本發(fā)明提供了一種基于數(shù)據(jù)庫基因挖掘方法獲得的磷脂酶d及其應(yīng)用方法，屬于工業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：磷脂酶d(pld)是一類催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的酶的總稱，主要底物是磷脂酰膽堿(pc)，pld可以將pc水解生成磷脂酸(pa)和膽堿，而利用其轉(zhuǎn)磷脂?；盍芍苽湓S多功能良好的稀有磷脂和磷脂衍生物，在食品、醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。磷脂酶d來源廣泛，最早報道其來源于白菜葉中，隨后在其他動、植物及微生物中發(fā)現(xiàn)，酵母、細(xì)菌中等克隆獲得pld也有相關(guān)報道。植物中磷脂酶d主要存在于種子、根和葉中；動物來源主要分布在腦、肝臟中。與其他來源的磷脂酶d相比，微生物磷脂酶d具有較強(qiáng)的底物耐受性，較寬的底物專一性和較高的堿基交換反應(yīng)催化活性，更適合于工業(yè)應(yīng)用。至今已報導(dǎo)的產(chǎn)磷脂酶d的微生物主要有鏈霉菌、棒狀桿菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌以及假單孢菌等。其中，磷脂酶d在鏈霉菌中分布最為廣泛，報導(dǎo)也最多。國外對pld的研究一直處于領(lǐng)先水平，國外成功篩選并利用基因重組等方法改造出高產(chǎn)pld的生物菌株，利于工業(yè)生產(chǎn)，少數(shù)酶制劑公司已開發(fā)出具有較高酶活力的pld，國內(nèi)對微生物發(fā)酵產(chǎn)pld的研究起步較晚，酶活較低，目前主要依賴進(jìn)口，但價格非常昂貴。研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)的pld酶制劑具有現(xiàn)實意義，菌株篩選是其中的一個重要環(huán)節(jié)。磷脂酰絲氨酸(ps)是磷脂的一種，天然含量較少，但它是大腦中主要的酸性磷脂，能控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白的功能狀態(tài)。ps占細(xì)胞膜雙分子層磷脂的10％-20％，對中樞神經(jīng)作用顯著，能提高腦細(xì)胞的活力，改善大腦功能、修復(fù)大腦損傷，成為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”，逐漸引起人們廣泛關(guān)注。磷脂酰絲氨酸制備方法主要包括提取法，化學(xué)合成法和生物酶轉(zhuǎn)化法。提取法主要指從植物細(xì)胞、動物的大腦和內(nèi)臟中直接提取磷脂酰絲氨酸。相關(guān)研究顯示植物組織中磷脂酰絲氨酸的含量非常少，提取法主要以動物組織如大腦和內(nèi)臟等為主。提取法利用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，操作簡單，但是純度和產(chǎn)率低，污染大，且由于瘋牛病的原因，提取的ps還有一定的安全性問題；化學(xué)合成法主要指通過以甘油為主要原料經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)合成ps，此方法得到的產(chǎn)品純度高，安全性好，但是合成步驟繁瑣且副產(chǎn)物較多。近年來，生物酶轉(zhuǎn)化法逐漸受到大家的重視。酶轉(zhuǎn)化法是指在磷脂酶d的催化作用下，底物卵磷脂和絲氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)，生成磷脂酰絲氨酸。該方法具有條件溫和，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，低碳環(huán)保，產(chǎn)率高等優(yōu)點，是制備大量磷脂酰絲氨酸的理想方法。雖然，國內(nèi)外報道了酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法，但是大多為野生菌，發(fā)酵時間長，且對酶的性質(zhì)不夠了解，從而影響了酶催化合成磷脂酰絲氨酸的效率，因此磷脂酶d基因的克隆表達(dá)及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)，對其實際應(yīng)用及作用機(jī)理研究顯得非常重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于基因挖掘獲得的磷脂酶d及其基因編碼序列與應(yīng)用方法。提供包括本發(fā)明基因的質(zhì)粒及包含該表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，以及利用該重組菌株表達(dá)生產(chǎn)磷脂酶d的方法。通過數(shù)據(jù)庫基因挖掘技術(shù)篩選獲得磷脂酶d基因。以具有較高轉(zhuǎn)磷脂?；盍α字竏的氨基酸序列為模板，在ncbi數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對分析，根據(jù)設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得目的磷脂酶d基因，根據(jù)基因序列設(shè)計引物通過pcr技術(shù)擴(kuò)增獲得編碼基因序列，電泳鑒定后回收純化pcr產(chǎn)物并克隆至pmd19-t載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colijm109，挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子至lb液體培養(yǎng)基中(ampr)37℃，220rpm培養(yǎng)10～12h，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切、pcr驗證。將驗證正確的重組質(zhì)粒經(jīng)bamhi和hindiii雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行連接，選擇的載體質(zhì)粒包括pet系列，pma5，pwb系列，ppiczα，pic9k，pdw系列等。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸感受態(tài)細(xì)胞中，但不局限于大腸桿菌，還包括絲狀真菌，枯草芽孢桿菌，谷氨酸棒桿菌，鈍齒棒桿菌，畢赤酵母，釀酒酵母等，經(jīng)培養(yǎng)后實現(xiàn)磷脂酶d的高效表達(dá)。(1)數(shù)據(jù)庫基因挖掘技術(shù)篩選磷脂酶d基因根據(jù)已報道磷脂酶d外源表達(dá)文獻(xiàn)，選擇轉(zhuǎn)磷脂?；盍^高的磷脂酶d的氨基酸序列作為模板，在ncbi數(shù)據(jù)庫中blast，根據(jù)設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析篩選獲得目的磷脂酶d的氨基酸序列，從而得到其編碼基因序列。(2)pcr擴(kuò)增磷脂酶d基因以經(jīng)合成的核苷酸序列設(shè)計引物(p1、p2)，通過pcr擴(kuò)增磷脂酶d的編碼基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr擴(kuò)增反應(yīng)在50μl體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反應(yīng)條件為在94℃預(yù)變性3min后開始循環(huán)：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定并割膠回收純化，回收產(chǎn)物克隆至pmd19-t載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colijm109，挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子至lb液體培養(yǎng)基中(ampr)37℃，220rpm培養(yǎng)10～12h，提取質(zhì)粒后對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、pcr驗證，驗證正確的進(jìn)行序列測定。(3)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本研究以pet-28a(+)為例開展重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，該質(zhì)粒帶有t7啟動子和6×his-tag標(biāo)簽，將pet-28a(+)質(zhì)粒和驗證正確的含有目的基因的重組克隆質(zhì)粒同時用bamhi和hindiii進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后進(jìn)行核酸電泳驗證并割膠回收目的基因和目的質(zhì)粒，回收產(chǎn)物用t4dna連接酶在16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至e.colijm109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固體培養(yǎng)中培養(yǎng)8～10h，挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)10～12h后提取質(zhì)粒并命名為pet-28a(+)-pld。(4)重組表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選本研究以大腸桿菌為例，研究將重組質(zhì)粒pet-28a(+)-pld經(jīng)42℃熱擊90s轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～10h，通過pcr驗證篩選陽性轉(zhuǎn)化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接種至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日按1％接種量接種于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鮮lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約3h，od600為1.0時加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mm，25℃誘導(dǎo)12h后，重組菌表現(xiàn)出磷脂酶d活性。(5)重組磷脂酶d的westernblot分析將上述獲得的重組菌發(fā)酵液在4℃，8,000rpm條件下離心20min，去掉上清收集菌體沉淀，菌體用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液清洗一遍去除雜質(zhì)，8,000rpm離心10min，再次去掉上清收集菌體沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液懸浮，制備成菌懸液。將菌懸液在置于冰水浴中利用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎，條件為：200w功率下工作200個循環(huán)，每個循環(huán)工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm條件下離心20min，所得上清即為粗酶液。通過bca蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠后，取80μl樣品加入20μl5xloadingbuffer，充分混勻后于沸水浴中放置5min使蛋白變性。根據(jù)測定蛋白的濃度進(jìn)行上樣，并加入marker。上層濃縮膠用80v電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(約30min)，用100v電壓，當(dāng)樣品至分離膠底部約1cm處關(guān)閉電源，電泳結(jié)束。結(jié)束后用蒸餾水沖洗干凈，在電流作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。轉(zhuǎn)移完畢后進(jìn)行封閉，孵育一抗和二抗，最后進(jìn)行顯色拍照以確認(rèn)目的蛋白的表達(dá)情況。(6)重組磷脂酶d的酶學(xué)性質(zhì)研究a.重組磷脂酶d最適ph及ph穩(wěn)定性研究取適量酶液，分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)進(jìn)行反應(yīng)，測定不同ph下的酶活力，以最大酶活為100％，以確定該酶的最適作用ph。另取新鮮酶液分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)放置60min，回調(diào)至ph8.0后，再按照標(biāo)準(zhǔn)測定酶活的方式測定殘余酶活，以確定該酶的ph穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶液作為100％。b.重組磷脂酶d最適溫度及溫度穩(wěn)定性研究取適量酶液，分別在20℃至80℃范圍內(nèi)選擇溫度點(間隔5℃)，測定其在不同溫度下的酶活力，以最大酶活為100％，以確定該酶的最適作用溫度。另取新的酶液，分別保溫于上述不同溫度中60min后立即冷卻，按照標(biāo)準(zhǔn)測定酶活的方式測定殘存酶活，以確定該酶的溫度穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶液作為100％。c.金屬離子對重組磷脂酶d酶活的影響取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在適當(dāng)稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，以未添加金屬離子的酶液活力作為100％。d.蛋白抑制劑對重組磷脂酶d酶活的影響取蛋白抑制劑：β-巰基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在適當(dāng)稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，以未處理的酶液活力為100％。(7)重組磷脂酶d在催化合成磷脂酰絲氨酸中的應(yīng)用利用重組磷脂酶的催化合成磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)體系包括有機(jī)相和水相兩部分，有機(jī)相：8ml溶有10mg/mlpc60的乙酸乙酯；水相：4ml溶有30mg/mll-絲氨酸、15mmcacl2的粗酶液，將有機(jī)相和水相充分混合均勻后于40℃，180rpm條件下反應(yīng)10h。通過hplc檢測產(chǎn)物中的磷脂酰絲氨酸的合成。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明提供了一種磷脂酶d基因及其高效表達(dá)，它具有seqidno:1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的氨基酸序列，全長1,614bp，編碼538個氨基酸，以質(zhì)粒pet28a(+)為表達(dá)載體，以大腸桿菌e.colibl21(de3)為表達(dá)宿主，實現(xiàn)了磷脂酶d基因的高效表達(dá)，重組菌株e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld表現(xiàn)出磷脂酶d活性，能催化底物磷脂酰膽堿和l-絲氨酸合成磷脂酰絲氨酸，在食品、醫(yī)藥和保健行業(yè)具有較大的應(yīng)用前景，且重組菌發(fā)酵周期短，適合于工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。附圖說明圖1pcr擴(kuò)增磷脂酶d編碼基因核酸電泳圖譜m：5,000bpdnamarker；泳道1：擴(kuò)增得到的磷脂酶d基因。圖2重組磷脂酶d的westernblot分析m：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；圖示smpld為目的蛋白磷脂酶d。圖3磷脂酶d的最適ph及ph穩(wěn)定性圖4磷脂酶d的最適溫度及溫度穩(wěn)定性圖5磷脂酶d催化合成磷脂酰絲氨酸的hplc檢測結(jié)果a：ps標(biāo)樣；b：ps樣品。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限制。實施例1本實例說明基于數(shù)據(jù)庫基因挖掘技術(shù)篩選磷脂酶d的方法。根據(jù)已報道磷脂酶d外源表達(dá)文獻(xiàn)，選擇經(jīng)實驗驗證過的轉(zhuǎn)磷脂?；盍^高的磷脂酶d的氨基酸序列作為模板，在ncbi數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast，根據(jù)已設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，獲得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析篩選獲得目的磷脂酶d的氨基酸序列，從而得到其編碼基因序列。實施例2本實施例說明磷脂酶d編碼基因的克隆方法。以經(jīng)合成的核苷酸序列設(shè)計引物(p1、p2)，通過pcr擴(kuò)增磷脂酶d的編碼基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr擴(kuò)增反應(yīng)在50μl體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反應(yīng)條件為在94℃預(yù)變性3min后開始循環(huán)：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定并割膠回收純化，回收產(chǎn)物克隆至pmd19-t載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colijm109，挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子至lb液體培養(yǎng)基中(ampr)37℃，220rpm培養(yǎng)10～12h，提取質(zhì)粒后對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、pcr驗證，驗證正確的進(jìn)行序列測定。核酸電泳結(jié)果顯示磷脂酶d基因序列得到有效擴(kuò)增(圖1)。實施例3本實施例以pet-28a(+)為例說明重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程。pet-28a(+)帶有t7啟動子和6×his-tag標(biāo)簽，將pet-28a(+)質(zhì)粒和驗證正確的含有目的基因的重組克隆質(zhì)粒同時用bamhi和hindiii進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后進(jìn)行核酸電泳驗證并割膠回收目的基因和目的質(zhì)粒，回收產(chǎn)物用t4dna連接酶在16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至e.colijm109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固體培養(yǎng)中培養(yǎng)8～10h，挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)10～12h后提取質(zhì)粒并命名為pet-28a(+)-pld。實施例4本實施例以大腸桿菌為例說明重組表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選方法。將重組質(zhì)粒pet-28a(+)-pld經(jīng)42℃熱擊90s轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～10h，通過pcr驗證篩選陽性轉(zhuǎn)化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接種至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日按1％接種量接種于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鮮lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約3h，od600為1.0時加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mm，25℃誘導(dǎo)12h后，重組菌表現(xiàn)出磷脂酶d活性。實施例5本實施例說明磷脂酶d的westernblot分析過程。將上述獲得的重組菌發(fā)酵液在4℃，8,000rpm條件下離心20min，去掉上清收集菌體沉淀，菌體用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液清洗一遍去除雜質(zhì)，8,000rpm離心10min，再次去掉上清收集菌體沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液懸浮，制備成菌懸液。將菌懸液在置于冰水浴中利用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎，條件為：200w功率下工作200個循環(huán)，每個循環(huán)工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm條件下離心20min，所得上清即為粗酶液。通過bca蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠后，取80μl樣品加入20μl5xloadingbuffer，充分混勻后于沸水浴中放置5min使蛋白變性。根據(jù)測定蛋白的濃度進(jìn)行上樣，并加入marker。上層濃縮膠用80v電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(約30min)，用100v電壓，當(dāng)樣品至分離膠底部約1cm處關(guān)閉電源，電泳結(jié)束。結(jié)束后用蒸餾水沖洗干凈，在電流作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。轉(zhuǎn)移完畢后進(jìn)行封閉，孵育一抗和二抗，最后進(jìn)行顯色拍照以確認(rèn)目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示磷脂酶d能夠清晰表達(dá)，且分子量大小約為60kda(圖2)。實施例6本實施例說明磷脂酶d的催化特征。(1)分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)進(jìn)行反應(yīng)，測定不同ph下的酶活力，該酶的最適反應(yīng)ph為7.5，在ph6.5～8.5范圍內(nèi)能達(dá)到最高酶活的75％～100％。另取新鮮酶液分別在上述緩沖液中放置60min，回調(diào)至ph8.0后，按照標(biāo)準(zhǔn)測定酶活的方式測定殘存酶活，該重組磷脂酶d在ph6.5～8.5的條件下表較穩(wěn)定，可以保持70％左右的相對酶活(圖3)。(2)取適量酶液，分別在20℃至80℃范圍內(nèi)選擇溫度點(間隔5℃)，測定其在不同溫度下的酶活力，該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃。另取新鮮酶液分別保溫于上述不同溫度中60min后立即冷卻，按照標(biāo)準(zhǔn)測定酶活的方式測定殘存酶活，該酶在20～55℃條件下酶活相對穩(wěn)定，可以維持65％以上的相對酶活(圖4)。(3)取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在適當(dāng)稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，結(jié)果如表1所示，與未添加任何金屬離子的空白對照組相比，na+、mn2+和mg2+并未表現(xiàn)出明顯促進(jìn)作用；ba2+，co2+和ca2+對酶活有著明顯的促進(jìn)作用，其中ca2+促進(jìn)作用最明顯，相對酶活達(dá)到134.1％；另外，k+、cu2+、li+、fe3+、al3+和zn2+有著較小的促進(jìn)作用；而fe2+和ag+對磷脂酶d酶活有著明顯的抑制作用。表1金屬離子對酶活的影響試劑相對酶活(％)試劑相對酶活(％)對照組100±0.6mn2+101.7±1.5k+105.2±1.5li+107.6±0.8mg2+101.1±0.3fe3+105.9±2.1ba2+118.2±1.5fe2+56.0±2.2ca2+134.1±0.2ag+27.0±1.2co2+117.8±1.8zn2+109.7±0.6na+101.5±1.2al3+109.3±2.4cu2+108.2±0.6(4)取蛋白抑制劑：β-巰基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在適當(dāng)稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，結(jié)果如表2所示，2-me、dtt、sds和pmsf對磷脂酶d有著一定的抑制作用，而edta對該酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。表2蛋白抑制劑對酶活的影響試劑濃度(mm)相對酶活(％)none0100±0.32-me575±0.9dtt580±1.1sds550±2.1pmsf540±0.3edta56±0.6實施例7本實施例說明重組磷脂酶d進(jìn)行磷脂酰絲氨酸合成試驗。稱取80mgpc60溶解于8ml乙酸乙酯中，稱取120mgl-絲氨酸和6.66mgcacl2溶解于4ml磷脂酶d粗酶液中，將有機(jī)相和水相充分混合均勻后于40℃，180rpm條件下反應(yīng)10h。結(jié)果如圖5所示，在重組磷脂酶d催化作用下，在14.2min可以看到有磷脂酰絲氨酸生成，經(jīng)計算磷脂酰絲氨酸的產(chǎn)量為0.2g/l，而在空白對照組中并沒有看到有磷脂酰絲氨酸的生成，說明該重組磷脂酶d具有催化底物磷脂酰膽堿和l-絲氨酸合成磷脂酰絲氨酸的能力，在食品、醫(yī)藥和保健行業(yè)具有較大的應(yīng)用前景，且重組菌發(fā)酵周期短，適合于工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。本發(fā)明不限于這些公開的實施例，本發(fā)明將覆蓋技術(shù)方案所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變形和等效變化，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何修改或改進(jìn)均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。seqidno：1seqdnaman1:1614bp;composition347a;435c;484g;348t;0otherpercentage:21.5%a;27.0%c;30.0%g;21.6%t;0.0%othermolecularweight(kda):ssdna:499.35dsdna:995.14origin1ctgctgcgtcgcctgcatcgtctgacccgtcgcgcaacggtgtccgcagttctgctggca61ctgctgccggcaggtccggctctggcagcaggtgacgcaccgggtgccccgcacctggat121gcggttgaacgtaccctgcgtcaggtctcaccgggtctggaaggtgacgtttggcaacgt181acggagggtaacaaactggatgccagcgcagctgacccgtctgattggctgctgcagacc241ccgggttgctggggtgatgcacattgtgctgaacgtccgggcaccaaacgcctgctggct301aaaatgacggaaaatatttctcgcgcacgtcgcaccgtggatatcagtacgctggcgccg361tttccggacggtgctttccaggatgcgattgcggccggcctgaaagcgagtgttgcctcc421ggtaacaaaccgcgtgtgcgtgttctggtcggcgcagctccgctgtatcacctgaatgtg481cgtccgagcgcctacctggatgacctgcgtgcacgtctgggtaccgcagcagatgcagtt541acgctgaacgtcgcatctatgaccacgagtaaaaccgcgttttcctggaatcattcaaaa601ctgctggttgtggacggcgaaagcgccattacgggcggtatcaacgattggaaaaatgac661tatgttgataccgcacacccggtcacggatgtggacctggcactgaccggtccggcagct721tcgacggcaggtcgctatctggataccctgtggggctggacgtgcggcaacaaaggtaat781atcgcgagcgtgtggtacgcagcatcggcaggtgcaagctgtatggccgatctggaaaaa841gaagccaacccgaaaccggcaggtccgaccggtaatgtgccggttattgcggtgggcggt901ctgggcgttggtatcaaagataaagacgcaagctctgcttatcgtccggaactgccgtct961gcaccggacaccaaatgcgtcgtgggcctgcatgataacaccaatgccgatcgtgactac1021gatacggtgaacccggaagaatcagcactgcgtgccctggtgggttcggcagaaaaacat1081gttgaaattagccagcaagatctgcacgctacctgtccgccgatcgcgaaatatgacgtt1141cgcctgtacgatacgctggcgaagaaaattgcatccggtgtcaaagtgcgtatcgttgtc1201tcagatccggcaaaccgtggtaccgtgggttctggcggttatagtcagattaaatccctg1261acggaaatctctgacgtcctgcgtaatcgtctggcactggtgaccggcggtcaggatcaa1321gcaaaaaacgctctgtgcagtaatgtgcagctggcttcattccgctcggcaaaaagcccg1381acctgggctgacggtcacgcatatccgctgcatcacaaactggtttcagtcgatggctcg1441gcgttttatgttggtagtaaaaatctgtacccgtcctggctgcaggacttcggctacatt1501gtcgaagatcgtaccgcagctggtcaactggatgccaaactgctggcaccggaatgggaa1561tatgctcaggacaccgcgatcgtcgattaccaacgcggtgtgtgtagtctgtaaseqidno：2universalcodetotalaminoacidnumber:5381mlrrlhrltrratvsavllallpagpalaagdapgaphldavertlrqvspglegdvwqr61tegnkldasaadpsdwllqtpgcwgdahcaerpgtkrllakmtenisrarrtvdistlap121fpdgafqdaiaaglkasvasgnkprvrvlvgaaplyhlnvrpsaylddlrarlgtaadav181tlnvasmttsktafswnhskllvvdgesaitggindwkndyvdtahpvtdvdlaltgpaa241stagryldtlwgwtcgnkgniasvwyaasagascmadlekeanpkpagptgnvpviavgg301lgvgikdkdassayrpelpsapdtkcvvglhdntnadrdydtvnpeesalralvgsaekh361veisqqdlhatcppiakydvrlydtlakkiasgvkvrivvsdpanrgtvgsggysqiksl421teisdvlrnrlalvtggqdqaknalcsnvqlasfrsaksptwadghayplhhklvsvdgs481afyvgsknlypswlqdfgyivedrtaagqldakllapeweyaqdtaivdyqrgvcsl當(dāng)前第1頁12