Nadph依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶及其制備方法
【專利摘要】NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶及其制備方法，涉及一種同時含黃素腺嘌呤二核苷酸和[2Fe?2S]鐵硫簇的還原酶，其在苯酚降解系統(tǒng)中負責從還原型輔酶Ⅱ(NADPH)獲得電子并傳遞給苯酚羥化酶，是重要的電子傳遞蛋白；還可以作為氧化還原酶直接催化NADPH和某些電子受體，作為生化反應(yīng)的催化劑。通過克隆基因重組表達，純化后的重組MhpP蛋白純度高，輔基裝配完好，具有催化NADPH和電子受體細胞色素C、鐵氰化鉀、氯化硝基四氮唑藍的能力。MhpP新穎的序列特點和特異的NADPH依賴性表明其是一種新的還原酶。CCTCC No：M 201020320100816
【專利說明】
NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及來源于嗜酸硫化芽孢桿菌TPY的一種NADPH依賴型雙輔基氧化還原酶 即苯酚羥化酶還原酶及其制備，以及其作為電子傳遞蛋白在依賴NADPH為電子供體的電子 傳遞反應(yīng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌多組分單加氧酶是一類可利用分子氧羥化有機物底物的多組件酶系統(tǒng)，在有 機物的生物降解方面有重要的意義?？扇苄约淄閱渭友趺?、苯酚單加氧酶、甲苯單加氧酶等 多組分單加氧酶系統(tǒng)都屬于這一家族。細菌多組分單加氧酶家族的酶通常由多個組件酶共 同完成催化有機物的功能。該家族的所有酶一般都含有三個保守組件:具有氧化有機物底 物活性的羥化酶組件，具有電子傳遞功能的還原酶組件，調(diào)控和偶聯(lián)電子傳遞與催化反應(yīng) 的調(diào)節(jié)酶組件。其中，還原酶作為電子傳遞鏈中最關(guān)鍵的蛋白，通常為羥化反應(yīng)的第一步 酶，為整個羥化反應(yīng)提供還原力，影響著整個羥化反應(yīng)的反應(yīng)速率。
[0003] 多組分單加氧酶的還原酶組分通常是一個38~45kDa的含有黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)和[2Fe-2S]鐵硫簇為輔基的鐵硫黃素蛋白，通過輔基將電子從還原型輔酶I/IKNAD (P)H)傳遞給末端羥化酶。這些還原酶在氨基酸序列上都是具有鐵氧還蛋白（Ferredoxin) 結(jié)構(gòu)域和鐵氧還蛋白還原酶(FNR，F(xiàn)erredoxin_NAD(P) +reductase)結(jié)構(gòu)域的鐵硫黃素蛋 白。其中Ferredoxin保守結(jié)構(gòu)域為結(jié)合[2Fe-2S]鐵硫簇的四個半胱氨酸，F(xiàn)NR結(jié)構(gòu)域為結(jié)合 FAD和結(jié)合NAD(P)H的幾個保守基序。
[0004] 還原酶組分通過結(jié)合和氧化NAD(P)H獲得電子，在體內(nèi)把電子通過自身攜帶的輔 基傳遞給末端氧化酶活性中心，為有機物的生物降解提供還原力。比如可溶性甲烷單加氧 酶的還原酶是甲烷單加氧酶系統(tǒng)不可缺少的組件在甲烷代謝中起重要作用，針對可溶性甲 烷單加氧酶的還原酶已有一系列深入的研究。在體外這種可以氧化NAD(P)H為NAD(P)+的還 原酶還可以作為一種生物催化劑，應(yīng)用于酶法氧化還原反應(yīng)或者直接催化外源電子電子受 體，完成電子傳遞過程。
[0005] 在嗜酸硫化芽孢桿菌TPY中，苯酚羥化酶由mhpLMNOP五個基因編碼組成的多組分 酶，其中mhpP編碼了苯酚羥化酶的的還原酶組件。
[0006] 本
【申請人】在中國專利CN20 1 1 10026855 . 8中提供了嗜酸硫化芽孢桿菌 (Sulfobacillus acidophilus)TPY，該菌是從太平洋深海熱液口（12.2'29''N，104·2'01'' W，水深3083米)分離到，已于2010年8月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國. 武漢.武漢大學(xué)），保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2010203。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的是提供一種來源于嗜酸硫化芽孢桿菌（S u 1 f 〇 b a c i 11 u s acidophilus)TPY的NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP。
[0008] 本發(fā)明的第二目的是提供一種來源于嗜酸硫化芽孢桿菌（S u 1 f 〇 b a c i 11 u s acidophi lus) TPY的NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP的制備方法。
[0009]所述嗜酸硫化芽抱桿菌(5111:1^(^&(3；[11118&(^(10口11；[1118)1?￥已于2010年8月16日保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國.武漢.武漢大學(xué)），保藏編號為CCTCC No: Μ 2010203(見本
【申請人】的中國專利CN201110026855.8)。
[0010] 所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP的分子類型為蛋白質(zhì)，序列長度為350個氨基酸殘基，序 列如下所示： 1 MAYRIRIEPL GREISAPQST liILD|\CL?)G IWLPHACTHG T€G：TCKAQ?L EGEIDYGDAS 61 SFALMDFBRE DGYALLCQAK PLSDWWAE VDVEEGVBFP ：L￥EDYRAMW HVDPVSPLVR 121 RVTLELDKDT VLLPGQYKQW E￥PGHQ￥KRA YSMQ1TGRK LHFHIKYSPQ GVASBW￥FNS
[0011] 181 LRFGDQYALS GPYGRFFLRP PDGSPAVPLA GGTGLAPIM MimLYLQRP DYPATLIFGA 241 RTMELYDDK YFRALSTAHP TFRYLMVSD ETPPDNSHW SGRVDEVIAF? TFERLQGHKA 302 YVAePSPH?D ACVAALYQKR LMKDiYRlil) FiiTQEKIIG^T IKSPLSia^Ro
[0012] 所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophi lus) TPY的NADPH依 賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP，由mhpP基因編碼，該基因在其全基因組(GenBank登錄 號:CP002901)中的標簽為tpy_0634，基因 mhpP的分子類型為雙鏈DNA，長度為1053bp，拓撲 結(jié)構(gòu)為線性，核苷酸序列如下： 1 ATGGCATATC GCATTCGCA丁丁GMCCGTTG GGACGGGAGA TTTCCGCCCC GCAAGGTACC 6:1 AACATTCTCf； ATGCCTGCCT TCGTCAAGGA ATTTGGTTGC CTCAC(；CGTG CACCCAT(；GT
[0013] 121 ACCTGCGGCA CCTGTAAAGC CCAGGTGTTG GAAGGGGAGA TCGATTACGG CGATGCTTCC 181 AGTTTCGCGC TGATGGATTT TGAGCGCGAA GACGGGTATG CGCTGTTATG TCAAGCCAAA 241 CCGTTAAGCG ACGTGGTCGT CGAGGCGGAG GTGGACGTCG AGGAAGGGGT AGAATTCCCG 301 CTAGTGGAAG ATTACCGGGC TATGGTGGTC CATGTCGACC CGGTTTCGCC CTTGGTCCGC 361 CGCGITACCC TGGAATTGGA TCGCGAiACC GTCTl^ACJGC CCGGGCAATA TTTTCAGl'GG 4：21 GAGGTTCCTG GGCACCAGGT CAAACGCGCC TACTCGGCGG CGCAAATAAC CGGGCGCCGA 481 CTGGAGTTCC ACATCMATA TTCGCCGCAA GGGGTGGCCT CCGAATGGCT GTTTMCTCA 541 TTACGCCCCG GCGATCAGGT GGCATTGTCG GGACCCTACG GACGGTJTTJ' TCTGCGGCCT Θ01 CCGGACGGGT CTCCGGCGGT ATTTCTGGCA GGAGGAACGG GATTGGCGCC GATCAAGGCG
[0014] 661 ATCATTACCG CCCTTTACCT CCAACCGCCG GATTACCCGG CGACCTTGAT CTTTGGGGCC 721 CGMCGGTGG ATGAGCTCTA TGACGACAAG TATTTTCGGG CATTGAGTAC GGCACATCCC 7B1 ACCTTTCGTT ACCTGCCCGC CGTATCCGAC GAGACGCCCC CGGACAACAG CCATGTAGTG 841 AGCGGGCGCG TGGATGAGGT CATCGCGCGG ACGTTCGAGC GTTTGCAAGG GCATAAAGCC 901 TACGTCGCGG GACCGTCGCC AATGGTAGAC GCGTGTGTCG CGGCGTTGTA TCAAAAACGT 961 TTGTTTGCCC GCGATATTTA TCGCGAAGAC TTTTTTACCC AGGMGAGCA TGGTCMACC 1022 ΑΤΤα?ΑΓτΤΓ rGTTAAGCCG GCfiGGrACCT TAA。
[0015] 所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP的氨基酸殘基序列具有氮末端類似于鐵氧還蛋白 (Ferredoxin)的結(jié)構(gòu)域和中部及碳末端類似于鐵氧還蛋白還原酶(Ferredoxin-NAD(P) + reductase，F(xiàn)NR)的結(jié)構(gòu)域，其中屬于氮末端類似于鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的與結(jié)合[2Fe_2S]鐵 硫簇有關(guān)的四個半胱氨酸殘基保守位點為Cys37-X4-Cys42-X2-Cys45-X3i_Cys77,屬于中部及 碳末端類似于鐵氧還蛋白還原酶的結(jié)構(gòu)域，包括結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的保守基 序心49乂￥1513 152和GmXXS173以及結(jié)合還原型輔酶I/n(NAD(P)H)的保守基序G212XG2 14XXP2n和 Y301XA3Q3G3Q4P3Q5等。在保守結(jié)構(gòu)基序Y3QlXA3Q3G3()4P3()中第303位為丙氨酸殘基(A3Q3)，不同于其 他鐵氧還蛋白還原酶及鐵氧還蛋白還原酶類似蛋白中在該位置的高保守半胱氨酸殘基。
[0016] 本發(fā)明所述一種來源于嗜酸硫化芽孢桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的 NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP，其蛋白的氨基酸序列在親緣關(guān)系上親近于假 單胞菌的苯酚羥化酶還原酶，但氨基酸序列相似度不高(低于40% )。
[0017] 本發(fā)明所述一種來源于嗜酸硫化芽孢桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY的 NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP，以黃素腺嘌呤二核苷酸FAD和[2Fe-2S]鐵硫簇 為輔基。在還原型輔酶I(NADH)和還原型輔酶Π (NADPH)之間偏好于以還原型輔酶Π (NADPH)為電子供體。
[0018] 所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依 賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 1)以嗜酸硫化芽孢桿菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的基因組DNA為模版， 進行mhpP的PCR擴增；
[0020] 在步驟1)中，所述mhpP的PCR擴增的引物序列如下：
[0021] F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC，
[0022] R:5 '-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC，
[0023] 劃線部分GGATCC代表限制性內(nèi)切酶BamH頂每切位點，GCTAGC代表限制性內(nèi)切酶 Nhe頂每切位點；
[0024]所述PCR擴增是在25yL的反應(yīng)體系中進行，含0.5yL模板，lyL引物F，lyL引物R，2yL 10XdNTP，2.5yL 10XPCR Buffer，0.5yL Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用H2O將總 體積補至25yL，PCR反應(yīng)條件為：94°C 5min，30個循環(huán)（94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin)，72 °C延伸 10min，4°C pause。
[0025] 2)以pET-His為載體，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET-His-mhpP;
[0026] 3)以重組質(zhì)粒pET-His-mhpP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，表達與純化蛋白；
[0027] 在步驟3)中，所述重組質(zhì)粒pET-Hi s-mhpP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后，可將陽性克 隆菌按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于含氨芐青霉素的100mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D6Q()nm= 0.5~0.6時，再加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)使其終濃度為0.2mM，轉(zhuǎn)移至28°C培 養(yǎng)6~7h;誘導(dǎo)后蛋白大量表達在上清，將上清用結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖 液，500mM氯化鈉，pH=7.4)混勻后，與平衡后的鎳介質(zhì)室溫結(jié)合過夜。用含咪唑的洗脫緩沖 液(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化鈉，500mM咪唑，pH 7.4)洗脫蛋白。
[0028] 4)通過光譜掃描、薄層層析、電子順磁共振鑒定蛋白的兩個輔基；
[0029]在步驟4)中，所述光譜掃描鑒定輔基和催化實驗時，掃描波長為190~800nm，使用 儀器為島津UV-1800分光光度計;所述薄層層析時，所用的延展劑為正丁醇/乙酸/水（10:3: 5)，標準品黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)配制摩爾濃度為50μΜ;所述電 子順磁共振鑒定蛋白所用儀器為Bruker ΕΜΧ-10/12波譜測定儀，測定條件參數(shù)如下：調(diào)制 頻率為100kHz;微波功率為7mW;調(diào)制振幅為5G;時間常量為20ms;溫度為90K。
[0030] 5)以NAD(P)H為電子供體，添加人工電子受體，建立催化電子傳遞反應(yīng)體系，檢測 蛋白的電子傳遞生化活性。
[0031] 所述催化電子傳遞反應(yīng)體系包括50mM的磷酸鹽緩沖液，pH 7.4;0.1mM NADPH或 NADH; 5yg MhpP;電子受體(0.1 mM細胞色素 c或0.25mM鐵氰化鉀或0.25mM氯化硝基四氮唑藍 (NBT))，反應(yīng)體系總體積為200yL，溫度條件為25°C。
[0032]兩方面的測定，對NADPH的氧化以及對電子受體細胞色素 c、鐵氰化鉀、氯化硝基四 氮唑藍(NBT)的催化還原。
[0033] 本發(fā)明通過構(gòu)建重組原核表達載體，在大腸桿菌中進行重組蛋白表達，獲得了輔 基裝配完好、純度高且有活性的NADPH依賴型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP，克服了從嗜酸 硫化芽孢桿菌TPY分離純化MhpP過程產(chǎn)量低、輔基損失等不足，為進一步研究嗜酸硫化芽孢 桿菌TPY的苯酚降解系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于提供一種新的還原酶，其具有新穎的氨基酸 殘基序列和較高的催化電子傳遞活性。另外，其在電子供體的選擇上，具有不同于大多細菌 多組分羥化酶還原酶組分的NADH依賴性，而具有NADPH依賴性。
【附圖說明】
[0035]圖1為蛋白MhpP的氣基酸序列比對分析，分為氣末端序列比對即鐵氧還蛋白 ferredoxin結(jié)構(gòu)域(A)和中部及碳末端比對即鐵氧還蛋白還原酶FNR結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)NR結(jié)構(gòu)域包 括結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的保守基序(B)和結(jié)合NADPH的保守基序(C)。
[0036] 圖2為重組MhpP蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。Μ:蛋白Marker; 1:含重組載體pET-Hi s-mhpP的大腸桿菌BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達及超聲破碎后上清;2:含載體質(zhì)粒pET-His的大腸桿菌 BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達表達及超聲破碎后上清;3:鎳柱介質(zhì)純化所得的目的蛋白即重組MhpP。
[0037] 圖3為純化后的蛋白MhpP-His與其黃素輔基的紫外-可見光譜掃描結(jié)果，其中 curve 1為MhpP蛋白紫外-可見光譜掃描結(jié)果，curve 2為分離出的含黃素輔基的紫外-可見 光譜掃描結(jié)果。
[0038]圖4為TLC檢測黃素輔基。1 :FAD標準品；2: FMN標準品；3 :MhpP加熱煮沸去除變性不 溶物后的黃素上清。
[0039]圖5為電子順磁共振檢測[2Fe_2S]鐵硫簇輔基，三個特征表面張力g值分別為 2·07、1·93、1·88〇
[0040] 圖6為酶對NADPH氧化過程的掃描光譜。ΝΑΗ)Η的特征吸收峰340nm和NADP+特征吸 收峰260nm的吸收值隨時間變化。
[0041]圖7為酶對催化鐵氰化鉀電子受體催化過程的掃描光譜。其特征吸收峰420nm的吸 光值隨時間減少。
[0042] 圖8為酶對催化氯化硝基四氮唑藍電子受體催化過程的掃描光譜。其還原產(chǎn)物特 征吸收峰550nm的吸光值隨時間增加。
[0043] 圖9為酶對催化細胞色素 c電子受體催化過程的掃描光譜。還原型細胞色素 c特征 吸收峰550nm的吸光值隨時間增加。
【具體實施方式】
[0044] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實驗室手冊（1、薩姆布魯克，拉塞爾（著），黃培堂(譯），《分子克隆實驗指南》， 科學(xué)出版社，2002年，第三版）中所述的實驗條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條 件。
[0045] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是：
[0046] 1.一種來源于嗜酸硫化芽孢桿菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的NADPH依賴 型雙輔基苯酚羥化酶還原酶MhpP與一些蛋白進行序列比對，軟件DNAMAN用于序列比對。來 自Acinetobacter sp.ADP1的苯甲酸雙加氧酶還原酶BenC，來自Pseudomonas sp·CF600的 苯酸輕化酶還原酶P5,以及植物鐵氧蛋白（Ferredoxin)和以及植物和細菌的鐵氧還蛋白還 原酶（FNR，F(xiàn)erredoxin_NAD(P) +reductase )用于序列比對。結(jié)果顯示MhpP具有N端 Ferredoxin結(jié)構(gòu)域和FNR結(jié)構(gòu)域（圖1) JhpP的保守位點包含N端屬于Ferredoxin結(jié)構(gòu)域的 四個半胱氨酸保守位點CyS-X4-Cy S-X2-CyS-X29-35-Cy S(圖1A)，以及C端屬于FNR結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合FAD的保守基序RXY/FS和GXXS/T(圖1B)，以及結(jié)合NAD(P)H的保守基序GXGXXP和yXCGp等 (圖1C)。其中基序yXCGp中的高保守半胱氨酸殘基幾乎在所有FNR蛋白和FNR相似蛋白中保 守存在，但是在MhpP中這個半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基替代。
[0047] 2.嗜酸硫化芽孢桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY mhpP基因的PCR擴增
[0048] 以嗜酸硫化芽孢桿菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY總DNA為模板，用引物F和 R擴增苯酚羥化酶還原酶mhpP基因。
[0049] F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC；
[0050] R:5，-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC；
[0051] 劃線部分GGATCC代表BamH頂每切位點，GCTAGC代表Nhe頂每切位點。
[0052] 在25yL的反應(yīng)體系中含0.5yL模板，lyL引物F(10yM)，lyL引物R(10yM)，2yL 10 X dNTP，2.5yL 10XPCR Buffer，0.5yL Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用H2O將總體積 補至25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為：94°C 5min，30個循環(huán)（94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin)，72°C延 伸10min，4°C pauselCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a中， 菌落PCR后選取有DNA片段的陽性克隆測序。
[0053] 3.嗜酸硫化芽抱桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY mhpP基因的表達和蛋白 MhpP的純化
[0054] 將含有mhpP基因的質(zhì)粒用BamH I和Nhe I酶切，膠回收mhpP基因片段，同時將質(zhì)粒 pET-His也用相同的酶進行酶切。將兩者連接過夜（12~16h)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感 受態(tài)細胞DH5a中，提取質(zhì)粒，測序驗證。將測序正確的質(zhì)粒pET-His-mhpP轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，37 °C生長15h后菌落PCR驗證質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的正確性。挑選轉(zhuǎn)化正確的菌落，接種到200mL含有100μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖培至A 6QQ = 0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)至終濃度0.2mM，28°C誘導(dǎo)5~6h;將菌液收集至200mL的離心管中，6,000轉(zhuǎn)/分鐘離 心lOmin沉淀細菌細胞;將細菌細胞重新懸浮在20mL結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM 氯化鈉，pH= 7.4)中，超聲波處理至菌液成半透明，再11，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄沉淀； 將上清用結(jié)合緩沖液混勻后，與平衡后的鎳介質(zhì)(GE公司）室溫結(jié)合過夜。使結(jié)合液流出，用 結(jié)合緩沖液沖洗4-5個柱體積后，用含咪唑的洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化 鈉，500mM咪唑，pH 7.4)洗脫蛋白。收集洗脫后的蛋白裝入透析袋，透析袋加入含甘油的磷 酸鹽緩沖液（NaCl 1.37mM，KCl 2.7mM，Na2HP〇4.12H2〇10mM，KH2P〇4 2mM，5%glycerol，PH 7.4)，4 °C透析24h。透析后的蛋白加入超濾管中，4 °C 3，000轉(zhuǎn)/分鐘超濾濃縮，得到的重組蛋 白MhpP-His經(jīng)12 %的SDS-PAGE電泳分析，其分子量約為45kDa(圖2)。
[0055] 4.重組嗜酸硫化芽孢桿菌（Sulfobacillus acidophilus)TPY NADPH依賴型雙輔 基苯酸輕化酶還原酶MhpP的輔基鑒定
[0056] 4.1紫外-可見光光譜掃描法檢測蛋白MhpP
[0057]使用島津UV-1800分光光度計對蛋白進行波長掃描，以磷酸鹽緩沖溶液進行基線 校正，設(shè)定掃描范圍190-800nm，掃描步長lnm。取蛋白（濃度500ι^/πιυ200μL加入比色皿中， 掃描檢測。所得光譜如圖3 curve 1所示。掃描光譜帶有黃素特征吸收峰與鐵硫簇特征吸收 峰。
[0058] 4.2蛋白MhpP的黃素輔基鑒定
[0059]將蛋白MhpP置于沸水加熱5分鐘后，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min去除變性蛋白沉淀， 得到的黃色上清進行光譜掃描和薄層層析（TLC)。光譜掃描步驟同上，得到的光譜如圖 3curve 2所示。TLC實驗使用正丁醇/乙酸/水（10:3:5)為展開劑<^40和?1財示準品購于 51區(qū)11^-41(11'；[011，標準品配制濃度為5(^1。展開劑配制混勾后倒入層析缸中蓋上蓋子放置一 段時間，使層析缸中充滿展開劑達到飽和。用鉛筆在薄層層析硅膠板上做上記號，點樣點距 低端約1.5~2cm，每個樣點之間的距離約為lcm，前后兩個樣點距邊緣約lcm。待展開劑到達 距硅膠板頂端約lcm時取出硅膠板。硅膠板用吹風(fēng)機吹干后置于365nm紫外燈下熒光顯色。 結(jié)果顯示該黃素上清是FAD而非FMN，證明蛋白MhpP的黃素輔基為FAD(圖4)。
[0060] 4.3蛋白MhpP的鐵硫簇輔基鑒定
[0061]蛋白MhpP充分還原后，轉(zhuǎn)移到核磁管中使得加樣液面為2cm。含樣品的核磁管置于 液氮中冷凍。Bruker EMX-10/12波譜測定儀用于進行電子順磁共振(EPR)實驗，測定條件參 數(shù)如下：調(diào)制頻率，100kHz;微波功率，7mW;調(diào)制振幅，5G;時間常量，20ms;溫度，90K。EPR波 譜圖顯示^^?具有幾個特征表明張力值(8七6118〇1')，分別為81 = 2.07、82 = 1.93、83 = 1.88 (圖5)，與植物鐵氧還蛋白的[2Fe-2S]鐵硫簇的EPR特征g值一致。
[0062] 5.重組苯酚羥化酶還原酶MhpP的酶活分析
[0063] 25°C條件下，反應(yīng)體系中加入50mM的磷酸鹽緩沖液，pH 7.4;0.1mM NADPH;5yg MhpP;三種電子受體的一種，包括0.1 mM細胞色素 c或0.25mM鐵氰化鉀或0.25mM氯化硝基四 氮唑藍(NBT)。使得反應(yīng)體系總體積為200yL。反應(yīng)混合物通過島津UV-1800分光光度計監(jiān)測 吸收峰的變化。酶對NADPH的氧化呈現(xiàn)出NADPH在340nm特征吸收峰隨時間的減少，和氧化態(tài) 形式的NADP+在260nm的吸收峰隨時間的增加（圖6)。酶對幾種電子受體的催化中，對鐵氰化 鉀的催化，造成鐵氰化鉀在420nm的最大吸收峰隨時間減少（圖7);對NBT的催化，造成NBT被 還原的產(chǎn)物甲臜物在550nm波長吸收值隨時間增加（圖8)，并且甲臜顆粒久置后聚集成紫黑 色沉淀。對細胞色素 c的催化造特征成氧化型細胞色素 c在530nm最大吸收峰的吸收值隨時 間減少，還原型細胞色素 c在520nm和550nm的最大吸收峰吸收值隨時間增加（圖9)〇 [0064] 一個單位(U)的酶活定義為每分鐘催化Ιμπιο?的電子受體的所需要的酶量。根據(jù)電 子受體的特征消光系數(shù)，計算酶對細胞色素 C(￡55〇nm= )、鐵氰化鉀（e42〇nm = 1.02mM-Vm-1)、NBT(e55Qnm= 28mM-Vm-1)的催化活性，實驗重復(fù)三次取平均值。該酶對三種電 子受體的催化比活力（specific activity)測定結(jié)果顯示，以細胞色素 c為電子受體酶活為 1.7±0.36U，以鐵氰化鉀為電子受體時酶活為0.78±0.13U，以氯化硝基四氮唑藍為電子受 體時酶活為0.16±0.06U。顯示酶對幾種電子受體具有催化活性，并且偏好于NADPH為電子 供體。
【主權(quán)項】
1. 一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌（Sulfobacillus acido地ilus)TPY的NADPH依賴型雙 輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP，其特征在于其分子類型為蛋白質(zhì)，序列長度為350個氨基酸殘 基，序列如下所示：2. 如權(quán)利要求1所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP，其特征在于由mhpP基因編碼，該基因在其全 基因組中的標簽為化y_〇634,基因 mhpP的分子類型為雙鏈DNA，長度為1053bp，拓撲結(jié)構(gòu)為 線性，核巧酸序列如下：3. 如權(quán)利要求1所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP，其特征在于氨基酸殘基序列具有氮末端類 似于鐵氧還蛋白（Ferredoxin)的結(jié)構(gòu)域和中部及碳末端類似于鐵氧還蛋白還原酶 (Fe;rredoxin-NAD(P)+reductase，F(xiàn)NR)的結(jié)構(gòu)域，其中屬于氮末端類似于鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu) 域的與結(jié)合[2化-2引鐵硫簇有關(guān)的四個半脫氨酸殘基保守位點為切S37-X4-CyS42-拉-切S45- X31-切S77，屬于中部及碳末端類似于鐵氧還蛋白還原酶的結(jié)構(gòu)域，包括結(jié)合黃素腺嚷嶺二 核巧酸(FAD)的保守基序Ri49XYi5iSi52和GmXXSmW及結(jié)合還原型輔酶I/n(NAD(P)H)的保 守基序G212XG214XXP217和Y3〇iXA3〇3G3(mP3日日;在保守結(jié)構(gòu)基序Y301XA3日沁3日化日中第303位為丙氨酸 殘基(A303 )，不同于其他鐵氧還蛋白還原酶及鐵氧還蛋白還原酶類似蛋白中在該位置的高 保守半脫氨酸殘基。4. 如權(quán)利要求1所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于包括W下步驟： 1. W嗜酸硫化芽抱桿菌（Sulfobacillus acido地ilus)TPY的基因組DNA為模版，進行 mhpP的PCR擴增； 2. W祀T-His為載體，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒祀T-His-mhpP; 3. W重組質(zhì)粒祀T-His-mhpP轉(zhuǎn)化大腸桿菌化2UDE3)，表達與純化蛋白； 4) 通過光譜掃描、薄層層析、電子順磁共振鑒定蛋白的兩個輔基； 5. WNAD(P)H為電子供體，添加人工電子受體，建立催化電子傳遞反應(yīng)體系，檢測蛋白 的電子傳遞生化活性。5. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述 mhpP的PCR擴增的引物序列如下： F:5 '-CGCGGATCCATGGCATATCGCATTC， R:5 '-CGGCTAGCTTAACGCCCCCGCCGGC， 劃線部分GGATCC代表限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點，GCTAGC代表限制性內(nèi)切酶Nhe I 酶切位點。6. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述 PCR擴增是在25化的反應(yīng)體系中進行，含0.扣L模板，1化引物F，化L引物R，化L10XdNTP，2.5 化 10XPCR Buffer，0.扣L Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司），用出0將總體積補至25化， PCR 反應(yīng)條件為：941：5111111，30個循環(huán)（941：3〇3,571：3〇3,72°(：1111111)，72°(：延伸1〇111111，41： P過use〇7. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述重 組質(zhì)粒祀T-Hi s-mhpP轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 (DE3)后，將陽性克隆菌按照1:100的比例轉(zhuǎn)接于含 氨節(jié)青霉素的lOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6〇〇nm=0.5~0.6時，再加入異丙基硫 代-β-D-半乳糖巧（IPTG)使其終濃度為0.2mM，轉(zhuǎn)移至28°C培養(yǎng)6~化;誘導(dǎo)后蛋白大量表達 在上清，將上清用結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液(20mM憐酸鋼緩沖液，500mM氯化鋼，抑=7.4)混勻 后，與平衡后的儀介質(zhì)室溫結(jié)合過夜；用含咪挫的洗脫緩沖液(20mM憐酸鋼緩沖液，500mM氯 化鋼，500mM咪挫，pH 7.4)洗脫蛋白。8. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述光 譜掃描鑒定輔基和催化實驗時，掃描波長為190~8(K)nm，使用儀器為島津UV-1800分光光度 計;所述薄層層析時，所用的延展劑為正下醇/乙酸/水（10:3:5)，標準品黃素腺嚷嶺二核巧 酸(FAD)和黃素單核巧酸(FMN)配制摩爾濃度為50μΜ。9. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌(Sulfobacillus acidophilus)ΤΡΥ 的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述電 子順磁共振鑒定蛋白所用儀器為化址er EMX-10/12波譜測定儀，測定條件參數(shù)如下：調(diào)制 頻率為100曲Z;微波功率為7mW;調(diào)制振幅為5G;時間常量為20ms;溫度為90K。10. 如權(quán)利要求4所述一種來源于嗜酸硫化芽抱桿菌（Sulfobacillus acidophilus) ΤΡΥ的NADPH依賴型雙輔基苯酪徑化酶還原酶MhpP的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所 述催化電子傳遞反應(yīng)體系包括50mM的憐酸鹽緩沖液，pH 7.4;0.1mM NADPH或NADH;5yg MhpP;電子受體(0.1 mM細胞色素 c或0.25mM鐵氯化鐘或0.25mM氯化硝基四氮挫藍(NBT))，反 應(yīng)體系總體積為20化L，溫度條件為25°C。
【文檔編號】C12N9/02GK106085978SQ201610411445
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610411445.8, CN 106085978 A, CN 106085978A, CN 201610411445, CN-A-106085978, CN106085978 A, CN106085978A, CN201610411445, CN201610411445.8
【發(fā)明人】陳新華, 李朦, 郭文斌
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所