谷氨酸脫氫酶的重組基因及其獲取方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及谷氨酸脫氫酶的重組基因及其獲取方法與應(yīng)用。目前食品中高級醇降解的專一性較差，且限制了酸性條件高級醇的降解，菌體中酶產(chǎn)量低、耗時長、成本高，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將能夠在酸性條件下高效降解高級醇的白地霉T3d329TF（Galactomyces geotrichum）菌株中的谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)及全長序列進行克隆、表達和重組酶活性驗證。本發(fā)明利用能夠在酸性條件下降解正己醇和異戊醇的重組酶為催化劑定向降低食品中，尤其是酸性食品中的高級醇含量，安全環(huán)保，可控性強，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。CCTCC NO：M 20816720081021
【專利說明】
谷氨酸脫氫酶的重組基因及其獲取方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶的重組基因，具體涉及一種谷氨酸脫氫酶的重組基因及其獲取 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高級醇也叫雜醇油，過量的高級醇會對人產(chǎn)生一定的毒害作用，從而損傷人的周 圍神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，對妊娠期的母體和胎兒也有傷害，和乳 房癌也有關(guān)系。高級醇對人體神經(jīng)系統(tǒng)的麻醉作用是乙醇十幾倍，它在體內(nèi)的氧化速度比 乙醇慢，停留的時間也較長，因此有害健康。國家標準中嚴格限制了白酒中雜醇油的含量。 目前，正己醇已被列為能對人體產(chǎn)生危害的物質(zhì)(HSDB，Hazardous Substances Data Bank )。定向降低高級醇含量對提高酒精飲料的安全性有重要意義。
[0003] 正己醇和異戊醇也是引起大豆豆腥味的最主要成份。豆腥味在豆?jié){、豆粉、豆腐及 其再制品中普遍存在。由于我國有幾千年食用大豆的習慣，對豆腥味尚能勉強接受。日本、 歐美、及其南半球諸國的人們，對豆腥味甚為反感。大豆和豆制品是人類重要的蛋白質(zhì)營養(yǎng) 源，但豆腥問題將制約豆制品生產(chǎn)的發(fā)展和我國豆制品在世界各國的推廣。高級醇的種類、 濃度與葡萄酒、啤酒等的類型、口感和品質(zhì)有很大的關(guān)系，如含量過高會給葡萄酒帶來苦、 澀味;β-苯乙醇含量過高也會給葡萄酒帶來不愉快的口感。高級醇含量超過l〇〇mg/L會使啤 酒口味和受歡迎程度明顯降低。因此，定向降低高級醇含量對提高食品風味及接受度有很 大的影響。
[0004] 目前，能夠催化高級醇轉(zhuǎn)化的方法多為化學轉(zhuǎn)化，但化學轉(zhuǎn)化途徑因太過粗放，沒 有特定的專一性，化學污染較嚴重，高級醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯和醛等的分子催化劑難以獲得， 且催化效率有待提高，潛在的不安全因素等缺點不被食品行業(yè)所接受。還通過選育酵母或 控制形成相關(guān)的因素及膜過濾控制高級醇含量，但乙醇及其他香氣成分含量也同時降低。 菌體中的酶產(chǎn)量較低、耗時長、成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 酶法降解食品中高級醇含量，可以避免有毒有害物質(zhì)的殘留問題，反應(yīng)速度快，生 產(chǎn)過程可控制性強，專一性強，具有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種谷氨酸脫氫酶的重組基因及其獲取方法與應(yīng)用，能夠在 酸性條件下定向降解食品中的高級醇。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 谷氨酸脫氫酶重組基因的獲取方法，其特征在于： 由以下步驟實現(xiàn)： 步驟一：提取白地霉geoiricAt//?) T3d329TF菌株的總RNA，并合成 cDNA； 步驟二:對谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)及全長序列進行克?。?步驟三:對谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)和全長序列進行表達，包括重組表達載體的構(gòu) 建和酶基因在大腸桿菌中的誘導表達。
[0008] 步驟一中，白地霉geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株的培養(yǎng)方法由以下 步驟實現(xiàn)： (1) 將白地霉（geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在28 °C、160rpm的條件下培養(yǎng)18h后，按2.0%的接種量轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，在28 °C、160rpm的條件 下擴大培養(yǎng)38h; 所述液體培養(yǎng)基為土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基，配方為:20%的馬鈴薯浸汁1000mL，葡萄 糖20g，pH自然； (2) 所得培養(yǎng)物在5000rpm、4°C下離心10min，收集菌體，并用無菌水重新懸浮和離心， 重復5次，最后在8000rpm、4°C下離心10min，收集濕菌體，用MSM培養(yǎng)基28°C、160rpm下誘導 處理6h后，在5000rpm、4°C下離心10min，收集菌體，無菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下離心10 min，收集菌體； 所述MSM培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基，配方為:MgS04.7H20 0.5g，KH2P〇4 1.0g，NH4N03 1.0 g，6.67g/L CaCl2溶液3mL，17 g/L的FeCl3溶液3mL，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.05g，NaN03 l.Og，蒸餾水 1 000mL〇
[0009] 步驟二中： 保守區(qū)擴增引物為： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI； ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm； 全長序列擴增引物為： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； ⑶H-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hindm； PCR擴增體系為
PCR反應(yīng)條件為： 保守區(qū)的反應(yīng)條件:預變性95°C，5 min;變性溫度94°C，30s;退火溫度55.6°C和58.0 °(：，3〇8;延伸溫度72°(：，1:3〇1^11;35個循環(huán)后，72°(：延伸1〇1^11 ; 全長序列的反應(yīng)條件:預變性95°C，3 min;變性溫度94 °C，30 s;退火溫度58.0°C，30 s;延伸溫度72°C，1 min;33個循環(huán)后，72°C修復延伸7 min。
[0010] 步驟三中： 重組表達載體的構(gòu)建包括以下步驟： PCR擴增產(chǎn)物回收后與pMD19-T連接(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和pMD19-T-1359-⑶Η (全長序列））并轉(zhuǎn)化i cWi DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落，提質(zhì)粒PCR檢測后，陽性克隆 已測序;然后對重組T載體(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和pMD19-T-1359-GDH(全長序列））和 表達載體(pET-28as)進行了 BamHI和Hindm雙酶切； 酶切反應(yīng)體系為：
之后，置于37 °C反應(yīng)過夜，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的條帶，用Omega凝膠 回收試劑盒純化;然后連接表達載體，將酶切后的目的片段和表達載體進行連接； 連接反應(yīng)體系為：
16°C連接過夜，將構(gòu)建好的重組表達載體分別命名為pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）和 pET-28as_1359⑶Η(全長序列）。重組表達載體轉(zhuǎn)化[co2iDH5a感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒PCR和雙 酶切檢測后，陽性克隆測序驗證； 谷氨酸脫氫酶基因在大腸桿菌中的誘導表達： 將重組表達載體轉(zhuǎn)化ico2iBL21(DE3)感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化平板上分別挑取含有重組 表達載體pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）、pET-28as-1359-GDH(全長序列）的重組菌和含空載 體的對照菌，接種于含有50yg/mL Kan的表達培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)過夜。然后以 10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30mL表達培養(yǎng)基(2 XYT)的lOOmL三角瓶中，37°C，180 r/m培養(yǎng)至 0D600為0.6-1.0，補加24yg/mL Kan，并加入IPTG至終濃度0. lmmol/L，180r/m，低溫25 °C誘 導7h ; 4 °C，12000 X g離心5min，收集菌體；用PBS懸浮細胞，冰水浴中超聲波破碎5min (200W，工作3s，歇58，120次），12000\8離心1511^11，收集上清液測定谷氨酸脫氫酶對正己醇 的活性，并進行SDS-PAGE檢測；以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET-28as的重組菌BL21(DE3)/pET28as作為對 照。
[0011] 所述的獲取方法獲得的谷氨酸脫氫酶重組基因。
[0012] 所述的谷氨酸脫氫酶重組基因定義的谷氨酸脫氫重組酶。
[0013] 所述的谷氨酸脫氫重組酶在定向降低食品中高級醇含量方面的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 本發(fā)明操作簡單、轉(zhuǎn)化速率快、生產(chǎn)時間短、產(chǎn)量高、安全環(huán)保、生產(chǎn)成本低，利用白地 霉的谷氨酸脫氫酶基因為基礎(chǔ)，采用基因工程的手段，快速獲得能夠在酸性條件下高效降 解正己醇和異戊醇的谷氨酸脫氫酶;利用酶法生物轉(zhuǎn)化高級醇，可在數(shù)小時之內(nèi)完成反應(yīng)， 降解效率高;利用酶法生物轉(zhuǎn)化高級醇，可以擺脫生物細胞生長狀況對產(chǎn)物得率的影響，可 控性強;利用酶法轉(zhuǎn)化高級醇，安全性高、專一性強，是一種可工業(yè)化大規(guī)模定向降低食品 中高級醇的酶學方法，為工業(yè)中高級醇的定向降低提供新的思路和途徑。
【附圖說明】
[0015] 圖1為菌體T3d329TF中總RNA及保守區(qū)和全長序列擴增圖。
[0016] 圖中，M: DNA Marker;(左）1，2總RNA (右）1，2保守區(qū)基因擴增產(chǎn)物；3,4全長基 因擴增產(chǎn)物。
[0017] 圖2為重組蛋白表達形式的鑒定。
[0018] 圖3為Ni柱純化后重組酶的SDS-PAGE電泳圖。
[0019] 圖中，a:五.co2iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-658;b:五.co2iBL21(DE3)/pET-28as- GDH-1359 ; Μ:蛋白標準；50 mM:純化的重組酶(保守區(qū)），如箭頭所指；120 mM:純化重組酶 (全長基因），如箭頭所指;28as，對照菌[C02iBL21 (DE3)/pET-28as的全蛋白。
[0020] 圖4為Western印記檢測。
[0021] 圖中，l:28as，對照菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as的全蛋白；2:重組菌五. Co2iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-658細胞破碎液上清；3:純化后基因保守區(qū)的重組酶 ;4:重 組菌五.co^iBL21 (DE3)/pET-28as-GDH-1359細胞破碎液上清;5:純化后基因全長序列的重 組酶.箭頭所指為目標蛋白。
[0022] 圖5為切除SUM0融合標簽。
[0023] 圖中，a:重組菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-1359細胞破碎液上清;M:蛋白 標準；l，28as，對照菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as的全蛋白；2:重組菌五.co^iBL21(DE3)/ pET-28as-⑶H-1359全蛋白；3:重組菌五.co^iBL21 (DE3) /pET-28as-⑶H-1359細胞破碎液 上清;4:全長序列細胞破碎液上清和被SUM0蛋白酶切掉的SUM0標簽。B:純化的全長序列的 重組酶山純化的所得酶和被SUM0蛋白酶切掉的SUM0標簽。
[0024]圖6為重組酶和菌體酶的活性比較。
[0025]圖7為重組酶催化正己醇和異戊醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的GC-MS分析。
[0026] 圖8為重組蛋白的底物特異性。
[0027] 圖9為表達載體pET-28as-658-GDH的構(gòu)建。
[0028] 圖10為表達載體pET-28as_l 359-GDH的構(gòu)建。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0030] 本發(fā)明涉及的谷氨酸脫氫酶重組基因的獲取方法，由以下步驟實現(xiàn)： 步驟一：提取白地霉野ces geoiricA_)T3d329TF(CCTCC Ν0:Μ 208167)菌株 的總RNA，并合成cDNA; 所述白地霉野ces geoiricA應(yīng))T3d329TF于2008年10月21日保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學，保藏編號為CCTCC Ν0：Μ 208167〇
[0031] 步驟二:對谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)及全長序列進行克隆，獲得酶開放閱讀框 GenBank 登錄號為 KJ442577: 步驟三:對谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)和全長序列進行表達，包括重組表達載體的構(gòu) 建和酶基因在大腸桿菌中的誘導表達。
[0032] 步驟一中，白地霉（iWacioffijces geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株的培養(yǎng)方法由以下 步驟實現(xiàn)： (1) 將白地霉（geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在28 °C、160rpm的條件下培養(yǎng)18h后，按2.0%的接種量轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，在28 °C、160rpm的條件 下擴大培養(yǎng)38h; 所述液體培養(yǎng)基為土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基，配方為:20%的馬鈴薯浸汁1000mL，葡萄 糖20g，pH自然； (2) 所得培養(yǎng)物在5000rpm、4°C下離心10min，收集菌體，并用無菌水重新懸浮和離心， 重復5次，最后在8000rpm、4°C下離心10min，收集濕菌體，用MSM培養(yǎng)基28°C、160rpm下誘導 處理6h后，在5000rpm、4°C下離心10min，收集菌體，無菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下離心10 min，收集菌體； 所述MSM培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基，配方為:MgS04.7H20 0.5g，KH2P〇4 1.0g，NH4N03 1.0 g，6.67g/L CaCl2溶液3mL，17 g/L的FeCl3溶液3mL，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.05g，NaN03 l.Og，蒸餾水 1 000mL〇
[0033] 步驟一中，提取總RNA的提取方法參照生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式 真菌總RNA抽提純化試劑盒說明進行，cDNA合成采用Invitrogen公司的Superscrip First-Strand cDNA Synthesis System for qRT-PCR 試劑盒進行。
[0034] 步驟二中： 保守區(qū)擴增引物為： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI； ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm； 全長序列擴增引物為： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； ⑶H-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hindm； PCR擴增體系為
PCR反應(yīng)條件為： 保守區(qū)的反應(yīng)條件:預變性95°C，5 min;變性溫度94°C，30s;退火溫度55.6°C和58.0 °(：，3〇8;延伸溫度72°(：，1:3〇1^11;35個循環(huán)后，72°(：延伸1〇1^11 ; 全長序列的反應(yīng)條件:預變性95°C，3 min;變性溫度94 °C，30 s;退火溫度58.0°C，30 s;延伸溫度72°C，1 min;33個循環(huán)后，72°C修復延伸7 min。
[0035] 步驟三中： 重組表達載體的構(gòu)建包括以下步驟： 重組表達載體的構(gòu)建包括以下步驟： PCR擴增產(chǎn)物回收后與pMD19-T連接(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和pMD19-T-1359-⑶Η (全長序列））并轉(zhuǎn)化i cWi DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落，提質(zhì)粒PCR檢測后，陽性克隆 已測序;然后對重組T載體(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和pMD19-T-1359-GDH(全長序列））和 表達載體(pET-28as)進行了 BamHI和Hindm雙酶切； 酶切反應(yīng)體系為：
之后，置于37 °C反應(yīng)過夜，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的條帶，用Omega凝膠 回收試劑盒純化;然后連接表達載體，將酶切后的目的片段和表達載體進行連接； 連接反應(yīng)體系為：
16°C連接過夜，將構(gòu)建好的重組表達載體分別命名為pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）和 pET-28as_1359⑶Η(全長序列）。重組表達載體轉(zhuǎn)化[co2iDH5a感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒PCR和雙 酶切檢測后，陽性克隆測序驗證。
[0036]谷氨酸脫氫酶基因在大腸桿菌中的誘導表達： 將重組表達載體轉(zhuǎn)化ico2iBL21(DE3)感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化平板上分別挑取含有重組 表達載體pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）、pET-28as-1359-GDH(全長序列）的重組菌和含空載 體的對照菌，接種于含有50yg/mL Kan的表達培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)過夜。然后以 10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30mL表達培養(yǎng)基(2 XYT)的100mL三角瓶中，37°C，180 r/m培養(yǎng)至 0D600為0.6-1.0，補加24yg/mL Kan，并加入IPTG至終濃度0. lmmol/L，180r/m，低溫25 °C誘 導7h ; 4 °C，12000 X g離心5min，收集菌體；用PBS懸浮細胞，冰水浴中超聲波破碎5min (200W，工作3s，歇58，120次），12000\8離心1511^11，收集上清液測定谷氨酸脫氫酶對正己醇 的活性，并進行SDS-PAGE檢測；以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET-28as的重組菌BL21(DE3)/pET28as作為對 照。
[0037] 重組酶活性鑒定： (1)重組酶表達形式鑒定。分別取適量誘導的重組菌體及經(jīng)誘導的含空載體的對照菌 體，經(jīng)超聲波破碎后，分別取細胞破碎液的上清和沉淀經(jīng)尿素處理后（Susana et al. 2006)的樣品，進行SDS-PAGE電泳(方法1)，并測定正己醇降解活性(方法2)，確定酶的表達 形式。
[0038] (2)重組酶和菌體酶的活性比較。測定重組酶上清(粗酶液）、Ni柱純化后重組酶、 菌體T3d329TF粗酶及柱層析純化后純酶的活性，酶活測定方法同方法2。
[0039] (3)重組酶的底物特異性 以正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇、異戊醇、谷氨酸和酮戊二酸為底物，酶活測定按 方法2和方法3進行。
[0040] (4)切除SUM0融合標簽。取200 yL的重組酶上清(粗酶液)及經(jīng)Ni-NTA純化后的純 酶，加入SUM0蛋白酶1 yL，4 °C條件下，酶切16 h后，SDS-PAGE電泳分析酶切的效果，確定表 達的蛋白是否是目標蛋白。
[0041 ] 方法1高級醇脫氫酶的分子量分析。用Native-PAGE電泳分析其活性酶的整體分子 量。電泳方法參照2.2.6.3進行，測定高級醇脫氫酶的整分子量;垂直板SDS-PAGE電泳參照 Laemml i (1970 )的方法，測定酶的亞基分子量。SDS-PAGE的分析條件為：12%分離膠，5%濃縮 膠，電泳條件：電壓200 V，濃縮膠電流10 mA，分離膠電流20 mA。電泳完畢后用考馬斯亮藍 尺-250染色，染色劑配制同2.2.6.3。脫色液:單蒸水67 1^，乙醇25 1^，冰醋酸8 111匕脫色完 畢后用Bio-Rad凝膠成像儀照相。
[0042] 方法2反應(yīng)體系:含高級醇10 mL檸檬酸緩沖溶液(pH4.0,0.1 mol/L)，所用高級醇 為正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇，初始濃度為20 mmol/L。酶液用量1 mL。反應(yīng)條 件：28 °C、160 r/m恒溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，用氣相色譜檢測反應(yīng)體系中的高級醇殘留 量。
[0043] 試驗方法:測定酶液的高級醇降解活性時，直接在上述反應(yīng)體系中加入1 mL酶液 進行反應(yīng);對照均為用lmL梓檬酸緩沖溶液(pH4.0，0.1 mol/L)代替酶液的反應(yīng)體系。
[0044] 方法3(1)分光光度計測定。谷氨酸和α-酮戊二酸的測定均在30 °C下進行。參照 Choudhury和Punekar(2009)的方法進行測定及數(shù)據(jù)分析，谷氨酸脫氫酶活性表示為A340 rim條件下的NADP(H)吸光值的變化。單位降解活性(U)定義為每分鐘每毫克蛋白還原/氧化 1 ymolNADP+/NADPH。
[0045] (2)試驗條件:色譜柱：島津Wondasil型C18色譜分析柱(250 X4.6 mm);檢測器:紫 外檢測器;檢測波長:215 nm;柱溫:30 °C;進樣量:20 yL;流動相:含1%色譜級乙酸的水溶 液：甲醇=95:5。流動相口!1:2.5;流速 :111117111；[11。
[0046] 實施例1: 步驟一:菌體制備： 將白地霉CCTCC NO:Μ 208167菌株接種于土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基(20%的馬鈴薯浸汁 1000mL，葡萄糖20 g，pH自然）中，在28°C、160 rpm的條件下培養(yǎng)18h，按2.0%的接種量接入 上述培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，條件同上，培養(yǎng)時間為38h，所得培養(yǎng)物在5000rpm，4°C下離心 10min，收集菌體，并用無菌水重新懸浮和離心，重復5次，最后在8000rpm，4°C下離心10min， 收集濕菌體，用MSM培養(yǎng)基28°C，160rpm下誘導處理6h后，在5000rpm，4°C下離心10min，收集 菌體，無菌水清洗5次，最后在8 000 r/m，4 °C下離心10 min，收集菌體提取總RNA。
[0047] 步驟二:菌體總RNA提取： 菌體中總RNA提取方法按照生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式真菌總RNA抽提 純化試劑盒說明進行，采用1%溴化乙錠凝膠（180V，10min)檢測完整性，Q5000微量紫外分光 光度計測定Α26〇Γ?/28(ν值和RNA含量。
[0048] 實驗結(jié)果:總RNA質(zhì)量較好，28S、18S和5S的條帶比較完整，28S和18S的比值在1-2: 1之間；其A260nm/A280nm值為1 · 97，在1 · 8-2 · 0之間，含量926 yg/mL，RNA純度較高。
[0049] 實施例2: 步驟一:菌體制備： 同實施例1。
[0050] 步驟二:保守區(qū)和全長序列的克?。?① 保守區(qū)擴增引物： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm 全長序列擴增引物： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI ⑶H-R2 5 '-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3 ' Hindm ② 谷氨酸脫氫酶基因的保守區(qū)和全長序列的PCR擴增體系
③ PCR反應(yīng)條件 保守區(qū)的反應(yīng)條件:預變性95 °C，5 min;變性溫度94 °C，30 s;退火溫度55.6 °C和 58.0°(：，3〇8;延伸溫度72°(：，1:3〇111丨11;35個循環(huán)后，72°(：延伸1〇11^11。
[0051 ] 全長序列的反應(yīng)條件:預變性95 °C，3 min;變性溫度94 °C，30 s;退火溫度58.0 °C，30 S;延伸溫度72 °C，1 min;33個循環(huán)后，72 °C修復延伸7 min。
[0052] 采用1%瓊脂糖電泳檢測（120V，30-60min)，生工生物工程(上海)股份有限公司測 序。
[0053] 實驗結(jié)果:PCR擴增，獲得目的片段分別為658 bp和1359 bp，測序驗證正確。
[0054] 實施例3: 步驟一:菌體制備： 同實施例1。
[0055]步驟二:酶基因保守區(qū)和全長序列的表達： (l)PCR 擴增產(chǎn)物回收后與 pMD19-T 連接(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和 pMD19-T-1359-⑶Η(全長序列））并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落，提質(zhì)粒PCR檢測后，陽性克 隆已測序。然后對重組T載體(pMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和pMD19-T-1359-GDH(全長序列）） 和表達載體(pET-28as )進行了 BamHI和Hindm雙酶切。
[0056] (2)置于37 °C反應(yīng)過夜，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的條帶，用Omega凝 膠回收試劑盒純化。然后連接表達載體，將酶切后的目的片段和表達載體進行連接。
[0057] 16°C連接過夜。將構(gòu)建好的重組表達載體分別命名為pET-28as-658-GDH(保守區(qū)） 和pET-28as_1359⑶Η(全長序列）。重組表達載體轉(zhuǎn)化[co2iDH5a感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒PCR和 雙酶切檢測后，陽性克隆測序驗證。
[0058] (3)將重組表達載體轉(zhuǎn)化iC〇2iBL21(DE3)感受態(tài)細胞。從轉(zhuǎn)化平板上分別挑取含 有重組表達載體pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）、pET-28as-1359-GDH(全長序列）的重組菌和 含空載體的對照菌，接種于含有50 yg/mL Kan的表達培養(yǎng)基中，37 °C，180 r/min培養(yǎng)過 夜。然后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30 mL表達培養(yǎng)基(2 XYT)的100 mL三角瓶中，37 °C， 180 r/m培養(yǎng)至0D600為0.6-1.0,補加24 yg/mL Kan，并加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，180 r/m，低溫25 °C誘導7 hj °C，12 OOOXg離心5 min，收集菌體。用PBS懸浮細胞，冰水浴中 超聲波破碎5 min(200 W，工作3 s，歇5 s，120次），12 OOOXg離心15 min，收集上清液備 用。以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET-28as的重組菌BL21(DE3)/pET28as作為對照。
[0059] 采用1%瓊脂糖電泳檢測連接效果，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，氣相色譜儀分析正己 醇降解量:同實施例2。
[0060] 實驗結(jié)果： 基因保守區(qū)和全長序列成功轉(zhuǎn)入表達菌[cWiBL21(DE3)，且高效可溶表達。
[0061 ] 實施例5: 步驟一:菌體制備： 同實施例1。
[0062] 步驟二:重組酶活性鑒定： (1)分別取適量誘導的重組菌體及經(jīng)誘導的含空載體的對照菌體，經(jīng)超聲波破碎后，分 別取細胞破碎液的上清和沉淀經(jīng)尿素處理后(Susana et al. 2006)的樣品，進行SDS-PAGE 電泳(方法1)，并測定正己醇降解活性(方法2)，確定酶的表達形式。
[0063] (2)重組酶和菌體酶的活性比較。測定重組酶上清(粗酶液）、Ni柱純化后重組酶、 菌體T3d329TF粗酶及柱層析純化后純酶的活性，酶活測定方法2。
[0064] (3)重組酶的底物特異性。以正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇、異戊醇、谷氨酸和α- 酮戊二酸為底物，酶活測定方法2和3。
[0065] (4)切除SUM0融合標簽。取200 yL的重組酶上清(粗酶液)及經(jīng)Ni-NTA純化后的純 酶，加入SUM0蛋白酶1 yL，4 °C條件下，酶切16 h后，SDS-PAGE電泳分析酶切的效果，確定表 達的蛋白是否是目標蛋白。
[0066]采用SDS-PAGE和氣相色譜儀分析蛋白分布和高級醇降解量:同實施例4。
[0067]實驗結(jié)果： 對所得基因?qū)崿F(xiàn)高效可溶表達，活性組分主要在上清部分;基因保守區(qū)和全長序列的 表達產(chǎn)物分別為24.3和50.3 kDa;兩個表達產(chǎn)物均具有高級醇和谷氨酸催化活性，且基因 保守區(qū)的表達產(chǎn)物活性高于基因全長序列的表達產(chǎn)物活性。
[0068]本發(fā)明的內(nèi)容不限于實施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書 而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 谷氨酸脫氨酶重組基因的獲取方法，其特征在于： 由W下步驟實現(xiàn)： 步驟一：提取白地霉（GaJaciomjces T3d329TF菌株的總RNA，并合成 cDNA； 步驟二:對谷氨酸脫氨酶基因的保守區(qū)及全長序列進行克?。? 步驟Ξ:對谷氨酸脫氨酶基因的保守區(qū)和全長序列進行表達，包括重組表達載體的構(gòu) 建和酶基因在大腸桿菌中的誘導表達。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氨酶重組基因的獲取方法，其特征在于： 步驟一中，白地霉（GaJaciomjces geoiricAt/m)T3d329TF菌株的培養(yǎng)方法由W下步驟 實現(xiàn)： (1) 將白地霉（GaJaciomjces geoiricAt/m)T3d329TF菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在28 °C、leOrpm的條件下培養(yǎng)1她后，按2.0%的接種量轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，在28°C、160巧m的條件 下擴大培養(yǎng)38h; 所述液體培養(yǎng)基為上豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基，配方為：20%的馬鈴馨浸汁lOOOmL，葡萄 糖20g，抑自然； (2) 所得培養(yǎng)物在5000巧m、4 °C下離屯、lOmin，收集菌體，并用無菌水重新懸浮和離屯、， 重復5次，最后在8000巧m、4°C下離屯、lOmin，收集濕菌體，用MSM培養(yǎng)基28°C、160巧m下誘導 處理化后，在5000rpm、4°C下離屯、lOmin，收集菌體，無菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下離屯、10 min,收集菌體； 所述MSM培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基，配方為:MgS04.7此0 0.5g，K出P〇4 1.0g，NH4N〇3 1.0 g，6.67g/L CaCb溶液3血，17 g/L的化Cl3溶液3血，F(xiàn)eS〇4.7出0 0.05g，NaN〇3 l.Og，蒸饋水 1 OOOmLo3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氨酶重組基因的獲取方法，其特征在于： 步驟二中： 保守區(qū)擴增引物為： GDH-F1 5 '-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3 ' BamHI； GDH-R1 5'-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3' Hind虹； 全長序列擴增引物為： GDH-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； GDH-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hind虹； PCR擴增體系為PCR反應(yīng)條件為： 保守區(qū)的反應(yīng)條件:預變性95°C，5 min;變性溫度94°C，30s ;退火溫度55.6°C和58.0 °(：，3〇3;延伸溫度721：，1:3〇111111;35個循環(huán)后，72°(：延伸1〇111111; 全長序列的反應(yīng)條件:預變性95°C，3 min;變性溫度94 °C，30 S;退火溫度58.0°C，30 S;延伸溫度72°C，1 min;33個循環(huán)后，72°C修復延伸7 min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氨酶重組基因的獲取方法，其特征在于： 步驟二中： 重組表達載體的構(gòu)建包括W下步驟： PCR 擴增產(chǎn)物回收后與 PMD19-T 連接（PMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和 PMD19-T-1359-GDH (全長序列））并轉(zhuǎn)化怎.0冊〇感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落，提質(zhì)粒PCR檢測后，陽性克隆 已測序;然后對重組T載體(PMD19-T-658-GDH(保守區(qū)）和PMD19-T-1359-GDH(全長序列））和 表達載體(pET-28as)進行了 BamHI和化nd虹雙酶切； 酶切反應(yīng)體系為：之后，置于37 °C反應(yīng)過夜，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的條帶，用Omega凝膠 回收試劑盒純化;然后連接表達載體，將酶切后的目的片段和表達載體進行連接； 連接反應(yīng)體系為：16°C連接過夜，將構(gòu)建好的重組表達載體分別命名為pET-28as-658-GDH(保守區(qū)）和 pET-28as-l359GDH(全長序列）；重組表達載體轉(zhuǎn)化凡coJiD冊α感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒PCR和雙 酶切檢測后，陽性克隆測序驗證； 谷氨酸脫氨酶基因在大腸桿菌中的誘導表達： 將重組表達載體轉(zhuǎn)化i?.co^^21(DE3)感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化平板上分別挑取含有重組 表達載體祀T-28as-658-GDH(保守區(qū)）、pET-28as-1359-GDH(全長序列）的重組菌和含空載 體的對照菌，接種于含有50yg/mL Kan的表達培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)過夜；然后W !〇〇/〇的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30血表達培養(yǎng)基(2 XYT)的100血Ξ角瓶中，37°C，180 r/m培養(yǎng)至 0D600為0.6-1.0，補加24yg/mL Kan，并加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，180r/m，低溫25 °C誘 導化；4 °C，12000 X g離屯、5min，收集菌體；用PBS懸浮細胞，冰水浴中超聲波破碎5min (200W，工作3s，歇5s，120次），12000 Xg離屯、15min，收集上清液測定谷氨酸脫氨酶對正己醇 的活性，并進行SDS-PAGE檢測；W轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒祀T-28as的重組菌化2UDE3)/祀T28as作為對 照。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取方法獲得的谷氨酸脫氨酶重組基因。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的谷氨酸脫氨酶重組基因定義的谷氨酸脫氨重組酶。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的谷氨酸脫氨重組酶在定向降低食品中高級醇含量方面的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/10GK106085977SQ201610400139
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】師俊玲, 朱靜, 徐曉光
【申請人】西北工業(yè)大學