL，