一種新型磷脂酶d及其制備磷脂酸、磷脂酰絲氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷脂酶D突變體及其制備與應(yīng)用。其技術(shù)方案是利用重組DNA技術(shù)對野生型磷脂酶D基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到活力較高的磷脂酶D基因，然后將高活力磷脂酶D基因在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(包括畢赤酵母游離表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng))中表達(dá)，得到產(chǎn)高活力磷脂酶D的重組菌株，表達(dá)后，檢測高活力磷脂酶D的比酶活較野生型磷脂酶D提高38?140％，高活力磷脂酶D在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表面展示系統(tǒng)內(nèi)發(fā)酵酶活最高值分別為36.8U/ml、48.1U/ml、140.2U/(g·細(xì)胞干重)。
【專利說明】
一種新型磷脂酶D及其制備磷脂酸、磷脂酰絲氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過重疊 PCR技術(shù)體外定向進(jìn)化獲 得比酶活提高的磷脂酶D突變體，并提供由高活力磷脂酶D催化制備磷脂酸和磷脂酰絲氨酸 的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 磷脂酶D(PLD)分布廣泛，存在于各種動植物和微生物中。PLD對磷脂分子中的磷酰 氧鍵P-Ο起作用，其生物催化作用主要體現(xiàn)在兩種反應(yīng)：（1)水解磷脂上的末端磷酸酯鍵生 成磷脂酸和羥基化合物；（2)當(dāng)有另一種含羥基的化合物存在時，可催化磷脂?；c其結(jié) 合，形成新的磷脂，即磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。
[0003] 磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)是一種簡單而又常見的磷脂，廣泛存在于動植物 細(xì)胞中，是動植物細(xì)胞生物膜的基本成分。PA由甘油骨架、1或2號位的脂肪酸基團(tuán)、3號位的 磷酸基組成。PA是PLD作用的直接產(chǎn)物，PA能夠帶動Ca 2+激活或協(xié)同激活細(xì)胞內(nèi)各種酶，與此 同時，PA還可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)超氧化物的形成、引起肌肉的收縮、促進(jìn)激素 分泌、誘發(fā)血小板聚集等作用?；谝陨献饔?，PA可應(yīng)用在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品等方 面。
[0004] 磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是一類普遍存在的磷脂，通常位于細(xì)胞 膜內(nèi)層，是細(xì)胞膜的重要組成部分，由于參與一系列膜功能反應(yīng)，尤其在人體的神經(jīng)系統(tǒng) 中，是大腦細(xì)胞膜的重要組分之一，其對改善記憶力、緩解壓力、修復(fù)大腦損傷、治療兒童多 動癥、抑郁癥以及預(yù)防老年癡呆癥等作用效果顯著。但具有一定純度磷脂酰絲氨酸自然界 中含量稀少，故制備純度高、質(zhì)量好的磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品具有重要意義。
[0005] 酶法制備磷脂酸或磷脂酰絲氨酸是指在一定條件下，用PLD催化底物（如PC)反應(yīng) 生成磷脂酸或磷脂酰絲氨酸，該方法相比化學(xué)合成具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品得率 高、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。生產(chǎn)磷脂酸或磷脂酰絲氨酸的不同點(diǎn)在于PLD催化反應(yīng)類型不同，前者 屬于水解反應(yīng)，后者則是通過使用PLD的磷脂酰基移轉(zhuǎn)(transphosphatidylation)反應(yīng)，對 磷脂的頭基進(jìn)行修飾。
[0006] 酶分子體外定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。通常手 段是利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造出分子的多樣性，結(jié)合靈敏、高通量的篩選技術(shù)， 從而能夠在短時間內(nèi)得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催 化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外改造酶基因， 獲得具有某些預(yù)期特征的改構(gòu)酶，與此不同，需要事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、 催化機(jī)制等因素，并根據(jù)這些因素有的放矢做對其DNA進(jìn)行改造的是定點(diǎn)突變。
[0007] 定點(diǎn)突變，又稱為理性設(shè)計，就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定長度 的核昔酸序列，由于其迅速、尚效的提尚DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究 工作中一種非常有用的手段。本發(fā)明所使用的重疊 PCR技術(shù)是定點(diǎn)突變技術(shù)的一種，該技術(shù) 可以簡單、快速的將兩個或多個基因片段通過末端互補(bǔ)、重疊延伸進(jìn)行體外基因的拼接。重 疊 PCR技術(shù)可以獲得依靠限制性內(nèi)切酶消化難以得到的產(chǎn)物，并且方便快速，在進(jìn)行大片段 基因的定點(diǎn)突變、基因片段刪除以及多個編碼序列嵌合連接上具有獨(dú)有的優(yōu)勢。
[0008] 枯草芽孢桿屬于革蘭氏陽性菌。許多枯草芽孢桿菌在發(fā)酵工業(yè)上的使用已有相當(dāng) 長的歷史，無致病性，不產(chǎn)生任何內(nèi)毒素，并且屬于人體腸道菌促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn) 生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長，此外其能夠高效地分泌各種 蛋白質(zhì)，在微生物遺傳學(xué)領(lǐng)域，芽孢桿菌屬背景研究的也十分清楚，密碼子偏愛性不明顯、 發(fā)酵簡單、生長迅速、對培養(yǎng)基無特殊要求等優(yōu)點(diǎn)。
[0009] 畢赤酵母屬于單細(xì)胞低等真核生物，是表達(dá)外源基因比較理想的工具。它除了具 有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，還因為含有特 有的強(qiáng)有力的Α0Χ(醇氧化酶基因）啟動子，可用甲醇嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)。另外，培 養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余 為無機(jī)鹽。能夠?qū)ν庠吹鞍谆蜻M(jìn)行穩(wěn)定遺傳，且作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生 物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。同釀酒酵母 等傳統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究最重要的工具和 模型。此外，畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)不但具有外源基因的翻譯后加工能力和蛋白的折 疊加工及適度糖基化等優(yōu)點(diǎn)，而且，經(jīng)該系統(tǒng)得到的全細(xì)胞催化劑可以重復(fù)利用從而降低 生產(chǎn)成本。
[0010] 在本發(fā)明中，高活力磷脂酶D基因及其突變體基因分別在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，得到產(chǎn)高活力磷脂酶D，純化后與底物反應(yīng)，催化制備磷脂酸、 磷脂酰絲氨酸。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種高活力磷脂酶D，及利用其制備磷脂酸和磷脂酰絲氨 酸的方法。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為:一種磷脂酶D突變體，是基于 SEQ ID如.2所示的磷脂酶0氨基酸序列，其中的第139、209、256、388、519位中的至少一個 氨基酸被置換為以下氨基酸：第139位：Asp 1391 le;第209位：Asn209Ile;第256位： Asp256Thr;第388位:Gln388Cys;第519位:Asp519Val;
[0013] 所述突變體的基因，是以郝氏鏈霉菌（Streptomyces halstedii)TCCC 21102基因 組為模板，克隆出磷脂酶D野生型基因 plD(如SEQ ID NO: 1所示）后，通過酶切、連接等構(gòu)建 重組載體，之后由重疊 PCR技術(shù)對野生型磷脂酶D基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到突變體基因（見表 1)〇
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為:將上述突變體基因重新構(gòu)建 重組載體，并在枯草芽孢桿菌WB600和畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，得到產(chǎn)高活力磷脂酶D 的重組菌株，通過發(fā)酵、提取等技術(shù)獲得高活力磷脂酶D。
[0015] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三為:采用本發(fā)明制備的高活力磷 脂酶D分別催化磷脂酰膽堿制備磷脂酸、催化磷脂酰膽堿和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸。
[0016] 在本發(fā)明中采用如下定義：
[0017] 1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0018] 使用氨基酸殘基的公認(rèn)IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認(rèn) IUPAC命名法。
[0019] 2.磷脂酶D突變體的標(biāo)識
[0020] 采用"原始氨基酸位置替換的氨基酸"來表示磷脂酶D突變體中突變的氨基酸。如 Asn209Ile，表示位置209的氨基酸由野生型磷脂酶D的Asn替換成lie。位置的編號對應(yīng)于 SEQ ID N0:2中磷脂酶D的氨基酸序列編號.核苷酸的變化同樣采用"原始核苷酸位置替換 的核苷酸"來表示，位置編號對應(yīng)SEQ ID N0:1中野生型磷脂酶D的核苷酸序列編號。
[0021] 在本發(fā)明中，plD表示野生型磷脂酶D的氨基酸序列，即原始序列（如SEQ ID N0:2 所示）。用plDm加數(shù)字x的方式表示各個突變體，x分別為139、209、256、388、519，其中139代 表第139氨基酸由Asp替換成lie，209代表第209位氨基酸由Asn替換成Ile，256代表第256位 氨基酸由Asp替換成Thr，388代表第388位氨基酸由Gin替換成Cys，519代表第519位氨基酸 由Asp替換成Val ;x也可以是Xm-----Xn的形式，表示若干位點(diǎn)的組合突變體，如plDml39-209 表示第139氨基酸由Asp替換成lie，第209位氨基酸由Asn替換成lie的突變體。各突變體的 編碼基因則以其氨基酸表示形式的斜體表示，如突變體plDml39的編碼基因為plDml39。
[0022] 本發(fā)明中，氨基酸的組合突變，包含如下：
[0023] plDml39-209、plDml39-256、plDml39-388、plDml39-519、plDm209-256、plDm209-388、plDm209-519、plDm256-388、plDm256-519、plDm388-519、plDml39-209-256、plDml39-209-388、plDml39-209-519、plDml39-256-388、plDml39-256-519、plDml39-388-519、 plDm209-256-388、plDm209-256-519、plDm209-388-519、plDm256-388-519、plDml39-209-256-388、plDml39-209-256-519、plDml39-209-388-519、plDml39-256-388-519、plDm209-256-388-519、plDml39-209-256-388-519;
[0024] 表1:序列對照表
[0025]
[0026]
[0027]所述的磷脂酶D及其突變體的表達(dá)宿主為枯草芽孢桿菌WB600,表達(dá)載體為 pBSA43；
[0028] 所述的磷脂酶D及其突變體的表達(dá)宿主為畢赤酵母GS115,表達(dá)載體為pPIC 9K;
[0029] 所述的磷脂酶D突變體的宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115,展示載體為pPIC9K-Flo。
[0030] 本發(fā)明的實(shí)驗步驟具體如下：
[0031] 1、一種構(gòu)建高活力磷脂酶D突變體編碼基因的過程包括如下步驟：
[0032] (1)將來自郝氏鏈霉菌（Streptomyces halstedii)TCCC 21102的野生型磷脂酶D 基因與載體pUC-T連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-T-plD，通過重疊 PCR定點(diǎn)突變野生型磷脂酶D基 因，得到高活力磷脂酶D突變體編碼基因；
[0033] (2)將含有高活力磷脂酶D突變體編碼基因的pUC-T-plDmx保存。
[0034] 2、一株含有高活力磷脂酶D基因的枯草芽孢桿菌重組菌株及以此制備高活力磷脂 酶D的過程包括如下步驟：
[0035] (1)將保存的含有高活力磷脂酶D突變體編碼基因的pUC-T-plDmx進(jìn)行酶切，將得 到的高活力磷脂酶D突變體編碼基因與載體大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBSA43通過 連接得到了新的重組載體；
[0036] (2)將重組載體轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB600中，得到重組菌株，之后將重組菌株發(fā) 酵，得到高活力磷脂酶D。
[0037] 3、一株含有高活力磷脂酶D基因的畢赤酵母重組菌株及以此制備高活力磷脂酶D 的過程包括如下步驟：
[0038] (1)將保存的含有高活力磷脂酶D突變體編碼基因的pUC-T-plDmx進(jìn)行酶切，將得 到的高活力磷脂酶D突變體編碼基因與表達(dá)載體pPIC 9K通過連接得到新的重組載體；
[0039] (2)將重組載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，得到的重組菌株經(jīng)過遺傳霉素篩選和磷 脂酶D的酶活測定，得到高活力磷脂酶D的高產(chǎn)菌株；
[0040] (3)之后進(jìn)行發(fā)酵，制備高活力磷脂酶D。
[0041] 4、一株含有高活力磷脂酶D的畢赤酵母細(xì)胞表面展示重組菌株及以此制備高活力 磷脂酶D全細(xì)胞催化劑的過程包括如下步驟：
[0042] (1)將保存的含有高活力磷脂酶D突變體編碼基因的pUC-T-plDmx進(jìn)行酶切，將得 到的高活力磷脂酶D突變體編碼基因與畢赤酵母展示載體pPIC9K-Flo通過連接得到新的重 組載體；
[0043] (2)將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主菌株畢赤酵母GS115中，得到畢赤酵母細(xì)胞表面展示磷 脂酶D重組菌株。
[0044] (3)將重組菌株發(fā)酵后制備酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D全細(xì)胞催化劑。
[0045] 5、利用本發(fā)明所述磷脂酶D生產(chǎn)磷脂酸、磷脂酰絲氨酸的方法。
[0046] 有益效果：
[0047] 1、本發(fā)明利用重疊 PCR技術(shù)對野生型磷脂酶D進(jìn)行定點(diǎn)突變(plDml39、plDm209、 plDm256、plDm388、plDm519、plDml39-209、plDml39-256、plDml39-388、plDml39-519、 plDm209_256、plDm209-388、plDm209-519、plDm256_388、plDm256_519、plDm388_519、 plDml39-209-256、plDml39-209-388、plDml39-209-519、plDml39-256-388、plDml39-256-519、plDml39-388-519、plDm209-256-388、plDm209-256-519、plDm209-388-519、plDm256-388-519、plDml39-209-256-388、plDml39-209-256-519、plDml39-209-388-519、plDml39- 256-388-519、plDm209-256-388-519、plDml39-209-256-388-519)，得到高活力磷脂酶D，在 37°C下，上述高活力磷脂酶D比野生型磷脂酶D酶活至少提高了 38.2%。
[0048] 2、本發(fā)明分別使用了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表面 展示系統(tǒng)，高活力磷脂酶D在各表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)酵酶活最高值分別為36.8U/ml、48 . lU/ml、 140.2U/(g ·細(xì)胞干重），較野生型提高140%左右。
[0049] 3、本發(fā)明采用高活力磷脂酶D生產(chǎn)磷脂酸和磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率分別為72.4% 和78.5%，尤其是酵母展示系統(tǒng)的運(yùn)用，將磷脂酶D展示于酵母表面，酵母細(xì)胞在生產(chǎn)磷脂 酶的同時又充當(dāng)了固定化載體，極大的降低了成本。
【附圖說明】：
[0050] 圖1為本發(fā)明野生型磷脂酶D基因的PCR擴(kuò)增電泳圖 [0051 ] 其中：Μ為DNA Marker，1為磷脂酶D基因；
[0052] 圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pBSA43-plDmx酶切驗證圖
[0053]其中：Μ為DNA Marker，l為pBSA43-plDmx經(jīng)BamHI和Hindlll雙酶切；
[0054] 圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-plDmx酶切驗證圖
[0055]其中：Μ為DNA Marker，l為pPIC 9K-plDmx經(jīng)EcoRI和Notl雙酶切；
[0056] 圖4為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC 9K-Fl〇-plDmx酶切驗證圖
[0057] 其中：Μ為DNA Marker，l為pPIC 9K-Flo經(jīng)過SnaBI和EcoRI雙酶切，2為pPIC 9K-Flo經(jīng)過SnaBI單酶切，3為pPIC 9K-Fl〇-plDmx經(jīng)過SnaBI和EcoRI雙酶切。
【具體實(shí)施方式】：
[0058] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施 例，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0059] 實(shí)施例1:野生型磷脂酶D基因的獲得
[0060] 1 ·野生型磷脂酶D基因來自郝氏鏈霉菌（Streptomyces halstedii)TCCC 21102， 提取其基因組DNA。
[0061] 其中郝氏鏈霉菌基因組DNA的提取步驟如下：
[0062] (1)從培養(yǎng)菌體的平板上挑取一環(huán)菌接種于50mL適當(dāng)培養(yǎng)基中，26°C，150r/min培 養(yǎng)2-3d。
[0063] (2)之后取lmL培養(yǎng)液于1.5mL EP管中，8000r/min離心20min，倒上清，用200yL溶 液I或滅菌水重懸。
[0064] (3)加 20-50yL 的 50mg/mL 溶菌酶在 37°C 下消化 0.5-lh。
[0065] (4)加入100yL的2%SDS溶液，充分反應(yīng)至菌懸液呈現(xiàn)粘稠狀。
[0066] (5)加入等體積的Tri s平衡酚:氯仿=1:1，混合均勻，12000rpm離心5min，將上清 轉(zhuǎn)移到另一EP管中。
[0067] (6)反復(fù)抽提兩次，直至無蛋白層出現(xiàn)，最后再用等體積氯仿抽提一次。
[0068] (7)加入等體積的異丙醇沉淀DNA，12000r/min離心5min，棄去上清，用500yL 75% 乙醇洗滌2次，每次吹打后12000r/min離心5min。
[0069] (8)將EP管倒置于濾紙或置于55°C金屬浴中，晾干至無酒精味后用TE緩沖液或滅 菌水溶解，-20 °C保存。
[0070] 2.由磷脂酶D基因設(shè)計野生型磷脂酶D基因的擴(kuò)增引物，序列如下：
[0071] 上游P1(SEQ ID N0:5):ATGATCAAGGTTGGTGGTGTTGCTG
[0072] 下游P2(SEQ ID N0:6):TTAACCCTGACACAAACCTCTAGCGTAATCGT
[0073] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50yL，其組成為：
[0074]
[0075] 擴(kuò)增程序的設(shè)置為:
[0076] &.預(yù)變性：951€511^11;
[0077] 匕變性：95。〇3〇8;
[0078] (：.退火：701€45;
[0079] (!.延伸：721€9〇8;
[0080] e.b-d反應(yīng)30個循環(huán)；
[0081] 代延伸：72。(：1〇11^11。
[0082]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可以看到野生型磷脂酶D基因的條帶，共1683bp (見圖1)，再由小量DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到了野生型磷脂酶D基因，即plD。
[0083] 實(shí)施例2:獲得高活力磷脂酶D基因，以Asn209Ile單個氨基酸突變體為例，最終氨 基酸序列如表1所示。
[0084] 1.野生型磷脂酶D基因與T載體進(jìn)行連接。
[0085]純化后的plD與pUC-T載體進(jìn)行連接，隨后將重組質(zhì)?；D(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，通 過EcoRI、MluI雙酶切，成功驗證野生型磷脂酶D基因已克隆至T載體上。
[0086] 2.由重疊 PCR技術(shù)進(jìn)行單一位點(diǎn)的定點(diǎn)突變
[0087] 基于重疊 PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以得到高活力磷脂酶D，設(shè)計引物如下：
[0088] 上游P1(SEQ ID N0.5):ATGATCAAGGTTGGTGGTGTTGCTG
[0089] 下游P2(SEQ ID N0.6):TTAACCCTGACACAAACCTCTAGCGTAATCGT
[0090] 重疊引物P3(SEQ ID N0.7):ATGGAAGCAACGATCAAAGTGATGTTAGCAGCAGCA
[0091] 重疊引物P4(SEQ ID N0.8):TGCTGCTGCTAACATCACTTTGATCGTTGCTTCCAT
[0092] 重疊引物P3與P4包含了對209位氨基酸殘基的突變。
[0093]將重組質(zhì)粒pUC-T-plD，即野生型磷脂酶D基因與pUC-T載體連接的重組載體，為模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0094] PCR1，反應(yīng)體系為50yL，其組成為：
[0095]
[0096] PCR2,反應(yīng)體系為50yL，其組成為：
[0097]
[0098] PCR1和PCR2擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0099] &.預(yù)變性：95。〇5111；[11;
[0100] 匕變性：95。〇3〇8;
[0101] c.退火：68°C30s;
[0102] d.延伸：72°C45s;
[0103] e.b-d反應(yīng)10個循環(huán)；
[0104] 代延伸：72。(：1〇11^11。
[0105] PCR3,反應(yīng)體系如下：
[0106] PCR3擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0107] &.預(yù)變性：951€511^11;
[0108] 匕變性：95。〇3〇8;
[0109] c.退火：7(TC45s;
[0110] d.延伸：72°C90s;
[0111] e.b-d反應(yīng)10個循環(huán)；
[0112] 代延伸：72。(：1〇11^11。
[0113] PCR4,反應(yīng)體系如下： rm 141 L0115」 PCR4擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0116] &.預(yù)變性:951€511^11;
[0117] 匕變性：95°〇3〇8;
[0118] c.退火：7(TC45s;
[0119] d.延伸：72°C90s;
[0120] e.b-d反應(yīng)30個循環(huán)；
[0121] f.延伸：72°C10min。
[0122] 最終得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(北京華大生物工程公司），結(jié)果表明，此時擴(kuò)增得到 Asn209Ile的磷脂酶D基因片段plDm209〇
[0123] 實(shí)施例3:在單個氨基酸突變的基礎(chǔ)上獲得多個氨基酸突變的磷脂酶D變體，以重 疊 PCR 技術(shù)在 Asn209Ile 突變體的基礎(chǔ)上進(jìn)行 Aspl39Ile、Asp256Thr、Gln388Cys、Asp519Val 突變?yōu)槔罱K氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0124] 具體策略是:先在單個突變的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)雙突變，隨后進(jìn)行第三、第四和第五個氨 基酸的突變。
[0125] 首先在Asn209Ile基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)Asp519Val的突變，步驟與實(shí)施例2-致，設(shè)計重疊引 物，如下：
[0126] 上游P1(SEQ ID N0.5):ATGATCAAGGTTGGTGGTGTTGCTG
[0127] 下游P2(SEQ ID N0.6):TTAACCCTGACACAAACCTCTAGCGTAATCGT
[0128] 重疊引物P5(SEQ ID N0.9):CAACAACGTAACCGAAGACTTGCAACCAGGATGGG
[0129] 重疊引物P6(SEQ ID N0.10):CCCATCCTGGTTGCAAGTCTTCGGTTACGTTGTTG
[0130] 重疊引物P5與P6包含了對519位氨基酸殘基的突變。
[0131] 將重組質(zhì)粒pUC-T-plDm209,即編碼突變體plDm209的基因與pUC-T載體連接的重 組載體，為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0132] PCR1，反應(yīng)體系為50yL，其組成為： 「01331

[0134] PCR2,反應(yīng)體系為50yL，其組成為：
[0135]
[0136] PCR1和PCR2擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0137] &.預(yù)變性：951€511^11;
[0138] 匕變性：95°〇3〇8;
[0139] c.退火：68°C30s;
[0140] d.延伸：72°C45s;
[0141] e.b-d反應(yīng)10個循環(huán)；
[0142] 代延伸：72。(：1〇11^11。
[0143] PCR3,反應(yīng)體系如下：
[0144]
[0145] PCR3擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0146] &.預(yù)變性:951€511^11;
[0147] 匕變性：95°〇3〇8;
[0148] c.退火：70°C45s;
[0149] d.延伸：72°C90s;
[0150] e.b-d反應(yīng)10個循環(huán)；
[0151] f.延伸：72°C10min。
[0152] PCR4,反應(yīng)體系如下：
[0153]
[0154] PCR4擴(kuò)增程序的設(shè)置為：
[0155] &.預(yù)變性:951€511^11;
[0156] 匕變性：951：3〇8;
[0157] c.退火：7(TC45s;
[0158] d.延伸：72°C90s;
[0159] e .b_d反應(yīng)30個循環(huán)；
[0160] 代延伸：72。(：1〇11^11。
[0161] 最終得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(北京華大生物工程公司），結(jié)果表明，此時擴(kuò)增得到 Asn209Ile和Asp519Val雙突變的磷脂酶D基因片段plDm209-519,序列如表1所示。
[0162] 繼續(xù)進(jìn)行其他各個突變步驟與實(shí)施例2或/和實(shí)施例3步驟一致，所有突變體引物 序列見下表，在plDm209-5 19的基礎(chǔ)上按上述步驟，僅按下表更換引物，依次進(jìn)行 ASpl39Ile，ASp256Thr，Gln388CyS的點(diǎn)突變，并送至測序公司測序，確認(rèn)得到5個氨基酸突 變點(diǎn)的磷脂酶D基因片段plDml39-209-256-388-519，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，核苷 酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0163]
[0164]實(shí)施例4:枯草芽孢桿菌高活力磷脂酶D重組菌的構(gòu)建
[0165] 1.表達(dá)載體pBSA43的構(gòu)建
[0166] 以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭克隆載體pBE2為骨架，克隆入一個強(qiáng)的芽孢桿菌 組成型啟動子P43和能夠使重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中的果聚糖蔗糖酶信號序列sacB獲 得了表達(dá)載體PBSA43。它帶有Απ^和Knf基因，可以在大腸桿菌中利用氨芐青霉素抗性作為 篩選標(biāo)記，同時又可以在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中利用卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記。
[0167] 2 ·構(gòu)建高活力磷脂酶D表達(dá)載體pBSA43-plDmx
[0168] 將重疊 PCR構(gòu)建的高活力磷脂酶D基因與枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pBSA43都經(jīng)BamHI 和Hindll I雙酶切，隨后進(jìn)行連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pBSA43-plDmx，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證并測序，確定構(gòu)建成功，即獲得重組 菌株 pBSA43_plDmx。
[0169] 3 ·表達(dá)載體pBSA43_plDmx轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌WB600
[0170] 向預(yù)冷的1mm電轉(zhuǎn)杯中加入60yL感受態(tài)細(xì)胞中和lyL(50ng/yL)pBSA43_plDmx，混 勻并冰浴5min，設(shè)置參數(shù)(25yF，200 Ω，4.5-5.0ms)，電擊一次，隨后立即加入lmL復(fù)蘇培養(yǎng) 基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇），混勻后吸取至1.5mlEP管中，37°C搖床震蕩培養(yǎng) 3h，離心后留取200yL復(fù)蘇物涂布在具有抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑取轉(zhuǎn)化子，提質(zhì) 粒、酶切驗證(如圖2所示），得到枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBSA43-plDmx。
[0171 ]實(shí)施例5:構(gòu)建畢赤酵母高活力磷脂酶D游離表達(dá)重組菌
[0172] 1 ·高活力磷脂酶D表達(dá)載體pPIC9K-plDmx的構(gòu)建
[0173] 將重疊 PCR純化產(chǎn)物和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC 9K經(jīng)過EcoRI和Notl雙酶切，隨后 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，選擇Amp1的陽性轉(zhuǎn)化子，菌落培養(yǎng)后提質(zhì) 粒，酶切驗證成功(如圖3所示），即得到重組表達(dá)載體pPIC 9K-plDmx。
[0174] 2.構(gòu)建高活力磷脂酶D高表達(dá)重組菌株
[0175] (1)質(zhì)粒DNA的線性化
[0176] 在轉(zhuǎn)化畢赤酵母之前，分別用SacI和SalI限制性內(nèi)切酶對重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC 9K-plDmx進(jìn)行線性化酶切。
[0177] (2)線性化質(zhì)粒pPIC 9K_plDmx電轉(zhuǎn)至畢赤酵母
[0178] ①將感受態(tài)細(xì)胞與線性化質(zhì)粒pPIC 9K-plDmx加入到1.5mL預(yù)冷的離心管中，吹打 混勻，隨后加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；
[0179] ②對轉(zhuǎn)化杯冰浴lOmin，隨后電轉(zhuǎn)化；
[0180] ③電擊后，立即加入lmL預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液于電轉(zhuǎn)杯中，并將電轉(zhuǎn)液轉(zhuǎn)移 到新的1.5mL|^;L·、官中；
[0181] ④30°C靜置培養(yǎng)1-2h，吸取畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)液200yL涂布在MD培養(yǎng)基上。
[0182] (3)陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定及磷脂酶D高產(chǎn)菌株的篩選
[0183] ①涂有電轉(zhuǎn)液的MD平板在30°C培養(yǎng)2-3d;
[0184] ②挑取轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組，稀釋100倍后作為模板進(jìn)行PCR。另以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒 pPIC 9K的畢赤酵母GS115/pPIC 9K作為對照，確定陽性轉(zhuǎn)化子。
[0185] ③確定陽性轉(zhuǎn)化子后，先挑取在含不同濃度遺傳霉素抗性平板上單菌落比較大的 高遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子，隨后分別測定挑選出的轉(zhuǎn)化子的磷脂酶D酶活，從而得到磷脂酶D 的高產(chǎn)菌株GS115/pPIC 9K-plDmx。
[0186] 實(shí)施例6:畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D重組菌的構(gòu)建
[0187] 1 ·重組質(zhì)粒 pPIC9K-Flo_plDmx 的構(gòu)建
[0188] 將重疊 PCR純化產(chǎn)物和畢赤酵母表面展示表達(dá)載體pPIC 9K-Flo經(jīng)過SnaBI和 EcoRI雙酶切，隨后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，選擇Απ^的陽性轉(zhuǎn)化子，菌落 培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切驗證成功(如圖4所示），即得到重組表達(dá)載體pPIC 9K-Fl〇-plDmx。
[0189] 2.畢赤酵母重組菌的構(gòu)建
[0190] 將測序驗證正確的重組表達(dá)載體pPIC 9K-Fl〇-plDmx經(jīng)Sail線性化后，用電轉(zhuǎn)化 法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，MD平板篩選重組子，獲得畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D重 組菌GS115/pPIC 9K-Fl〇-plDmx。
[0191] 實(shí)施例7:高活力磷脂酶D在枯草芽孢桿菌重組菌中的表達(dá)及制備
[0192] ①將枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBSA43-plDmx接種于含卡納霉素(50yg/mL)LB 液體培養(yǎng)基中，37 °C，220r/min培養(yǎng)過夜；
[0193] ②按1%接種量轉(zhuǎn)接于50mL的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)48h，即得到高活力 磷脂酶D粗酶液；
[0194] ③隨后采用分級鹽析法沉淀酶蛋白，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離 子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得高活力磷脂酶D純酶酶粉。
[0195] 實(shí)施例8:高活力磷脂酶D在畢赤酵母游離表達(dá)重組菌中的表達(dá)及制備
[0196] ①挑取YPD平板上的畢赤酵母重組菌GS115/pPIC 9K-plDmx接種至50ml的YH)液體 培養(yǎng)基中，30 °C、250r/min培養(yǎng)24h;
[0197] ②以1%的接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250r/min培養(yǎng)約24h，隨后4000r/ min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基；
[0198] ③繼續(xù)培養(yǎng)，30°C，250r/min，每隔24h補(bǔ)加250yL甲醇。在培養(yǎng)5天后，離心得上清， 即得到磷脂酶D的粗酶液；
[0199] ④然后采用分級鹽析法沉淀酶蛋白，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離 子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得高活力磷脂酶D純酶酶粉。
[0200] 實(shí)施例9:畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D全細(xì)胞催化劑的制備
[0201] ①挑取YPD平板上的畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D重組菌GS115/PPIC 9K-Fl〇-plDmx接種至50ml 的YH)液體培養(yǎng)基中，30°C、250r/min培養(yǎng)24h;
[0202] ②以1 %的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250r/min培養(yǎng)約24h，隨后 4000r/min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基；
[0203] ③繼續(xù)培養(yǎng)，30°C，250r/min，每隔24h補(bǔ)加250yL甲醇。在培養(yǎng)5天后，離心收集取 菌體，用過膜水沖洗1-2次，加入保護(hù)劑后經(jīng)真空冷凍干燥制得畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活 力磷脂酶D細(xì)胞催化劑。
[0204]實(shí)施例10:磷脂酶D活力測定
[0205] 1.磷脂酶D酶活測定原理
[0206] 采用酶聯(lián)比色法進(jìn)行活性檢測:磷脂酶D催化水解L-α-卵磷脂生成膽堿，膽堿在膽 堿氧化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化酶的作用下與4-氨基氨替比林和苯 酚生成醌亞胺顯色物質(zhì)，在500nm波長下有吸光值。
[0207] 2.磷脂酶D酶活測定方法
[0208] (1)卵磷脂乳液：0 · 345g 卵磷脂，2ml 乙醚，3ml7 · 5 % Tri tanX-100，20mlH20，充分混 勻。
[0209] (2)反應(yīng)終止液：1M Tris-HC1，0.5M EDTA，pH8.0 [0210] 磷脂酶D的測定步驟：
[0211] 10ml試管內(nèi)加入 1.15ml卵磷脂乳液，0.1ml 100mM Tris-HCl，0.05ml CaCl2， 0. lml粗酶液，37°C水浴反應(yīng)lOmin，隨后加入0.2ml反應(yīng)終止液，煮沸5min，冷至室溫。隨后 加入含有2U含膽堿氧化酶、4U過氧化酶、2mg 4-安替比林、lmg苯酸、20mg Tritan X-100的 4ml lOmM Tris-HCl，37°C反應(yīng)20min，隨后在500nm處測吸光值。
[0212]空白樣品以水取代反應(yīng)中的酶液，以此調(diào)零。
[0213] 酶活定義:pH = 8.0、T = 37°C時，磷脂酶D lmin內(nèi)催化水解L-α-卵磷脂釋放1 .〇μ mol的膽堿所需要的酶量。
[0214] 磷脂酶D酶活測定，測定發(fā)酵得到的高活力磷脂酶D的酶活列表如下：
[0215]
[0216]
[0217]實(shí)施例11:以高活力磷脂酶D制備磷脂酸
[0218]底物為lg大豆卵磷脂(PC含量90%)，溶于10ml pH7.0的磷酸緩沖液中，按每毫升 的反應(yīng)體系加入3U高活力磷脂酶D，其中高活力磷脂酶D為本發(fā)明實(shí)施例7-9制備(可由任意 突變體發(fā)酵得到，催化時酶粉添加量達(dá)到3U/ml即可）。反應(yīng)溫度40°C，在磁力攪拌器攪拌作 用下反應(yīng)12h，隨后通過30ml氯仿/甲醇（2:1)萃取獲得磷脂酸，其制備磷脂酸的轉(zhuǎn)化率為 72.4%〇
[0219]實(shí)施例12:以高活力磷脂酶D制備磷脂酰絲氨酸
[0220] 底物為lg大豆卵磷脂(PC含量90%)和2.5g的絲氨酸，分別溶于5ml pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，最后混合，至使總體積為l〇ml，按每毫升的反應(yīng)體系加入6U高活力磷脂酶 D，其中高活力磷脂酶D為本發(fā)明實(shí)施例7-9制備(可由任意突變體發(fā)酵得到，催化時酶粉添 加量達(dá)到6U/ml即可）。反應(yīng)溫度40 °C，在磁力攪拌器攪拌作用下反應(yīng)12h，隨后通過30ml氯 仿/甲醇(2:1)萃取獲得磷酯酰絲氨酸，其制備磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率為78.5%。
【主權(quán)項】
1. 一種磷脂酶D突變體，其特征在于，基于SEQ ID No.2所示的磷脂酶D氨基酸序列，其 中的第139、209、256、388、519位中的至少一個氨基酸被置換為以下氨基酸： 第 139 位:Aspl39Ile; 第209位：Asn209Ile; 第256位:Asp256Thr; 第388位:Gln388Cys; 第 519 位:Asp519Val。2. 權(quán)利要求1所述磷脂酶D突變體的編碼基因。3. 如權(quán)利要求2所述的磷脂酶D突變體的編碼基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.3 所示。4. 權(quán)利要求1所述磷脂酶D突變體或權(quán)利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于磷 脂酸和磷脂酰絲氨酸的制備。5. -種包含權(quán)利要求2所述的基因的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。6. 如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，其特征在于，所述表達(dá)載體為pBSA43，表 達(dá)宿主為枯草芽孢桿菌WB600;或者，所述表達(dá)載體為pPIC 9K，宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115; 或者，展示載體為pPIC9K-Flo，宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。7. 權(quán)利要求1所述磷脂酶D突變體的制備方法，其特征在于，步驟如下： (1) 將權(quán)利要求2所述的基因進(jìn)行酶切，與表達(dá)載體連接得到了新的重組載體； (2) 將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中，得到重組菌株，之后將重組菌株發(fā)酵，得到高活力 磷脂酶D。
【文檔編號】C12P7/64GK106085984SQ201610402557
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】劉逸寒, 路福平, 劉浩
【申請人】天津科技大學(xué)