專利名稱：谷氨酸診斷/測定試劑盒及谷氨酸濃度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定谷氨 酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009-2003味精衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法有1. 旋光計法2.甲醛滴定法3.凱氏定氮法。味精系指以糧食及制品為原料經(jīng)發(fā) 酵提純的谷氨酸鈉。酶法分析是國際上公認(rèn)的谷氨酸鹽的分析方法，已被多個國際權(quán)威組織 或機構(gòu)采納如IFU (國際果汁生產(chǎn)者協(xié)會)，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生 產(chǎn)者聯(lián)盟)，及MEBAK，OICC,VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn) 檢測方法。已被寫入澳大利亞，荷蘭，德國，瑞士等多個國家的食品法。 國內(nèi)也有數(shù)家果汁、酒類加工企業(yè)使用酶法試劑盒作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。生物體內(nèi)存在分解骨質(zhì)的破骨細(xì)胞和形成骨骼的成骨細(xì)胞，正常情況下 兩種細(xì)胞的作用保持著良好的平衡。如果平衡被打破、破骨細(xì)胞過于活躍， 就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。破骨細(xì)胞中含有谷氨酸，而一種名為"谷氨酸轉(zhuǎn)運體" 的蛋白可以將谷氨酸排出破骨細(xì)胞，被"釋放"的谷氨酸會和細(xì)胞表面的受 體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的酶，抑制破骨細(xì)胞分解骨質(zhì)的作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/連續(xù) 監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定谷氨酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的谷氨 酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自 動生化分析儀上進行谷氨酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而 可以得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明谷氨酸濃度測定方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+2-酮戊二酸酯+過氧化氫過氧化氫+輔酶 NAIXP)H氧化酶 還原型輔酶+氧 這種方法應(yīng)用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶聯(lián)NAD(P)H氧化酶(NAD (P) Hoxidase; EC 1.6.3.1)酶促反應(yīng)速率比 色法/終點法。谷氨酸氧化酶酶解谷氨酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過偶聯(lián) NAD(P)H氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為 還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度， 可以測算谷氨酸的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明谷氨酸診斷/測定試劑 盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L本發(fā)明的谷氨酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、NAD(P)H氧化酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶。輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定谷氨酸濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測谷氨酸樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。 實施例二本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑輔酶100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑谷氨酸氧化酶腦mmol/L 500 mmol/L 10000U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。實施例三本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為三試劑，包括:試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑輔酶試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 12000U/LNAD(P)H氧化酶 試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L10000U/L:試劑，可以直接使用。谷氨酸氧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」測定谷氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測谷氨酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃 度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色不另一一例舉?？傊?，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的谷氨酸的濃度測定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+2-酮戊二酸酯+過氧化氫過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出谷氨酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種谷氨酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/LNAD(P)H氧化酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成單劑 試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成雙劑 試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、 NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成多劑 試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、NAD(P)H氧化酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化 酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定谷氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324571SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司