專利名稱：關(guān)于脊髓損傷疼痛的外周遞送的谷氨酸脫羧酶基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療疼痛的方法和組合物。
背景技術(shù)：
脊髓損傷后的疼痛是不利地影響生活質(zhì)量并且阻礙有效的康復(fù)的重 要問題。幾乎患有脊髓損傷(SCI)的每一名患者都患有SCI疼痛。SCI疼痛 可以在損傷平面(level)或在損傷平面以下。對(duì)于每個(gè)人，疼痛在強(qiáng)度、頻 率、發(fā)作持續(xù)時(shí)間和經(jīng)歷的疼痛類型上不同。經(jīng)歷的疼痛類型已經(jīng)被患者 描述為麻刺感、麻木、疼痛、悸痛、灼痛或壓痛。它通常描述在具體的機(jī) 體區(qū)域并且發(fā)生在機(jī)體的一側(cè)或兩側(cè)。它可以是持續(xù)的或斷續(xù)的，并且與 機(jī)體姿勢(shì)或活動(dòng)無關(guān)。
慢性SCI疼痛可以在脊髓損傷時(shí)發(fā)生，或者在SCI后緩慢地發(fā)展幾個(gè) 月或幾年的時(shí)間。慢性SCI疼痛持續(xù)長期的時(shí)間，并且通常對(duì)常規(guī)疼痛治 療反應(yīng)不好。根據(jù)一些報(bào)道，多達(dá)90%的患有SCI的人還經(jīng)歷了慢性SCI 疼痛。對(duì)于患者，SCI疼痛的水平可以從只是小煩惱到難以忍受的范圍。 己經(jīng)描述了 SCI后的兩類慢性疼痛。平面(at-levd)神經(jīng)性SCI疼痛是指在 脊髓損傷位點(diǎn)附近的皮區(qū)。平面以下(below-level)神經(jīng)性SCI疼痛是指在 脊髓損傷位點(diǎn)平面以下的皮區(qū)。前者通常在脊髓損傷的早期階段存在，并 且隨著時(shí)間過去而減輕，而后者逐漸發(fā)展，并且通常是藥物治療難以控制的。脊髓損傷后的慢性SCI疼痛是不利地影響生活質(zhì)量并且阻礙有效的康 復(fù)的重要問題。
SCI疼痛可以分類為肌肉骨骼或神經(jīng)性疼痛。肌肉骨骼SCI疼痛由于 機(jī)體組織諸如骨骼、關(guān)節(jié)和肌肉的過度使用引起。它通常隨著運(yùn)動(dòng)而加重， 并且隨著休息而減輕。
神經(jīng)性SCI疼痛可能是由于神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于疼痛的正常感覺的異常處理引起。例如，脊髓和大腦可以另外將正常感覺認(rèn)為是疼痛。損傷平面的神經(jīng)性SCI疼痛可能是由于對(duì)真實(shí)神經(jīng)根的損傷或者對(duì)脊髓本身的損傷 引起。醫(yī)生和其它保健專家可以將這叫作"部分傳入神經(jīng)阻滯(segmental deafferentiation)"或"帶區(qū)疼痛(girdle zone pain)"。這種類型的神經(jīng)性 SCI疼痛通常是兩側(cè)的，并且按照?qǐng)A周模式，例如，從你的胃部環(huán)繞到你 的背部。如其它類型的慢性疼痛，這可以在初始脊髓損傷后的剛開始的幾 周內(nèi)發(fā)展，或者可以隨著時(shí)間更加緩慢地發(fā)展。損傷平面以下的發(fā)散性神 經(jīng)性SCI疼痛可能是由于己經(jīng)發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)際損傷引起。這種 SCI神經(jīng)性疼痛通常與異常性疼痛(來自通常不是疼痛的事物的疼痛，例 如，光接觸)或痛覺過敏(由通常引起輕微疼痛的事物引起的極度疼痛， 例如，大頭針刺痛)有關(guān)。
再現(xiàn)這種臨床病癥的主要特征的動(dòng)物模型的建立已經(jīng)允許鑒定損傷 的脊髓中的神經(jīng)化學(xué)變化。在一種模型SCI模型中，實(shí)驗(yàn)室大鼠經(jīng)受在 T13的脊髓的側(cè)半切斷。實(shí)驗(yàn)室大鼠在T13脊髓的側(cè)半切斷在雙后肢半切 面以下產(chǎn)生兩側(cè)疼痛-相關(guān)的行為。SCI模型提供了檢測(cè)SCI疼痛新型治 療的獨(dú)特的動(dòng)物模型。
在SCI后報(bào)道了脊髓中，氨基丁酸(GABA)-ergic抑制機(jī)制的機(jī)能減退 和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的增加。在突觸前和突觸后都作用的GABA-介導(dǎo)的抑制作用，發(fā)揮對(duì)初級(jí)傳入神經(jīng)和次級(jí)脊髓丘腦束狀神經(jīng)元 (second-order spinothalamic tract neurons)之間疼痛神經(jīng)傳遞的增強(qiáng)調(diào)控 作用。脊髓GABA-ergic神經(jīng)傳遞的藥理拮抗作用導(dǎo)致與在神經(jīng)性SCI疼 痛中發(fā)現(xiàn)的相似的機(jī)械性超敏反應(yīng)。GABA激動(dòng)藥物(例如，巴氯芬)核 準(zhǔn)用于選擇性神經(jīng)性疼痛綜合征的治療，但是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA受 體的普遍分布導(dǎo)致副作用，其加強(qiáng)了對(duì)施用巴氯芬的嚴(yán)重限制，即使當(dāng)鞘內(nèi)施用時(shí)，也是如此。
先前已經(jīng)證明，通過皮下接種遞送的基于重組單純皰疹病毒(HSV)的 載體可以用來表達(dá)所選的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元中的神經(jīng)遞質(zhì)。構(gòu)建
表達(dá)腦啡肽原的HSV載體在炎癥疼痛、神經(jīng)性疼痛和由骨骼癌癥引起的 疼痛的嚙齒動(dòng)物模型中產(chǎn)生局部疼痛-減輕作用。通常觀察到SCI疼痛抗 阿片樣物質(zhì)治療，但是它可以應(yīng)答鞘內(nèi)巴氯芬。
其它的研究巳經(jīng)證明，加工包含編碼GAD基因的腺伴隨病毒或皰疹 擴(kuò)增子載體可以用來在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)GABA。然而，這些研究中的載體 是直接注射到大腦神經(jīng)核中，但是不是用于疼痛模型或?qū)嶒?yàn)。
目前，對(duì)于SCI疼痛沒有始終成功的藥物或手術(shù)治療。目前的SCI 疼痛治療包括阿片樣物質(zhì)和神經(jīng)藥物治療。對(duì)于這些治療的反應(yīng)率通常受 到副作用的限制。不幸地，神經(jīng)性SCI疼痛通常不對(duì)阿片樣物質(zhì)(例如， 嗎啡)反應(yīng)。在一些情形中，SCI疼痛也不與神經(jīng)性藥物治療(例如，某 些抗驚厥藥物或抗抑郁藥物)反應(yīng)。 一些醫(yī)生推薦可以使得疼痛區(qū)域麻木 的神經(jīng)根阻斷劑。這種麻木作用只持續(xù)短時(shí)間。有時(shí)推薦另一種方法，進(jìn) 行手術(shù)途徑，諸如DREZ (背根進(jìn)入?yún)^(qū)(dorsal root entry zone))、脊神經(jīng)根 切斷術(shù)或脊髓前側(cè)柱切斷術(shù)。這些方法最終使得SCI疼痛水平升高，并且 長期可能加重神經(jīng)性SCI疼痛。
外周神經(jīng)性疼痛是另一種常見的并且難以治療的多神經(jīng)病或結(jié)構(gòu)神 經(jīng)損傷的并發(fā)癥。阿片樣物質(zhì)相對(duì)無效，并且它們的應(yīng)用受到副作用的限 制。已經(jīng)證明，抗抑郁藥物和抗驚厥藥物在隨機(jī)控制的試驗(yàn)中有效，但是 在不到一半的治療患者中只提供50%的減輕作用。在神經(jīng)性疼痛中潛在 的復(fù)雜機(jī)制中，局部神經(jīng)損傷導(dǎo)致脊髓中GABAergic抑制性突觸電流的 選擇性丟失，這引起異常疼痛敏感性和神經(jīng)性疼痛綜合征的表型特征。由 于這些試劑的治療機(jī)會(huì)不多，并且劑量受到副作用的限制，所以 GABAergic試劑還沒有廣泛用于治療神經(jīng)性疼痛。
因此，存在對(duì)于治療SCI和神經(jīng)性疼痛的治療方法的需求。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供一種載體，優(yōu)選地單純皰疹病毒(HSV)載體，其包括編碼
谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本發(fā)明還提供這樣的載體的 儲(chǔ)液和包括這樣的載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物中的疼 痛諸如脊髓損傷疼痛或外周神經(jīng)性疼痛的方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效治療脊髓損傷疼痛的量的包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核酸序列的載體。這些優(yōu)點(diǎn)，以及其它的創(chuàng)造性特征將從本發(fā)明的下述描 述和附圖中顯而易見。
附圖簡述


圖1是可以用于本發(fā)明的示例性載體構(gòu)建體的圖示。
圖2是QHGAD67轉(zhuǎn)導(dǎo)的圖示，其通過爪墊接種增加腰部背根神經(jīng)節(jié) (DRG)中的GAD67 mRNA。在皮下接種30 jil 1 X 109 pfii/ml QHGAD67或 Q0ZHG到一個(gè)后爪后一周，從收集的L4-L6 DRG中提取總RNA (500 ng)， 通過實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，并且使用GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定量。描述了相 對(duì)于QOZHG-轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)的量。平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(SEM)， N = 6。
圖3表示來自腰部脊髓的背象限區(qū)的蛋白，其通過使用(3-肌動(dòng)蛋白作 為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的蛋白質(zhì)印跡而確定，并且通過相對(duì)光學(xué)密度進(jìn)行定量。平 均值土SEM， N = 6， *P<0.05。在轉(zhuǎn)導(dǎo)QHGAD67后增加了 GAD67-樣免 疫反應(yīng)性。
圖4A圖示與對(duì)照或QOZHG-感染的細(xì)胞相比較，在QHGAD67-感染 的細(xì)胞中基本上增加的Y氨基丁酸(GABA)的量，Y氨基丁酸釋放于以感染 復(fù)數(shù)(m.o丄)1體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級(jí)DRG神經(jīng)元。如在材料和方法中所述那 樣，通過HPLC確定5 min釋放的GABA。 GABA濃度/孔的檢測(cè)進(jìn)行3 次，并且對(duì)于每種情況使用一式三份樣品。平均值土SEM, *P<0.01對(duì) QOHG或賦形劑(vehicle)。圖4B圖示在體內(nèi)從脊髓神經(jīng)末梢釋放的GABA 的量，其通過HPLC在背角質(zhì)的微量透析液中確定。在皮下接種30 pi 1 X109 pfii/ml QHGAD67到一個(gè)后爪后一周，與對(duì)照動(dòng)物相比，在 QHGAD67-接種的動(dòng)物中，GABA的量(pmo1/10 pl微量透析液的級(jí)分) 基本上增加了。平均值士SEM，N-6， *P<0.05。
圖5A-D圖示機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏通過QHGAD67接種顯 著減少。圖5A和5B顯示，在半切斷后一周，在爪退縮閾值(機(jī)械性異常性疼痛)中存在減小，在賦形劑-處理的動(dòng)物(x)中，其持續(xù)了 15周。用 QHGAD67接種產(chǎn)生由增加的閾值所(空心圓圈)反映的抗異常性疼痛作 用。初始接種后7周，QHGAD67的抗異常性疼痛作用減小，但是將 QHGAD67重新接種到同一動(dòng)物中重新建立了抗異常性疼痛作用^PO,05: **P<0.01對(duì)Q0ZHG-接種的，N-6)。相對(duì)于半切斷，(A)在身體同側(cè)和(B) 在身體對(duì)側(cè)。圖5C和5D顯示，在半切斷后一周，在爪退縮潛伏期(熱 痛覺過敏)中存在顯著減少，并且注射載體導(dǎo)致爪退縮潛伏期的顯著增加 (空心圓圈)。初始接種后7周，QHGAD67的抗痛覺過敏作用減小，但 是重新接種QHGAD67重新建立了抗痛覺過敏作用。P0.05， **P<0.01對(duì) Q0ZHG-接種的，N = 6)。相對(duì)于半切斷，(C)在身體同側(cè)和(D)在身體對(duì) 側(cè)。在所有情形中(A-D)， QOZHG-接種的動(dòng)物(空心三角形)與載體-處 理的對(duì)照動(dòng)物沒有區(qū)別。
圖6A和6B顯示在半切斷后3周和爪墊接種后2周鞘內(nèi)施用比枯枯 靈堿(0.5昭)或phaclofen (0.8昭)部分地逆轉(zhuǎn)了載體接種的(A)抗異 常性疼痛和(B)抗痛覺過敏作用。點(diǎn)線表示用對(duì)照載體或賦形劑接種的 SCI后動(dòng)物中的平均閾值(A)和潛伏期(B)。平均值士SEM,N二6， *P<0.05， **P<0.01對(duì)賦形劑-處理的。
圖7是背角質(zhì)中CGRP-樣免疫反應(yīng)性的相對(duì)光學(xué)密度測(cè)定的柱狀圖。 相對(duì)光學(xué)密度測(cè)定取自每只動(dòng)物L(fēng)5部分中的一系列6個(gè)連續(xù)切片。點(diǎn)線 表示，在用賦形劑或Q0ZHG接種的動(dòng)物中相對(duì)于T13半切斷，在身體同 側(cè)和身體對(duì)側(cè)，正常脊髓中的CGRP-IR密度都基本上增加了，并且用 QHGAD67接種顯著地消弱了這種增加。與賦形劑或Q0ZHG相比，平均 值士SEM,N二6， *P<0.051。
圖8描述本文討論的SEQ ID NO:l 。
圖9描述本文討論的SEQIDNO:2。
圖10描述本文討論的SEQIDNos:3-8。
圖ll(a)和ll(b)描述證明QOGAD67在神經(jīng)性疼痛中的防感受傷害作 用的數(shù)據(jù)。(A)L5脊神經(jīng)連接(SNL)引起對(duì)觸覺刺激閾值的顯著減小，其 持續(xù)了4個(gè)多月。QHGAD67的皮下接種(箭頭)產(chǎn)生了以機(jī)械性閾值的 增加為反映的抗異常性疼痛作用。在初始接種后7周重新接種QHGAD67(箭頭)重新建立了抗異常性疼痛作用。結(jié)果表示為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(空心圓圈)QHGAD67;(實(shí)心圓圈)QOZHG; *p<0.05; **p < 0.01; 11 = 8只動(dòng)物每組。(B)L5SNL還引起顯著的熱痛覺過敏，其持續(xù)6 周。用QHGAD67接種(箭頭)，而不是QOZHG，逆轉(zhuǎn)了由脊神經(jīng)損傷 誘導(dǎo)的熱痛覺過敏。*p < 0.05; **p < 0.01相對(duì)QOZHG-接種的；n = 8只動(dòng) 物每組。差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過變量分析(StatView 5.2; SAS Institute, Cary, NC)確定，使用Scheffe's F檢驗(yàn)校正尤其是(hoc)比較后的數(shù)目。
圖12是描述關(guān)于QHGAD67對(duì)背角質(zhì)中Fos-LI的作用的數(shù)據(jù)的柱狀 圖。脊神經(jīng)連接(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)檢測(cè)，通過10 分鐘溫和的觸覺刺激誘導(dǎo)的背角質(zhì)中的Fos-LI在用QOZHG接種的大鼠 中顯著地增加。(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)檢測(cè)，在用 QHGAD67接種的具有SNL的大鼠中，這種增加被阻滯，并且它在背角 質(zhì)的I-VI層中發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表示為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。**p<0.01; n=5只動(dòng)物每組。假-手術(shù)和用QOZHG接種的SNL動(dòng)物之間的差異也 是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p<0.01)。
圖13圖示關(guān)于QHGAD67對(duì)磷酸化胞外信號(hào)-調(diào)控激酶1和2 (p-ERKl/2)在背角質(zhì)中表達(dá)的作用的數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為平均值士平均值的 標(biāo)準(zhǔn)誤差。**p<0.01; ***p<0.001; n二5只動(dòng)物每組。
圖14描述具有ICP4和ICP27基因座的延長缺失和UL55缺失的HSV 載體的構(gòu)建。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供包括編碼谷氨酸脫羧酶蛋白的多聚核苷酸序列的載體。所 述載體可以是任何適宜的基因轉(zhuǎn)移載體。適宜的載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、脂 質(zhì)體、分子綴合物(例如，運(yùn)鐵蛋白)、以及病毒。優(yōu)選地，所述載體是 病毒載體。適宜的病毒載體包括，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體、基于皰疹病毒 的載體和基于細(xì)小病毒的載體(例如，基于腺伴隨病毒(AAV)的載體,AAV-腺病毒嵌合載體和基于腺病毒的載體)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員具有必需 的理解以確定用于具體情形的適當(dāng)載體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是基于皰疹病毒的載體，諸如基于HSV的載體。基于HSV的病毒載體適于用作將核酸序列引入眾多細(xì)胞類型的載體。成熟的HSV病毒體由包膜的二十面體衣殼組成，所述衣殼 具有由152 kb的線性雙鏈DNA分子組成的病毒基因組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，基于HSV的病毒載體缺失至少一種必需HSV基因。當(dāng)然，所 述載體可以備選地或者另外刪除非必需基因。優(yōu)選地，缺失至少一種必需 HSV基因的基于HSV的病毒載體是復(fù)制缺陷型的。大部分復(fù)制缺陷型 HSV載體含有去除一種或多種中間-早期(intermediate-early)、早期或晚 期HSV基因的刪除以防止復(fù)制。例如，HSV載體可以缺失選自由下列各 項(xiàng)組成的組的早早期基因(immediate early gene): ICP4, ICP22, ICP27, ICP47以及它們的組合。HSV載體的優(yōu)點(diǎn)是它們進(jìn)入可以導(dǎo)致長期DNA 表達(dá)的潛伏期的能力，以及它們可以容納高達(dá)25 kb的外源DNA插入片 段的大的病毒DNA基因組。例如，基于HSV的載體在美國專利5,837,532， 5,846,782, 5,849,572和5,804,413，以及國際專利申請(qǐng)WO 91/02788，.WO 96/04394, WO 98/15637和WO 99/06583中描述，它們通過參考結(jié)合于此。 優(yōu)選地，HSV載體是"多缺陷型的"，意指所述HSV載體缺失多于一種 的病毒復(fù)制所需要的基因功能。HSV的序列可從互聯(lián)網(wǎng)www. ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query,fcgi cmd=Retrieve&db=nucleotide&list—uid s=9629378&dopt=GenBank&term=hsv-l&qty=l上獲得，其可以輔助在設(shè)計(jì) 的載體中產(chǎn)生需要的突變。
HSV載體可以只缺失HSV基因組早期區(qū)域的復(fù)制-必需的基因功能， 只缺失HSV基因組早早期區(qū)域的復(fù)制-必需的基因功能，只缺失HSV基 因組晚期區(qū)域的復(fù)制-必需的基因功能，或者缺失HSV基因組早期和末期 區(qū)域的復(fù)制-必需的基因功能。HSV載體還可以使得基本上整個(gè)HSV基因 組被移除，在這種情形中，優(yōu)選地至少病毒反向末端重復(fù)(ITRs)和一種或 多種啟動(dòng)子，或者病毒ITRs和包裝信號(hào)保持完好(即，HSV擴(kuò)增子)。 移除的HSV基因組區(qū)域越大，可以插入到所述基因組的外源核酸序列片 段就越大。然而，優(yōu)選本發(fā)明的載體應(yīng)該是非擴(kuò)增子HSV載體。
應(yīng)該理解，HSV載體的不同區(qū)域的缺失可以改變哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng) 答。特別地，不同區(qū)域的缺失可以減少由HSV載體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)。此 外，可以修飾HSV載體的蛋白外殼，以減少HSV載體被針對(duì)野生型蛋白
外殼的中和抗體識(shí)別的能力或無能。
當(dāng)多種復(fù)制缺失時(shí)，HSV載體優(yōu)選地包括間隔元件，以在類似于通 過單一復(fù)制缺陷型HSV載體獲得的細(xì)胞系的互補(bǔ)細(xì)胞系中提供病毒生 長。所述間隔元件可以包含理想長度的任何一種或多種核酸序列。關(guān)于HSV基因組，所述間隔元件序列可以是編碼的或不編碼的以及天然的或非天然的，但是沒有恢復(fù)缺失區(qū)域的復(fù)制必需功能。另外，在任何或全部缺失HSV區(qū)域包含間隔元件將減小HSV載體容納大插入片段的能力。 HSV載體的產(chǎn)生包括應(yīng)用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。
復(fù)制缺陷型HSV載體典型地在互補(bǔ)細(xì)胞系中產(chǎn)生，所述互補(bǔ)細(xì)胞系 以適當(dāng)?shù)乃教峁?fù)制缺陷型HSV載體中不存在但是病毒增殖需要的基 因功能，以產(chǎn)生高滴度的病毒載體儲(chǔ)液。優(yōu)選的細(xì)胞系與復(fù)制缺陷型HSV 載體中不存在的至少一種復(fù)制必需基因功能互補(bǔ)，并且優(yōu)選地與所有復(fù)制 必需基因功能互補(bǔ)。所述細(xì)胞系還可以互補(bǔ)非必需基因，當(dāng)所述非必需基 因丟失時(shí)，其可以減少生長或復(fù)制效率(例如，UL55)。互補(bǔ)細(xì)胞系可以 互補(bǔ)于由早期區(qū)域、早早期區(qū)域、晚期區(qū)域、病毒包裝區(qū)域、病毒-相關(guān) 區(qū)域、或它們的組合所編碼的至少一種復(fù)制必需基因功能的缺陷，其包括 所有的HSV功能(例如，使得包括最少的HSV序列諸如只有反向末端重 復(fù)和包裝信號(hào)或者只有ITRs和HSV啟動(dòng)子的HSV擴(kuò)增子能夠增殖)。所 述細(xì)胞系優(yōu)選地還是特征在于，它以不與HSV載體重疊的方式包含互補(bǔ) 基因，這最小化并且部分地消除了 HSV載體基因組與細(xì)胞DNA重組的 可能性。因此，如果在載體儲(chǔ)液中不能避免的話，能夠復(fù)制的HSV的存 在減到最小，因而它適用于某些治療目的，特別是基因治療目的?；パa(bǔ)細(xì) 胞系的構(gòu)建包括本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
當(dāng)所述載體是復(fù)制缺陷型HSV時(shí)，編碼蛋白(例如，GAD蛋白)的 核酸序列優(yōu)選地位于必需HSV基因的基因座上，更優(yōu)選地位于HSV基因 組的ICP4或ICP27的基因座上。將核酸序列插入到HSV基因組(例如， HSV基因組的ICP4或ICP27基因座)可以由已知方法促成，例如，通過 在給定的HSV基因組位置引入獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。
用于本發(fā)明情形的優(yōu)選的HSV載體包含延伸的ICP4，或ICP27缺失 體，并且優(yōu)選地包含兩者。在這種情形中"延伸的"缺失體，意指所述優(yōu)選的載體相對(duì)于用于它們生產(chǎn)的互補(bǔ)細(xì)胞系在這些基因座中的任一個(gè)或 兩者都沒有同源序列。理想地，所述病毒沒有剩余的ICP4或ICP27(或兩 者)編碼或啟動(dòng)子序列。優(yōu)選地，ICP27中的缺失還延伸到UL55基因座， 并且理想地，兩種基因都被刪除。因此，用于本發(fā)明的最優(yōu)選的病毒包含 在ICP4、 ICP27和UL55中的延伸的缺失，以致與用于互補(bǔ)細(xì)胞系的這些 基因沒有病毒同源性。理想地，所述載體還不包括與互補(bǔ)細(xì)胞系中所用的 序列同源的任何DNA序列(例如，甚至使用不同的調(diào)控序列和多聚腺苷 化序列)。
如上文所述，與從HSV載體中刪除的基因的功能特別是必需基因的 基因功能互補(bǔ)的細(xì)胞系對(duì)于復(fù)制載體是理想的(并且在必需HSV基因的 情形中，是必需的)。因此，為了應(yīng)用缺少ICP4和ICP2兩者的優(yōu)選的載 體，應(yīng)該應(yīng)用加工成與兩種必需基因互補(bǔ)的細(xì)胞系。此外，由于UL55— HSV 毒株生長不好，所以，當(dāng)它從載體骨架中刪除時(shí)，理想地應(yīng)用與其互補(bǔ)的 細(xì)胞系。產(chǎn)生互補(bǔ)細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員己知的。
如上文所述，所述本發(fā)明的載體還包括編碼GAD蛋白的核酸序列 (即， 一種或多種編碼一種或多種GAD蛋白的核酸序列)。編碼GAD蛋 白的核酸序列可以從任何來源獲得，例如，從天然的分離，合成產(chǎn)生，從 遺傳加工的生物體分離等。普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以插入到載體中的 任何類型的核酸序列(例如，DNA，RNA禾口cDNA)可以與本發(fā)明聯(lián)系應(yīng) 用。
所述本發(fā)明載體的核酸序列可以編碼分泌蛋白，例如，由感染的細(xì)胞 天然分泌的蛋白。備選地，所述核酸序列可以編碼蛋白，諸如GAD，其 通過在細(xì)胞內(nèi)的酶促催化作用而產(chǎn)生分泌產(chǎn)物(例如，GABA)或肽。備 選地，所述核酸序列可以編碼不是由細(xì)胞天然分泌的蛋白(即，非分泌蛋 白)，但是其包括促使蛋白分泌的信號(hào)肽。以這種方式，例如，所述核酸 序列編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)定位信號(hào)肽和非分泌蛋白。ER定位信號(hào)肽作用是將 DNA、 RNA和/或蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其中蛋白被表達(dá)并且耙向進(jìn)行分 泌。ER定位信號(hào)肽理想地作用是增加細(xì)胞分泌(即，分泌潛力)下列各 項(xiàng)(i)通常不是由細(xì)胞分泌的(即，分泌型)蛋白，和/或(ii)通常由細(xì)胞 分泌但是以低量(即，低于需要的量)分泌的蛋白。由所述多聚核苷酸編
碼的ER定位信號(hào)肽可以是任何適宜的ER定位信號(hào)肽或多肽(即，蛋白)。例如，由核酸序列編碼的ER定位信號(hào)肽可以是選自由下列各項(xiàng)組成的組 的肽或多肽(即，蛋白)神經(jīng)生長因子(NGF)、免疫球蛋白(Ig)(例如， Ig K鏈前導(dǎo)序列)、和中期因子(MK)、或其片段。適宜的ER定位信號(hào)肽 還包 舌Ladunga, Current Opinaions in Biotechnology, 13-18 (2000)中所描述的那些。
盡管所述核酸序列可以編碼任何蛋白，但是所述蛋白優(yōu)選地是GAD 蛋白或腦啡肽。存在一些由一些不同的基因編碼的哺乳動(dòng)物GAD的同種 型，具體地為GAD25、 GAD65禾n GAD67。 GAD65，主要靶向膜和神經(jīng) 末梢，受到吡哆醛-5-磷酸和其它輔因子的調(diào)控。認(rèn)為GAD65在制備突觸 釋放中負(fù)責(zé)將GABA包裝成小泡。另一種哺乳動(dòng)物GAD的同種型GAD67 主要是在細(xì)胞質(zhì)中，并且其酶促活性似乎受蛋白水平的調(diào)控。GAD25是 GAD67的備選剪接的變體。所述載體優(yōu)選地包括編碼GAD67的核酸序 列。人GAD67基因的編碼序列和所編碼的基因產(chǎn)物(即，所編碼的蛋白) 的氨基酸序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI)網(wǎng)址 上分別作為GenBank登記號(hào)NM—000817 (SEQ ID NO: l)和NP—000808 (SEQIDNO:2)而可以公共獲得。類似地，人腦啡肽基因的編碼序列和所 編碼的基因產(chǎn)物(即，所編碼的蛋白)的氨基酸序列作為GenBank登記 號(hào)NMJ)06211可以公共獲得。
所述核酸序列可以編碼前面提及的蛋白的任何變體、同系物或功能片 段。所述蛋白的變體可以包括來自相應(yīng)的天然存在的蛋白的一個(gè)或多個(gè)突 變(例如，點(diǎn)突變、缺失、插入等)。"天然存在"意指所述蛋白可以在自 然界中找到，并且沒有進(jìn)行合成修飾。因此，在將突變引入到編碼所述蛋 白的核酸序列中的情形中，這樣的突變理想地將影響所編碼的蛋白中的取 代，其中編碼正電荷殘基(H、 K和R)的密碼子用編碼正電荷殘基的密碼 子取代，編碼負(fù)電荷殘基(D和E)的密碼子用編碼負(fù)電荷殘基的密碼子取 代，編碼中性極性殘基(C、 G、 N、 Q、 S、 T和Y)的密碼子用編碼中性 極性殘基的密碼子取代，以及編碼中性非極性殘基(A、 F、 I、 L、 M、 P、 V和W)的密碼子用編碼中性非極性殘基的密碼子取代。另外，蛋白的同 系物可以是任何肽、多肽或其片段，其與所述蛋白在氨基酸水平上有大于約70%的相同性(優(yōu)選地大于約80%的相同性，更優(yōu)選地大于約90%的
相同性，并且更優(yōu)選地大于約95%的相同性)。氨基酸相同性的程度可以 使用本領(lǐng)域已知的任何方法確定，諸如BLAST序列數(shù)據(jù)庫。"功能片段" 是在檢測(cè)水平上保留天然存在的、全長GAD蛋白的生物活性的GAD蛋 白的任何部分。通過表達(dá)所述載體的核酸序列而產(chǎn)生的GAD蛋白的功能 片段可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行鑒定，諸如在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 編碼GAD蛋白片段的核酸序列的人細(xì)胞中檢測(cè)所述GAD蛋白片段的生 物活性而進(jìn)行鑒定。
編碼所述蛋白的核酸序列的表達(dá)受到可操作性地連接到所述核酸序 列上的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列的控制。"表達(dá)控制序列"是促進(jìn)、增強(qiáng)或控 制另一種核酸序列表達(dá)(典型地和優(yōu)選地是轉(zhuǎn)錄)的任何核酸序列。適宜 的表達(dá)控制序列包括組成型啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、抑制性啟動(dòng)子和增 強(qiáng)子。在載體中編碼所述蛋白的核酸序列可以受到其內(nèi)源啟動(dòng)子的調(diào)控， 或者優(yōu)選地受到非內(nèi)在的啟動(dòng)子序列的調(diào)控。適宜的非內(nèi)在的啟動(dòng)子的實(shí) 例包括人巨細(xì)胞病毒(HCMV)啟動(dòng)子，諸如HCMV早早期啟動(dòng)子(HCMV IEp)、來源于人免疫缺陷病毒(HIV)的啟動(dòng)子諸如HIV長末端重復(fù)啟動(dòng)子、 磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子諸如RSV長末 端重復(fù)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、Lap2啟動(dòng)子、或皰疹胸苷激酶 啟動(dòng)子(Wagner等.，A^/.5W, 7S, 144-145 (1981))、來源于SV40 或埃巴病毒的啟動(dòng)子等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是HCMV IEp。 HCMV正p啟動(dòng)子可以插入到重組HSV的ICP4基因座。備選地， 編碼所述蛋白的核酸序列的表達(dá)可以受嵌合啟動(dòng)子序列的控制。如果它包 括獲自、源于、或者基于至少兩種不同來源(例如， 一種生物體基因座的 兩個(gè)不同區(qū)域、兩種不同的生物體或與合成序列組合的生物體)的至少兩 種核酸序列片段，那么啟動(dòng)子序列是"嵌合的"?？刹僮餍缘貙⑿蛄羞B接 到一起的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。
所述啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，即，應(yīng)答適當(dāng)?shù)男盘?hào)進(jìn)行上調(diào)和 /或下調(diào)的啟動(dòng)子。例如，由藥劑上調(diào)的表達(dá)控制序列特別用于疼痛處理 應(yīng)用。例如，所述啟動(dòng)子可以是藥物-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如，應(yīng)答四環(huán)素)。 這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例在市場(chǎng)上由Ariad銷售。所述啟動(dòng)子可以通過本領(lǐng)域己知的方法引入到載體的基因組中，例如，通過在基因組的給定區(qū)域引入 獨(dú)特的限制性位點(diǎn)進(jìn)行。備選地，可以插入所述啟動(dòng)子，作為包括編碼蛋 白諸如GAD的核酸序列的表達(dá)盒的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所
述可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作性地連接到編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列上。
優(yōu)選地，編碼蛋白的核酸序列還包括轉(zhuǎn)錄-終止區(qū)域，諸如位于編碼
所述蛋白的區(qū)域的3'的多聚腺苷化序列?？梢允褂萌魏芜m宜的多聚腺苷化 序列，包括合成的最優(yōu)化序列，以及下列各項(xiàng)的多聚腺苷化序列BGH(牛 生長素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(埃巴病毒)、和乳頭瘤病毒包 括人乳頭瘤病毒和BPV (牛乳頭瘤病毒)。
除了編碼蛋白的核酸(包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄-終止區(qū))，所述載體可以包 括編碼至少一種其它基因產(chǎn)物的至少一種其它的核酸序列，例如其本身行 使預(yù)防或治療功能，或者增加或增強(qiáng)所述蛋白的預(yù)防或治療潛力。由其它 核酸序列編碼的基因產(chǎn)物可以是具有需要的活性的RNA、肽或多肽。如 果所述其它核酸序列賦予預(yù)防或治療益處，那么所述核酸序列可以在 RNA或蛋白水平上行使其功能。備選地，所述其它核酸序列可以編碼反 義分子、核酶、影響剪接或3'加工(例如，多聚腺苷化)的蛋白、或影響 細(xì)胞內(nèi)另一種基因的表達(dá)水平(即，其中廣泛認(rèn)為基因表達(dá)包括從轉(zhuǎn)錄起 始到產(chǎn)生加工蛋白的所有步驟)的蛋白，諸如通過調(diào)控mRNA累積或轉(zhuǎn) 運(yùn)的變化速率或者轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的改變而進(jìn)行。其它的核酸序列可以編碼賦 予預(yù)防或治療益處的許多基因產(chǎn)物中的任何一種，這取決于組合物的想要 的最終用途。與由載體的核酸序列編碼的蛋白相比，所述其它的核酸序列 還可以編碼作用于不同靶點(diǎn)的因子，因而提供多因子的治療。所述其它核 酸序列可以編碼嵌合蛋白用于組合治療。其它基因產(chǎn)物可以是被分泌的， 或者保留在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)，除非或者直到細(xì)胞裂解它才產(chǎn)生。許多基 因產(chǎn)物可以增強(qiáng)所述載體的治療潛力。
所述其它核酸序列可以編碼一種基因產(chǎn)物或多種基因產(chǎn)物。備選地， 每種編碼一種或多種基因產(chǎn)物的多種其它核酸序列，可以插入到載體中。 在每種情形中，基因產(chǎn)物的表達(dá)可以獨(dú)立地受各自的表達(dá)控制序列的調(diào) 控，或者同時(shí)受一種共有表達(dá)控制序列的調(diào)控。備選地，其它核酸的表達(dá)可以由同一表達(dá)控制序列調(diào)控，所述同一表達(dá)控制序列調(diào)控由載體的核酸 序列編碼的蛋白的表達(dá)；然而，可以消除在編碼所述蛋白的核酸中存在的 任何轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以允許所述其它核酸序列的連讀轉(zhuǎn)錄。所述其它核酸序 列可以包括本文所討論的任何適宜的表達(dá)控制序列和任何適宜的轉(zhuǎn)錄-終 止區(qū)，其與所述載體的核酸序列表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白的表達(dá)相聯(lián)系。
在產(chǎn)生所述載體后，將所述載體純化。載體純化增加所述載體在組合 物中的濃度，這可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)現(xiàn)，諸如通過密度梯度純化， 通過層析技術(shù)，或者有限稀釋純化而進(jìn)行。將所述載體，優(yōu)選地復(fù)制缺陷
型HSV載體，理想地從感染復(fù)制缺陷型HSV載體的細(xì)胞中純化，純化使 用包括將感染HSV載體的細(xì)胞裂解并且收集含有HSV載體的級(jí)分的方法 進(jìn)行。
可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒呀饧?xì)胞，諸如暴露于去污劑、冷凍-解凍 以及細(xì)胞膜破裂(例如，通過弗氏壓碎器或微觀流體化作用)。然后，任 選地使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖT如溫和的離心、過濾或切向流過濾(TFF)，將 細(xì)胞裂解物澄清化，以去除大塊的細(xì)胞碎片。然后，任選地將澄清的細(xì)胞 裂解物用能夠消化DNA和RNA的酶("DNase/RNase")處理，以去除澄 清的細(xì)胞裂解物中不包含在載體顆粒中的任何DNA或RNA。
一般地，當(dāng)可以將足夠的病毒遞送到細(xì)胞群以保證所述細(xì)胞面臨預(yù)先 確定數(shù)量的病毒時(shí)，本發(fā)明的重組HSV是最有用的。因此，本發(fā)明提供 一種儲(chǔ)液，優(yōu)選地一種均勻的儲(chǔ)液，其包括本發(fā)明的HSV載體。HSV儲(chǔ) 液的制備和分析在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，病毒儲(chǔ)液可以在包含用HSV 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的搖瓶中制備。然后，可以在連續(xù)的尼可登梯度上純化所 述病毒儲(chǔ)液，并且等分和保存直到需要時(shí)。病毒儲(chǔ)液在滴度上變化很大， 這主要取決于病毒的基因型和用于制備它們的流程和細(xì)胞系。優(yōu)選地，這 樣的儲(chǔ)液具有至少約1()S個(gè)蝕斑形成單位(pfiO，諸如至少約106pfb，或者 甚至更優(yōu)選地至少約107 pfU的病毒滴度。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，滴度 可以至少約108pfo，或者至少約109pfU，并且最優(yōu)選至少約10"pfu或者 至少約1011 pfo的高滴度儲(chǔ)液。
本發(fā)明另外提供一種組合物，所述組合物包括HSV載體(vector)和 媒介物(carrier),優(yōu)選地生理學(xué)可接收的媒介物。所述組合物的媒介物可以是用于載體的任何適宜的媒介物。所述媒介物典型地將是液體，而且可 以是固體、或液體和固體成分的組合。所述媒介物理想地是藥用(例如， 生理學(xué)上或藥物學(xué)上可接受的)媒介物(例如，賦形劑或稀釋劑)。藥用 媒介物是公知的，并且容易獲得。媒介物的選擇將至少部分地由具體的載 體和用于施用所述組合物的具體的方法所確定。所述組合物還包括任何其 它適宜的成分，特別用于增強(qiáng)所述組合物的穩(wěn)定性和/或其最終用途。因 此，存在本發(fā)明組合物的廣泛種類的適宜的制劑。下述制劑和方法只是示 例性的，并且決不是限制性的。
適于腸胃外施用的制劑包括水性的和非水性的、等滲的無菌注射溶 液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得所述制劑與目的受體 的血液等滲的溶質(zhì)，以及水性的和非水性的無菌混懸液，其可以包括混懸 劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。所述制劑可以以單位劑型或多劑 型密封容器諸如安瓿和小瓶存在，并且可以以冷凍-干燥(凍干)狀態(tài)保 存，在使用之前，只需要立即加入無菌液體賦形劑如水就可用于注射。臨 時(shí)注射溶液和混懸液可以從先前所述的類型的無菌粉劑、粒劑和片劑制備。
另外，所述組合物可以包括其它治療的或生物活性劑。例如，可以存 在用于具體指征治療的治療因子?？刂蒲装Y的因子，諸如布洛芬或類固醇， 可以是組合物的成分，以減少與體內(nèi)施用所述載體以及生理窘迫有關(guān)的腫 脹和炎癥。免疫系統(tǒng)抑制劑可以與所述組合物方法一起施用，以減少針對(duì) 所述載體本身的或者與疾病相關(guān)的任何免疫反應(yīng)。備選地，所述組合物可 以包含免疫增強(qiáng)劑，以上調(diào)機(jī)體針對(duì)疾病的自然防御。
可以存在抗生素，即，殺微生物劑和殺真菌劑，以減少與基因轉(zhuǎn)移步 驟相關(guān)的感染以及其它疾病的危險(xiǎn)。
本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物中治療脊髓損傷疼痛或外周神經(jīng)性疼痛的 方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的載體或組合物，所述載體或 組合物包括有效治療脊髓損傷疼^或外周神經(jīng)性疼痛的量的編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所施用的載 體是病毒載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。
治療脊髓損傷疼痛或外周神經(jīng)性疼痛的方法還可以包括其它治療和/或藥劑的施用(即，施用前、同時(shí)施用和/或施用后)以改進(jìn)(例如，增 強(qiáng))所述方法的效用。本發(fā)明的方法還可以包括施用局部或全身性地改變 (即，消除或增強(qiáng))所述組合物對(duì)宿主的作用的其它物質(zhì)。例如，消除通 過在宿主中表達(dá)所述載體的核酸序列而產(chǎn)生的蛋白的任何全身性作用的 物質(zhì)可以用來控制在宿主內(nèi)的全身性毒性水平。類似地，增強(qiáng)通過在宿主 中表達(dá)所述載體的核酸序列而產(chǎn)生的蛋白的局部作用的物質(zhì)可以用來減 少在宿主中產(chǎn)生預(yù)防性或治療性作用所需要的蛋白的水平。這樣的物質(zhì)包 括拮抗劑，例如，可溶受體或針對(duì)通過表達(dá)所述載體的核酸序列而產(chǎn)生的 蛋白的抗體，以及所述蛋白的激動(dòng)劑。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，給動(dòng)物(特別是人)施用本發(fā)明的創(chuàng)造 性載體和組合物用于治療或預(yù)防目的如基因治療、接種等(參見，例如，Rosenfeld等，5We"ce， 252, 431-434 (1991), Jaffe等，C"". L, "(2), 302A (1991), Rosenfeld等.，C"".39(2), 311A(1991), Berkner,歷orec/2m々wes， 6, 616-629 (1988))的適當(dāng)方法是可用的，并且，盡管不止一種途徑可以用 來施用所述組合物，但是， 一種特別的途徑可以提供比另一種途徑更直接 的和更有效的反應(yīng)。優(yōu)選的施用途徑包括通過外周接種轉(zhuǎn)導(dǎo)DRG神經(jīng)元， 以在背角質(zhì)中釋放GABA。在許多實(shí)施方案中，這可以通過皮下接種遞送 GAD載體而實(shí)現(xiàn)，這是所述治療SCI疼痛或外周神經(jīng)性疼痛的創(chuàng)造性方 法的吸引人的特征。
在本發(fā)明的情形中，施用給動(dòng)物特別是人的劑量將隨著具體的載體、 含有所述載體和其媒介物(如上文所述)的組合物、施用的方法、以及具 體的位點(diǎn)和要治療的生物體而不同。所述劑量應(yīng)該足以在理想的時(shí)限內(nèi)引 發(fā)理想的反應(yīng)，例如，治療性或預(yù)防性反應(yīng)。因此，所述本發(fā)明組合物的 載體的劑量典型地為大約1乂105或更多顆粒單位(例如，大約1乂106或 更多顆粒單位、大約1乂107或更多顆粒單位，1X1()S或更多顆粒單位、1 X 109或更多顆粒單位、1 X 101Q或更多顆粒單位、1 X 1011或更多顆粒單位、 或者大約1X1(^或更多顆粒單位)。載體的劑量典型地將不是1乂1013或 更少的顆粒單位(例如，4乂1012或更少的顆粒單位、1X10"或更少的顆粒單位、ixio"或更少的顆粒單位、或者甚至ixi(r或更少的顆粒單位)。
下述實(shí)例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但是，當(dāng)然，不應(yīng)該以任何方式解釋成限制本發(fā)明的范圍。在這些實(shí)例中，記錄并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析了一些檢測(cè)。
使用變量的多變量分析和用于無參量檢測(cè)的Kmskal-Wallis檢驗(yàn)，確定在 載體處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用斯氏t檢驗(yàn) (Student's t test)進(jìn)行單一比較，使用<0.05的尸值作為顯著性。所有的數(shù) 據(jù)都表示為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
實(shí)施例1
本實(shí)例說明GAD載體的構(gòu)建。
非復(fù)制型HSV載體QHGAD67在HSV早早期(正)基因ICP4、ICP22、 ICP27和ICP47的表達(dá)上是缺陷型的，并且包含人GAD67基因，其受控 于在Ujl基因座的人巨細(xì)胞病毒早早期啟動(dòng)子(HCMVIEp)(圖1)。對(duì) 照載體Q0ZHG (按照在Chen等. / P ra/, 7《21)， 10132-41 (2000)中所述的 方法構(gòu)建)缺失相同的基因，但是在相同的位置含有大腸桿菌(^&c/^n'c/n^ co//) lacZ報(bào)告基因(圖1)。
將GAD67 cDNA (按照Bu， D.F.,等.，尸rac. A^/.爿cW. f/W,砂， 2115-2119 (1992)所述的方法構(gòu)建)作為人巨細(xì)胞病毒早早期啟動(dòng)子下游 的Clal/Xbal片段單獨(dú)地亞克隆到穿梭質(zhì)粒p41H中，其包含啟動(dòng)子和充 分的HSV兩側(cè)DNA序列，以使得能夠在所述載體的Ul41基因座進(jìn)行有 效的同源重組。通過用Pmel-消化的病毒和靶點(diǎn)質(zhì)粒DNA同時(shí)轉(zhuǎn)染互補(bǔ) 的7b細(xì)胞，而將表達(dá)/靶點(diǎn)盒重組到載體QOZHG的UWl基因座，以用 GAD表達(dá)構(gòu)建體取代LacZ標(biāo)記基因。重組QHGAD67通過3輪限制稀釋 純化法進(jìn)行純化，并且遺傳結(jié)構(gòu)通過DNA印跡進(jìn)行確定。載體儲(chǔ)液在搖 瓶中在7b細(xì)胞中生產(chǎn)，在連續(xù)的尼可登梯度上純化，并且等分并保存在 -80°C，直到使用時(shí)解凍。最終載體產(chǎn)物的滴度按照Krisky, D.，等.，In MeA。(is /"她/ecw/ar AfWc/"e， Human Press, Totowa， NJ (1996)中所述的 方法進(jìn)行確定。
實(shí)施例2
本實(shí)例說明具有ICP4和ICP27基因座的延長缺失以及UL55的缺失 的HSV載體的構(gòu)建。
構(gòu)建這一載體的圖示在圖14中列出。具體地，將質(zhì)粒d106(Hadjipanayis和DeLuca， Can Res 65(12): 5310-6 (2005))與質(zhì)粒TOZ.l (Arafat等.，Clin Can Res 6: 4442-8 (2000))病毒性雜交，產(chǎn)生QOZHG,l。載 體QOZHG.l的詳情在實(shí)施例1中所述，并且它的構(gòu)建在Chen等.,J Virol 74(21)， 10132-41 (2000)中所述。
將質(zhì)粒pPXE (Niranjan等.，Mol Ther 8(4):530-42 (2003))重組至U QOZHG.l的ICP27基因座中，以挽救先前的ICP27缺失，并且去除 HCMV-eGFP基因。然后，分離單一的重組子，純化，并且通過選擇在熒 光顯微鏡下不表現(xiàn)出綠色熒光的蝕斑而進(jìn)行驗(yàn)證。重組子叫作E1。 El對(duì) 于GFP基因是陰性的，對(duì)于LacZ基因是陽性的。
通過將含有UL41編碼序列的Hind III到Not I片段(HSV-1基因座 核苷酸90145到93858)克隆到pBSSK (Stratagene)的Hind III和Not I位 點(diǎn)，而產(chǎn)生質(zhì)粒41HN。然后將質(zhì)粒41HN重組到E1的UL41基因座，以 挽救野生型UL41基因，并且去除LacZ。將得到的命名為El-l的載體通 過標(biāo)準(zhǔn)方法分離，純化，并且驗(yàn)證。這一載體對(duì)于gQ)和lacZ基因都是陰 性的。
質(zhì)粒pSASB3的構(gòu)建，是通過將HSV-1 KOS毒株基因組的Sph I到 Afl III (Sal I連接的)片段(1928 bp)(核苷酸124485-126413)克隆到Sph I/Sal I消化的pSP72中，然后將695 bp的Bgl II到BamH I片段(核苷酸131931 到132626)插入到所述載體質(zhì)粒的Bgl II到BamH I位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的，其中 所述695 bp的Bgl II到BamH I片段含有ICP4啟動(dòng)子上游區(qū)域，所述ICP4 啟動(dòng)子包括在短反向重復(fù)區(qū)域所含有的病毒起點(diǎn)。
通過將HCMV-eGFP片段克隆到pSASB3的BamH I位點(diǎn)而構(gòu)建質(zhì)粒 pSASB3gfj)。然后，將質(zhì)粒pSASB3gfiD重組到El-l的ICP4基因座，以 擴(kuò)展ICP4缺失。然后，將得到的命名為ElG6/dl06-4HG的載體通過標(biāo)準(zhǔn) 方法分離，純化，并且驗(yàn)證。
質(zhì)粒pSASB3-HPPE通過將來自Dr. Steven Wilson, University of South Carolina (Liu F, Housley PR， Wilson SR [J Neurochem. 1996 Oct;67(4): 1457-62]的質(zhì)粒pCMV-hPPE的EcoR I到Sal I片段在獨(dú)特的Sal I位點(diǎn)克 隆到質(zhì)粒pSASB3中而產(chǎn)生，其中所述質(zhì)粒pCMV-hPPE含有HCMV早早期啟動(dòng)子、來自SV40的16s/19s RNA的SV40內(nèi)含子(180 bp Xhol-Pstl)、完整的hPPE編碼序列和SV40多聚腺苷化信號(hào)(SV40堿基 2533-2729)。通過先前的EcoR I消化，然后通過克列諾片段補(bǔ)平EcoR I 位點(diǎn)，并且用SalI接頭連接，而使得hPPE表達(dá)構(gòu)建體的SalI釋放成為 可能。然后，將這一連接的產(chǎn)物用SalI消化，以純化SalI兩側(cè)的表達(dá)構(gòu) 建體。pCMV- hPPE從來自Dr. Barbara Spruce的cDNA克隆pUR292亞克 隆而來，其作為來自pUR292的946 bp的BamH I-Hind III片段，所述片 段末端被補(bǔ)平，加上NotI接頭，并且克隆到表達(dá)質(zhì)粒pCMV卩的獨(dú)特Not I位點(diǎn)。
最終的腦啡肽表達(dá)/ ICP4靶點(diǎn)構(gòu)建體(pSASB3-HPPE)含有下述元件 1) HSV基因組的堿基131931-132626，以提供靶向ICP4基因座的5'重組 側(cè)翼序列，2)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)早早期啟動(dòng)子(正p)， 3)SV40 16s/19s 內(nèi)含子剪接供體和受體位點(diǎn)，4)前腦啡肽原cDNA， 5)SV40晚期多聚腺 苷化信號(hào)，6) HSV基因組的堿基124485-126413，以提供耙向ICP4基因 座的3'重組側(cè)翼。
然后將質(zhì)粒pSASB3-hppe重組到ElG6/dl06-4HG的ICP4基因座， 以產(chǎn)生NurelPl'(NPl)載體，其通常叫作6221。
質(zhì)粒PS-UB6R-6通過將兩側(cè)為Bgl II - BamH I的泛蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 的Red2 (Invitrogen)克隆到PSP4的BamH I位點(diǎn)而產(chǎn)生。PSP.4的BamH I 位點(diǎn)位于5' ICP27側(cè)翼片段和UL56編碼序列之間。
將質(zhì)粒PS-UB6R-6重組到NP1的ICP27基因座，以擴(kuò)展ICP27缺失 使其包括所有的ICP27和UL55，并且插入U(xiǎn)B6-Red基因。將命名為 HPPE6221R的得到的載體分離，純化，并且通過選擇紅色蝕斑進(jìn)行驗(yàn)證。
質(zhì)粒PSP4通過將ICP27編碼序列5'的EcoR I到BamH I (HSV-1基 因組110095到113322)序列克隆到質(zhì)粒PS.2中而產(chǎn)生。PS.2含有連接到 pBSSK (Stratagene)的Not I位點(diǎn)的Dde I到Sma I (HSV-1基因組片段 116156到117119)平端。
將質(zhì)粒PSP4重組到HPPE6221R載體的ICP27基因座中，以去除 UB6-Red并且保留ICP27/UL55缺失。將得到的命名為NurelP2 (NP2)的載 體通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離，純化，并且驗(yàn)證。
將質(zhì)粒pSASB3GFP重組到NP2的ICP4基因座中，以用HCMV-eGFP 取代HCMV-hppe。將得到的命名為SAS2的質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離，純 化并且驗(yàn)證。
將質(zhì)粒pRC2 (Invitrogen)順序地通過改變下列各項(xiàng)進(jìn)行修飾1)將 HinDIII位點(diǎn)變成ClaI位點(diǎn)，2)將BbvII位點(diǎn)變成HinDIII位點(diǎn)，3)將得 到的HinDIII位點(diǎn)變成BglII位點(diǎn)，以制備質(zhì)粒pRC2HB2。將大約1200 個(gè)堿基對(duì)的pRC2HB2的BglII片段克隆到質(zhì)粒pSASB3的BamHI位點(diǎn)， 產(chǎn)生質(zhì)粒pSHB3。獨(dú)立地，通過將HinDIII位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成BamHI位點(diǎn)而修 飾GAD67克隆，產(chǎn)生pGADHB2。將得到的來自pGADHB2的2.8kb BamHI 片段克隆到pSHB3的BamHI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pGADLl。
將質(zhì)粒pGAD-Ll重組到SAS2的ICP4基因座，以產(chǎn)生載體NurelG2 (NG2)。
載體NP2， SAS2和NG2是與所述細(xì)胞系沒有同源性的載體，以致在 所述細(xì)胞系和載體之間不會(huì)發(fā)生同源重組。因此，這些載體理想地與細(xì)胞 ICP4、 ICP27、 IL55互補(bǔ)株系組合用于載體產(chǎn)生。
實(shí)施例3
本實(shí)例說明通過GAD載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)GAD蛋白。 在將QHGAD67皮下接種到實(shí)驗(yàn)室大鼠后爪的足底表面后一周，在收 集的L4-L6 DRG中通過實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的GAD67 mRNA的量比用 QOZHG轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)側(cè)DRG高出5倍(圖2)。此外，與對(duì)側(cè)(注射賦形劑 的)DRG相比，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG中的GAD67免疫反應(yīng)性以所有大小的廣 譜DRG神經(jīng)元存在于神經(jīng)元中。與假接種的對(duì)照(0.025士0.006OD單位, P〈0.01二相比，通過蛋白質(zhì)印跡確定的GAD67蛋白在兩者腰部DRG中 顯著增加(0.048士0.009 OD單位)。
在皮下接種30 pl的11X10、fU/mlQHGAD67后一周，與對(duì)側(cè)(注射
賦形劑的)背角質(zhì)相比，在層ii和in顯著地觀察到增加的免疫反應(yīng)性。
在對(duì)照大鼠的淺表背角質(zhì)中，GAD67免疫反應(yīng)性顯著地位于層III的小圓 細(xì)胞中，具有似乎是淺表背角質(zhì)中的內(nèi)源GABA-ergic中間神經(jīng)元的極少 的神經(jīng)炎性延伸，以及似乎是靜脈曲張或小軸突末梢的一些更小的、加點(diǎn)的、濃密染色的、不規(guī)則的輪廓。在含有來自用QHGAD67轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG 的軸突中樞末梢的背角質(zhì)中，免疫染色的密度基本上增加，并且增加的免 疫反應(yīng)性似乎位于代表軸突末梢的不規(guī)則的輪廓中。通過蛋白質(zhì)印跡，與 假接種對(duì)照(0.027士0.004OD單位)相比，在含有這些軸突的中樞末梢的 腰節(jié)背部脊髓中的GAD的量(0.041±0.008 OD單位)顯著地增加(尸< 0.01，圖3)。
通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析GAD RNA進(jìn)行如下將L4-6 DRGs快速移出， 并且使用TriReagent (Sigma)從收集的L4-6中提取總RNA。在DNase I消 化后，使用Omniscript反轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen, Valencia, CA， USA)產(chǎn)生第一鏈 cDNA。使用Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)設(shè) 計(jì)針對(duì)GAD67和GAPDH的引物和探針(Synthegen, Houston, TX， USA)。 GAD67正向引物SEQIDNO:3;反向引物SEQ ID NO: 4;探針，SEQ ID NO: 5 (Synthegen);和CAPDH正向引物SEQ ID NO: 6;反向引物SEQ ID NO: 7;探針SEQ ID NO: 8 (Invitrogen)。 PCRs以50 jal的總體積在ABI Prism 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)中進(jìn)行。RNA的量使用 GAPDH作為內(nèi)部參照進(jìn)行確定，并且相對(duì)于用Q0ZHG轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG進(jìn)行 計(jì)算。每一PCR擴(kuò)增在3個(gè)孔中進(jìn)行，使用下述條件50°C 2分鐘和90 °C 10分鐘，然后在95'C 15s和在60'C l分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
GAD67蛋白的量通過蛋白質(zhì)印跡法確定，其按照下述流程將L4-L6 DRG或脊髓的腰部放大(lumbar enlargement) (L4到L6片段)的背部象限 區(qū)在勻漿緩沖液(100 mg組織/ml)中超聲，所述勻漿緩沖液由60 mM磷酸 鹽緩沖液，pH 7.4， 1 mM苯甲基磺酰氟和0.5% TritonX-100組成。使用 TL100超高速離心機(jī)(Beckman)將勻漿物在100,000 g離心15分鐘，并且 通過Bradford檢測(cè)法(BioRad, Hercules， CA, USA)測(cè)定上層清液中的總蛋 白。將蛋白在4-15% SDS梯度聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到硝基纖維 素膜(Immobilon-P， Millipore， Billerica， Ma, USA)上，用兔抗-GAD67 (1:4000, Chemicon, Temecula， CA， USA)溫育，然后用辣根過氧化物酶-綴合 的山羊抗-小鼠(l: 10,000， Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)溫育， 并且通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(NEN， Boston, MA， USA)進(jìn)行檢測(cè)。將膜去除條 帶，并且用兔抗p-肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照再次檢測(cè)。每一條帶的密度通過使用基于PC的成像分析系統(tǒng)(MCID， Imaging Research, Brock, Ontario, Canada)進(jìn)行定量密度計(jì)量而確定。
實(shí)施例4
本實(shí)例說明GABA在GAD載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中的增加的釋放。
在體外以感染復(fù)數(shù)(m.o.i.) 1轉(zhuǎn)導(dǎo)QHGAD67的初級(jí)DGR神經(jīng)元向 培養(yǎng)基中以基本大于從對(duì)照釋放的那些(2.3肚0,22pmmo1/10 μ1，P<0.01) 或從QOZHG-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG神經(jīng)元釋放的那些(2.56±0.54 pmol/10 pl， PO.Ol)的量釋放GABA (9.53±2.15pmol/10|il)(圖4A)。從通過提早1 周皮下接種到足部而轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG中樞末梢釋放到背部脊髓中的GABA的 體內(nèi)的量，通過從移植到身體同側(cè)腰部背角質(zhì)的導(dǎo)管的微量透析而確定。 與來自用QHGAD67接種的動(dòng)物的透析物(其含有1.46±0.25 pmol/10 pi) 相比，包含在從接種QOZHG的動(dòng)物收集的透析物中的GABA含有 0.74±0.24 pmol/10 μl (P<0.05) C圖4B)。
將從17天大的大鼠胚胎分離的DRG神經(jīng)元以10S個(gè)細(xì)胞/孔的密度接 種到24孔平板的聚-D-賴氨酸-處理的蓋玻片上。每個(gè)孔含有500 μl Neurobasal培養(yǎng)基，其包含B27、 Glutamax I、 Albumax II、和青霉素/鏈 霉素(Gibco-BRL, Carlsbad, CA)，補(bǔ)充了 100 ng/ml的7.0S NGF (Sigma, St. Louis，MO)。在培養(yǎng)的第14天，將所述細(xì)胞用m.ol 為1的QHGAD67或 Q0ZHG感染1小時(shí)，之后將病毒去除。48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成100pl 人造腦脊液，并且在5分鐘的收集時(shí)間后，將水浴溶液在10,000 g離心5 分鐘，并且提取上層清液用于通過HPLC確定GABA。 DRG細(xì)胞通過免 疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)GAD67蛋白的表達(dá)。
在體內(nèi)從背角質(zhì)神經(jīng)末梢釋放的GABA的量通過微量透析物的 HPLC而確定，其使用下述流程將大鼠用水合氯醛(400mg/kg)麻醉，將 位于脊髓腰節(jié)之上的Til和T12椎骨層去除，使硬膜保持完好，并且將 動(dòng)物固定在立體定位裝置上。使用加熱燈防止熱量損失，并且使用反饋傳 感器將體溫保持在37.5°C。使用尖針做出從側(cè)面到中線的小的硬膜切口， 并且將微量透析探針(CMA/11，銅紡?fù)肝瞿ぃL度lmm，直徑0.24mm， 分子截留6kDa， CMA/Microdialysis, Stockholm, Sweden)通過硬膜切口插入到背角質(zhì)中，并且以1μl/min的速度灌注人造腦脊液 (CMA/Microdialysis)。允許與細(xì)胞外流體平衡lh后，收集樣品1 h。在實(shí) 驗(yàn)后期，檢驗(yàn)探針氣泡的存在，并且通過顯微鏡檢灌注-固定的切片而檢 驗(yàn)在脊髓背角質(zhì)中的位置。
接著，使用具有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯衍生 作用(AccQ.Fluor Reagent Kit; Waters, USA)的HPLC，確定從轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞 體外釋放的GABA的量，或者從微量透析物體內(nèi)收集的GABA的量。將 20微升培養(yǎng)物溶液與20μl衍生劑在60 pi硼酸鹽緩沖液中混合；將10μl 樣品允許在55'C反應(yīng)10分鐘，并且通過梯度HPLC (Waters 2695 Separations Module)在AccQ.Taq column (3.9 x 150mm; Waters)柱上分離， 移動(dòng)相由洗脫液A(Waters)和乙腈組成，流速為1 ml/min。使用250 nm的 激發(fā)波長和395 nm的發(fā)射波長，通過在37。C的熒光(Waters 2475 Detector) 而檢測(cè)峰值。
按照下述流程，將鞘內(nèi)導(dǎo)管手術(shù)移植到實(shí)驗(yàn)室大鼠內(nèi)使用Storkson 方法的改良方法，在T13左脊髓半切斷后1周，放置鞘內(nèi)導(dǎo)管。簡要地， 將動(dòng)物用水合氯醛(400 mg/kg)重新麻醉，從中線左側(cè)幾毫米的L2到L6 做出縱向切口，并且將聚乙烯導(dǎo)管(PE-10, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA)從L4-L5的椎骨間隙引入到腰部蛛網(wǎng)膜下空間，以便導(dǎo)管末端位于 脊髓的腰部放大附近。導(dǎo)管的遠(yuǎn)端皮下穿行，出現(xiàn)在頸部，留下7pl的死 空間(deadspace)。在移植鞘內(nèi)導(dǎo)管后，將大鼠籠養(yǎng)在單個(gè)的籠中，并且 將表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)功能障礙的那些動(dòng)物處死。導(dǎo)管末端的位置通過灌注15 pl 的利多卡因(20 mg/ml)，然后灌注8 pl的鹽水產(chǎn)生持續(xù)20-30分鐘的運(yùn)動(dòng) 麻痹而檢驗(yàn)。通過使用與清醒的暫時(shí)受約束的大鼠中鞘內(nèi)導(dǎo)管連接的微量 注射器(Hamilton Co.， Reno， NV, USA)進(jìn)行鞘內(nèi)藥物施用。
實(shí)施例5
本實(shí)例說明在實(shí)驗(yàn)室大鼠中皮下接種GAD載體減少SCI后的機(jī)械性 異常性疼痛和熱痛覺過敏。
在T13左側(cè)脊髓半切斷后1天，所有動(dòng)物都表現(xiàn)出同側(cè)后肢麻痹，在 與脊髓半切斷的對(duì)側(cè)的后肢中沒有運(yùn)動(dòng)功能障礙。脊髓半切斷后2周，有相當(dāng)多的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)(BBB得分12-13，數(shù)據(jù)未顯示)。BBB得分12， 其與頻繁-到-始終 一 致的重量-支持幻覺(frequent-to-consistent weight-supporting phantom)步驟和臨時(shí)的前腿-后腿協(xié)調(diào)相對(duì)應(yīng)，足以允 許體覺-誘導(dǎo)的爪收縮的完全行為測(cè)試。脊髓半切斷后1周，在兩只后爪 中觀察到機(jī)械性異常性疼痛，當(dāng)與手術(shù)前的閾值(11.2±1.68 g身體同側(cè), 11.6±1.71 g身體對(duì)側(cè))相比時(shí)，其表現(xiàn)為后爪退縮閾值顯著減少到等級(jí)系 列的vonFrey纖絲刺激(1.71士0.35g身體同側(cè)，1.9±0.52 g身體對(duì)側(cè))。脊髓 半切斷后1周在兩側(cè)后爪的足底表面皮下接種QHGAD67 (1 x 109 pfU/ml, 30pl/爪)，在接種后l周(損傷后2周)檢測(cè)，顯著增加了后爪退縮閾值
(4.4±1.12 g身體同側(cè)，4.1±0.75 g身體對(duì)側(cè))。接種Q0ZHG的對(duì)照動(dòng)物在 它們的機(jī)械性閾值中沒有表現(xiàn)出變化(與QHGAD67比較，1.8士0.28g身 體同側(cè)，L6士0.34g身體對(duì)側(cè)，尸O.01)。最大抗異常性疼痛作用(g卩，爪退 縮閾值的增加)發(fā)生在QHGAD67接種(5.19±0.82 g身體同側(cè)和5.8±1.14 g身體對(duì)側(cè))后兩周，并且抗異常性疼痛作用持續(xù)5周，在接種后六周減 少到2.86土0.63g身體同側(cè)和3,2士0.47g身體對(duì)側(cè)(圖5A和5B)。在初始 接種后六周用相同劑量的QHGAD67重新接種到兩側(cè)足墊重新建立了抗 異常性疼痛作用。通過重新接種獲得的作用的數(shù)量級(jí)至少同通過初始注射 所述載體而產(chǎn)生的作用的數(shù)量級(jí)一樣大，并且通過重新接種產(chǎn)生的作用的 持續(xù)時(shí)間比由初始接種引起的作用的持續(xù)時(shí)間略微長一些(6-7周)。在所 有時(shí)刻，在QOZHG-接種的和賦形劑-處理的大鼠之間的爪退縮閾值中不 存在顯著差異(圖5A和5B)。
在脊髓半切斷后，動(dòng)物還表現(xiàn)出熱痛覺過敏，與手術(shù)前的值(12.6±1.23 s身體同側(cè)，12.1±1.25 s身體對(duì)側(cè))相比，其表現(xiàn)出應(yīng)答有害熱刺激的退縮 潛伏期的減少(6.7士0.51 s身體同側(cè)，6.9±0.6 s身體對(duì)側(cè))。QHGAD67接種 后1周(脊髓半切斷后2周)，與Q0ZHG-接種的對(duì)照(6.5士0.43 s身體同側(cè)， 7.1±0.42 sec身體對(duì)側(cè))相比，在熱潛伏期中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加
(8.8±0.48 s身體同側(cè)，8.7±0.71 s身體對(duì)側(cè))。除了峰值作用發(fā)生在接種后 4周(9.7士0.71 s身體同側(cè)，9.62士0.78s身體對(duì)側(cè))以外，抗痛覺過敏作用 的時(shí)間過程與所述載體的抗異常性疼痛作用的時(shí)間過程相似(圖5C和 5D)。在第6周重新接種QHGAD67載體也重新建立了抗痛覺過敏作用。
第二次接種后的抗痛覺過敏作用的持續(xù)時(shí)間和數(shù)量級(jí)比在初始接種后的 那些更久和更大。在任何時(shí)間階段，在賦形劑-處理的和Q0ZHG-接種的動(dòng)物之間的兩只后爪退縮潛伏期中沒有顯著差異(圖5C和5D)。
對(duì)于這些測(cè)試，使用雄性Sprague-Dawley大鼠，體重175-200 g。籠 養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)方法受到University of Pittsburgh, Institutional Animal Care and Use Committee的核準(zhǔn)。將大鼠在水合氯醛麻醉(400 mg/kg)下，通過 觸摸最末的肋骨(與T13附著)而定位T11-T12脊椎層。做出縱向切口， 暴露一些片段，并且在兩個(gè)椎節(jié)(T11-T12)進(jìn)行椎板切除術(shù)。通過伴隨 的背部血管而確定腰部放大，并且使用11號(hào)解剖刀在T13進(jìn)行脊髓半切 斷，小心不要損傷主要的背部血管和血管分支。將具有28-線規(guī)針頭的結(jié) 核菌素注射器背腹地置于脊索中線，并且側(cè)面推進(jìn)，以保證完成脊髓半切 斷。將肌肉和筋膜縫合關(guān)閉，并且將皮膚用自動(dòng)小夾封閉。手術(shù)后，將動(dòng) 物保持在相同的手術(shù)前條件下。在手術(shù)后3小時(shí)內(nèi)所有的動(dòng)物都進(jìn)食和飲 水。使用BBB運(yùn)動(dòng)等級(jí)量表(Locomotor Rating Scale)觀察并記錄運(yùn)動(dòng)功 能，以保證與脊髓半切斷同側(cè)的肢體的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)足以允許體覺行為測(cè)試。 在那時(shí)將在兩只后肢都表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)損失的動(dòng)物(這表明兩側(cè)皮層脊髓束反 式作用)排除在研究外。然后，將符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物用載體接種。每組6只 動(dòng)物用載體接種，并且通過重現(xiàn)接種進(jìn)行檢驗(yàn)。
機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的行為測(cè)試在生理周期的白天部分 (8:00 AM到5:00 PM)進(jìn)行。通過使用一系列von Frey纖絲(0.4， 0.7， 1.2， 1.5， 2.0， 3.6, 5.5, 8.5， 11.8和15.1 g)檢測(cè)應(yīng)答等級(jí)性機(jī)械刺激的爪退縮閾 值，而評(píng)估機(jī)械性異常性疼痛。將大鼠置于底部有網(wǎng)孔的透明的塑料室中， 持續(xù)至少30分鐘，以使之適應(yīng)環(huán)境，之后將vonFrey纖絲以強(qiáng)度上升的 順序連續(xù)應(yīng)用到足的足底表面，力量足以引起爪輕微彎曲并且保持6 s。 將針對(duì)von Frey纖絲應(yīng)用的敏銳的足退縮視為陽性反應(yīng)，并且引起進(jìn)行下 一次更弱的刺激。熱痛覺過敏通過檢測(cè)針對(duì)輻射熱源的爪退縮的潛伏期而 進(jìn)行評(píng)估。在這種測(cè)試中，將大鼠置于燈箱上的玻璃盤上。10分鐘的適 應(yīng)期后，將爪的足底表面暴露于一束通過玻璃板應(yīng)用的輻射熱。當(dāng)大鼠舉 起四肢時(shí)，通過光電池自動(dòng)關(guān)閉光束，允許檢測(cè)光束開始和爪退縮之間的 時(shí)間。這一時(shí)間定義為爪退縮時(shí)間。測(cè)試總是在5分鐘的時(shí)間間隔進(jìn)行3次，并且將20秒用作截?cái)鄷r(shí)間。
實(shí)施例6
本實(shí)例說明GAD載體接種的行為作用被比枯枯靈堿和phaclofen逆轉(zhuǎn)。
使用GABAA受體-選擇性拮抗劑比枯枯靈堿和GABAB受體-選擇性拮 抗劑phaclofen，檢驗(yàn)QHGAD67-介導(dǎo)的抗疼痛作用的藥理學(xué)基礎(chǔ)。給手 術(shù)后兩周的假手術(shù)動(dòng)物鞘內(nèi)施用比枯枯靈堿(0.5昭；Sigma)或phaclofen (0.8 pg; Sigma)沒有改變機(jī)械閾值或熱潛伏期。給接種QHGAD67的具有 脊髓半切斷的大鼠施用相同劑量的比枯枯靈堿，在藥物施用后10-15分鐘 檢測(cè)，將與脊髓半切斷同側(cè)的機(jī)械閾值從4.87±1.13 g減小到3.5±0.7 g (尸<0.05)，將與脊髓半切斷對(duì)側(cè)的機(jī)械閾值從5.75±1.41 g減小到3.38±0.9 g(尸O.Ol)(圖6A)。鞘內(nèi)phaclofen將與脊髓半切斷同側(cè)的機(jī)械閾值減小 到3.6±0.78 g (尸<0.05)，將與脊髓半切斷對(duì)側(cè)的機(jī)械閾值減小到4.05±0.75 g (尸<0.05)(圖6A)。熱退縮潛伏期，通過施用比枯枯靈堿，在身體同側(cè) 從9.28±1.39 s減小到7.23±1.21 s (P<0.05)，在身體對(duì)側(cè)從9.56±1.5 s減小 到7.4U1.29 s (P<0.05)，并且通過施用phaclofen,在身體同側(cè)減小到 7.54±1.16s(P<0.05)，在身體對(duì)側(cè)減小到7.66±1.24s(P<0.05)(圖6B)。在 每種情形中，藥物的作用通過在藥物施用后30分鐘的峰值作用進(jìn)行檢測(cè)。 接種后1小時(shí)，不再存在任何可檢測(cè)到的藥物作用。在用Q0ZHG接種并 且用相同劑量的比枯枯靈堿或phaclofen處理的大鼠脊髓半切斷中，在機(jī) 械閾值或熱潛伏期中沒有顯著變化。
實(shí)施例7
本實(shí)例說明用GAD載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)減小了背角質(zhì)中的CGRP免疫反應(yīng)性。
在假手術(shù)的動(dòng)物中，在L5部分的CGRP免疫反應(yīng)性是微弱的，主要 限制在身體兩側(cè)脊髓的淺表背角質(zhì)內(nèi)的層I和11。左側(cè)T13半切斷后1周， CGRP免疫反應(yīng)性增加，并且可以延伸到兩側(cè)背脊髓的層III和IV而檢測(cè) 到染色。在兩只后爪接種QHGAD67后1周，在脊髓半切斷的大鼠中，與用QOZHG接種的脊髓半切斷的大鼠(107.3±22.4 OD單位身體同側(cè)， 86±23.5單位身體對(duì)側(cè)，P〈0.05)或賦形齊lJ-處理的動(dòng)物(96.7土21.8OD 單位身體同側(cè)，104.6士22.6 0D單位身體對(duì)側(cè)，P〈0.05)相比較，CGRP-樣免疫反應(yīng)性減小(76.5士13.3 0D單位身體同側(cè)，63.6士12.40D單位身 體對(duì)側(cè))。在QOZHG-接種的和賦形劑-處理的動(dòng)物之間在染色上不存在顯 著差異(圖7)。
通過免疫組織化學(xué)確定GAD蛋白在未損傷的轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)物中的分布以及 CGRP肽在損傷的轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)物中的分布。將大鼠心內(nèi)(intracardially)灌注4% 低聚甲醛的O.l M磷酸緩沖液，將脊髓L5片段和附著的根部去除，而后 在相同的溶液中固定2小時(shí)，并且用30%蔗糖的PBS溶液冷凍保護(hù)2天。 將20微升冷凍液解凍，包埋在冷的Superfrost顯微鏡載玻片(Fisher, Pittsburgh, PA, USA)上，并且在4。C與兔抗-GAD67 (1:2000， Chemicon)或 兔抗-CGRP (1:500， PLI, San Carlos, CA， USA)溫育過夜，然后在室溫下與 熒光抗-兔IgG (Alexa Fluor 594, 1:500， Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 溫育2小時(shí)。通過共聚焦顯微鏡(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI USA)捕獲熒光成像。
實(shí)施例8
本實(shí)例說明，使用單純皰疹病毒載體將編碼GAD的基因轉(zhuǎn)移到背根 神經(jīng)節(jié)減輕了外周神經(jīng)性疼痛。
重225-250 gm的雄性Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行選擇性L5 SNL (按照 Hao等.，Pain; 102: 135-42 (2003)所述)。SNL后一周，將30 pi載體 (QHGAD67或QOZHG，每毫升4X 108個(gè)蝕斑形成單位)皮下注射到與 連接在身體同側(cè)的左后爪的足底表面。通過評(píng)估針對(duì)等級(jí)抗張強(qiáng)度的von Frey毛發(fā)的爪退縮反應(yīng)(參見Hao等.，supra,和Chaplan等.，J Neurosci Methods, 53:55-63 (1994))，而確定由SNL誘導(dǎo)的機(jī)械性異常性疼痛，觸 覺剌激產(chǎn)生使用上-下方法(up-down method)(參見Dixon等,，Annu Rev Pharmacol Toxicol; 20:441-62 (1980))確定的50%的退縮可能性。熱痛覺過 敏使用Hargreaves裝置(如Hargreaves等.，Pain; 32:77-88 (1988)中所述)進(jìn) 行確定，所述裝置記錄從直接放置在后爪下的輻射熱刺激的退縮時(shí)間。
在L5 SNL后，大鼠表現(xiàn)出激發(fā)針對(duì)vonPrey毛發(fā)刺激的敏銳的退縮 反應(yīng)所必需的機(jī)械刺激的量級(jí)的顯著減小(圖IIA)，以及在從熱刺激隨后 的對(duì)退縮的潛伏期中的顯著減小(熱痛覺過敏；參見圖IIB)。接種 QH-GAD67的大鼠從接種后1周開始在機(jī)械閾值上表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的 增加。QHGAD67-介導(dǎo)的GABA表達(dá)的抗異常性疼痛作用保持并且繼續(xù)， 持續(xù)5-6周，并且在接種后2周達(dá)到峰值(參見圖IIA)。機(jī)械閾值的峰 值，8.6gm，接近手術(shù)前的值。到接種后7周，載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗異常性疼痛 作用消失，并且QHGAD67-注射大鼠的機(jī)械性閾值與對(duì)照大鼠的相同。 用相同劑量的QHGAD67重新接種到同一爪重建了抗異常性疼痛作用(參 見圖11A)。 SNL誘導(dǎo)熱潛伏期從10.7減小到6.5秒，其在逐漸恢復(fù)之前 持續(xù)3周。接種QHGAD67的大鼠從接種后1周開始在身體同側(cè)爪的熱潛 伏期中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(參見圖IIB)，所述作用保持并且繼續(xù)， 持續(xù)3-4周(參見圖IIB)。假手術(shù)的動(dòng)物在機(jī)械性閾值或熱潛伏期中沒 有變化。
由溫柔觸摸誘導(dǎo)的c-Fos和磷酸化胞外信號(hào)-調(diào)控激酶1和2 (p-ERKl/2)的表達(dá)是疼痛過程的一種間接生物標(biāo)記(Catheline等.，Pain; 92:389-98 (2001))。 SNL后3周，進(jìn)行溫柔觸摸，每4秒鐘1次，持續(xù)10 分鐘，用實(shí)驗(yàn)者拇指的平面觸摸大鼠的爪，并且免疫反應(yīng)細(xì)胞(抗-c-Fos 或抗-p-ERK1/2抗體；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)的數(shù)目檢 測(cè)抗生物素蛋白-生物素辣根過氧化物酶，然后是鎳-增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺 (Vector Laboratories, Bur- lingame， CA)。與假手術(shù)的對(duì)照大鼠相比，在與 SNL的身體同側(cè)，F(xiàn)os-LI-陽性神經(jīng)元的數(shù)目基本上增加了，并且接種載 體QHGAD67顯著地減少了層I-VI中Fos-LI-陽性神經(jīng)元的數(shù)目(參見圖 12)。在溫柔觸摸刺激后，在具有SNL的大鼠中p-ERKl/2在層I和II中 的表達(dá)也增加了，并且所述增加在接種QHGAD67的動(dòng)物中得到阻滯。在 假手術(shù)動(dòng)物中，p-ERK沒有受到IO分鐘的溫柔觸摸刺激的誘導(dǎo)，但是在 接種QOZHG的動(dòng)物中在脊神經(jīng)連接(SNL)后，p-ERK基本上得到誘導(dǎo)。 在接種QHGAD67的動(dòng)物中，觸摸誘導(dǎo)的p-ERKl/2的表達(dá)受到抑制，這 通過計(jì)數(shù)在背角質(zhì)中的p-ERKl/2-陽性神經(jīng)元而證實(shí)(圖13)。
這些結(jié)果表明，在外周神經(jīng)性疼痛模型中，皮下接種表達(dá)GAD的HSV載體以便在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)DRG減弱了機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的行為表現(xiàn)；對(duì)行為的作用由表明在身體同側(cè)脊背角質(zhì)中誘導(dǎo)c-Fos和p-ERKl/2 表達(dá)的組織學(xué)檢測(cè)而證實(shí)。
討論
實(shí)驗(yàn)室大鼠脊髓在T13的側(cè)面半切斷在兩只后肢中損傷以下產(chǎn)生兩 側(cè)的SCI疼痛相關(guān)的行為("SCI模型")。SCI疼痛相關(guān)的行為表現(xiàn)為機(jī) 械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。這一現(xiàn)象伴隨兩側(cè)的脊髓重組。在上文提 及的實(shí)驗(yàn)中，這種SCI模型用來檢驗(yàn)由于GAD載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到腰 部DRG引起的GABA的局部生產(chǎn)和釋放在減輕一些SCI疼痛表現(xiàn)中的作 用。
用編碼GAD的HSV載體("GAD載體")轉(zhuǎn)導(dǎo)DRG神經(jīng)元。這些 轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG神經(jīng)元在體外和體內(nèi)表達(dá)GAD。 GAD在這些細(xì)胞中的表達(dá) 導(dǎo)致GABA的釋放。在進(jìn)行T13脊髓側(cè)面半切斷然后皮下接種GAD載體 的實(shí)驗(yàn)室大鼠中，來自轉(zhuǎn)導(dǎo)的DRG神經(jīng)元的局部GABA釋放減輕了后肢 的機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。這一作用可以被GABAa或GABAb 受體拮抗劑逆轉(zhuǎn)，所述拮抗劑被給予的劑量不改變正常動(dòng)物的痛覺或進(jìn)行 T13脊髓側(cè)面半切斷而沒有皮下接種GAD載體的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的痛覺。此 外，GAD載體介導(dǎo)的GABA釋放還減弱在腰部背角質(zhì)中SCI后發(fā)生的 CGRP免疫反應(yīng)性的增加。因此，包括GAD載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到DRG 的所述本發(fā)明的方法可以有效地用于治療平面以下神經(jīng)性SCI疼痛。
在含有60 mM K+的培養(yǎng)基中，GABA從體外轉(zhuǎn)導(dǎo)GAD載體的初級(jí) DRG神經(jīng)元的釋放沒有增加，并且不被從培養(yǎng)基中移除02+而受影響， 這表明GABA釋放不是囊泡式的，而是組成型發(fā)生的，可能通過GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻轉(zhuǎn)而發(fā)生。盡管在體內(nèi)從神經(jīng)末梢釋放的GABA的量足以顯 著升高背角質(zhì)微量透析物中的GABA水平，但是在這些動(dòng)物中沒有運(yùn)動(dòng) 缺點(diǎn)的證據(jù)，這表明轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)GABA釋放局限于背角質(zhì)。這與下述觀 察一致，即，通過皮下接種表達(dá)腦啡肽原的HSV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)物獲得局 限于與所述接種在身體同側(cè)的肢體的止痛作用。
在具有未損傷的脊髓的實(shí)驗(yàn)室大鼠中，低閾值傳入輸入的增強(qiáng)的GABA-ergic抑制作用調(diào)節(jié)感覺處理，并且GABA受體功能的比枯枯靈堿 阻斷產(chǎn)生疼痛相關(guān)的行為。電生理學(xué)研究表明，GABAa和GABAb受體都 引起脊髓水平的疼痛神經(jīng)傳遞的增強(qiáng)的調(diào)控。外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致背角質(zhì)中 GABA水平的減少，和部分神經(jīng)損傷后在背角質(zhì)中初級(jí)傳入激發(fā)的抑制性 后突觸電流的減少。然而，這些現(xiàn)象是否是由GABA-ergic中間神經(jīng)元的 丟失或如在中樞致敏作用中發(fā)現(xiàn)的GABA受體的脫敏作用所引起，沒有 完全確定。已經(jīng)報(bào)道了在脊髓缺血的光化誘導(dǎo)后腰部脊髓中的GABA免 疫反應(yīng)性的瞬時(shí)減少，但是先前的研究沒有檢驗(yàn)半切斷平面以下的GABA 免疫反應(yīng)性。但是，由于GAD載體轉(zhuǎn)導(dǎo)DRG神經(jīng)元引起GABA向半切 斷平面以下的背角質(zhì)的組成型遞送減弱了 SCI后機(jī)械性異常性疼痛和熱 痛覺過敏的行為檢測(cè)。這表明，SCI疼痛對(duì)GABA的調(diào)控敏感。
己經(jīng)在一些試驗(yàn)中評(píng)估了 baclofen對(duì)中樞神經(jīng)性疼痛的作用，通常在 簡短(brief)試驗(yàn)中有陽性結(jié)果，但是只有較少顯著的長期減輕。在SCI缺 血性模型中，鞘內(nèi)施用baclofen部分減輕了慢性機(jī)械性和冷異常性疼痛。 在神經(jīng)性疼痛的慢性收縮性損傷模型中，鞘內(nèi)移植GABA-釋放細(xì)胞逆轉(zhuǎn) 了神經(jīng)性疼痛的一些表現(xiàn)。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，GAD載體介導(dǎo)的GABA釋放的疼 痛減輕作用持續(xù)幾個(gè)星期的過程。
沒有檢測(cè)GABA隨時(shí)間釋放的量。然而，觀察到，在止痛作用后重 新接種GAD載體減弱了重新建立機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏的減 輕。這一觀察證明治療作用的丟失不是由于耐受性的發(fā)展，而是由于基因 表達(dá)的減少。這與先前的研究的發(fā)現(xiàn)一致，所述先前的研究檢驗(yàn)其中轉(zhuǎn)基 因表達(dá)受到瞬時(shí)活化的人巨細(xì)胞病毒早早期啟動(dòng)子(HCMV正p)推動(dòng)的載 體。
沒有疼痛和疼痛減輕的"客觀(objective)"檢測(cè)。然而，在實(shí)驗(yàn)室中， 已經(jīng)用在SCI模型中損傷水平以下脊髓片段中CGRP免疫反應(yīng)性的量的 增加的檢測(cè)來檢測(cè)疼痛和疼痛減輕。不幸地，關(guān)于SCI模型中增加的脊髓 CGRP的現(xiàn)象所知甚少。還沒有確定負(fù)責(zé)水平以下CGRP增加的機(jī)制。免 疫反應(yīng)性的增加是否與在CGRP翻轉(zhuǎn)上增加的釋放相關(guān)是未知的。CGRP 是否在SCI疼痛現(xiàn)象中起任何作用或者是否作為SCI的副現(xiàn)象而發(fā)生也是 未知的。但是，在這些研究中發(fā)生在SCI后的CGRP的增加作為與疼痛
行為檢測(cè)的組織學(xué)相關(guān)性，類似于在外周神經(jīng)性疼痛的脊髓神經(jīng)連接模型 中由無害性觸摸誘導(dǎo)的c-fos免疫反應(yīng)性的增加。因此，CGRP檢測(cè)可以
用來確定GAD載體在治療SCI疼痛中的作用。盡管不希望受到任何具體 理論的束縛，但是由于CGRP位于主要投射到背角質(zhì)的層I、 II和V的無 髓鞘的和稀疏有髓鞘的傳入神經(jīng)處，所以據(jù)信CGRP的增加由初級(jí)傳入神 經(jīng)的萌發(fā)導(dǎo)致。GABA從GAD轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞釋放防止CGRP表達(dá)增加的機(jī) 制是未知的。
從前文，按照本發(fā)明，成功構(gòu)建了設(shè)計(jì)成表達(dá)人谷氨酸脫羧酶(GAD) 的非復(fù)制性HSV載體，并且將這一載體用于治療SCI疼痛以及外周神經(jīng) 性疼痛。這些實(shí)例說明包括包括應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移方法的本發(fā)明方法可以用來 轉(zhuǎn)導(dǎo)DRG神經(jīng)元，通過外周接種在背角質(zhì)中釋放GABA。這些實(shí)例還說 明包括使用GAD載體的基因轉(zhuǎn)移的本發(fā)明方法減輕SCI后的平面以下的 機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏。通過皮下接種遞送GAD載體的能力是 治療SCI疼痛以及外周神經(jīng)性疼痛的本發(fā)明方法的吸引人的特征。
除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、微生物學(xué)、 分子生物學(xué)的方法和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有 充分地解釋。(參見，例如，Sambrook，等.Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames禾卩S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames禾卩S. Higgins， eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology,第二版，Vol. I & II (B. N. Fields和D. M. Knipe, eds.))。
本文引用的所有的參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利，都通過 參考結(jié)合于此，它們以好像每一參考文獻(xiàn)單獨(dú)地并且具體地指明通過參考 結(jié)合并且在本文中完全提出一樣的程度結(jié)合。
術(shù)語"a"(—個(gè))禾口"an"(—個(gè))禾口"the"(這個(gè))以及類似的指示詞在 描述本發(fā)明的情形中(特別是在下述權(quán)利要求的情形中)的應(yīng)用應(yīng)該解釋 為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非在本文中另外指明或者與上下文明顯地相互抵 觸。除非另外指明，術(shù)語"comprising"(包括)，"having"(具有)，"including"(包括)以及"containing"(含有)應(yīng)該解釋成開放的術(shù)語(即，意指"包 括，但不限于")。除非本文另外指明，本文值的數(shù)值范圍的引用僅僅意欲 作為獨(dú)立地參考落入所述范圍內(nèi)的每一獨(dú)立值的速記方法，并且每一獨(dú)立 值如其在本文中獨(dú)立地引用那樣結(jié)合在說明書中。本文所述的所有方法可 以以任何適宜的順序進(jìn)行，除非本文另外指明或者另外與上下文明顯地相 互抵觸。任何以及所有實(shí)例的應(yīng)用，或者本文所提供的示例性語言(例如，"諸如")的應(yīng)用，僅僅是意欲更好地舉例說明本發(fā)明，并且不構(gòu)成本發(fā) 明的范圍的限制，除非另外要求。說明書中沒有語言應(yīng)該被解釋成是指實(shí) 施本發(fā)明重要的任何非要求的元素。
本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其包括本發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā) 明的最佳方式。當(dāng)考慮到前面的描述時(shí)，這些優(yōu)選實(shí)施方案的改變對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明人希望熟練的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)?應(yīng)用這些改變，并且本發(fā)明人意欲按照與本文詳細(xì)描述所不同的方式實(shí)施 本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括按照適用的法律允許的在附上的權(quán)利要求中引 用的主題的所有改進(jìn)和等價(jià)物。此外，在所有可能的改變中的上述元素的 任何組合都包含在本發(fā)明內(nèi)，除非本文另外指明或者另外與上下文明顯地相互抵觸。
權(quán)利要求
1.一種包括非擴(kuò)增子重組單純皰疹病毒(HSV)的載體，所述單純皰疹病毒包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列，所述載體包括ICP4、ICP27的延長的缺失以及UL55的缺失。
2. 權(quán)利要求1的載體，其中所述GAD蛋白是GAD67。
3. 權(quán)利要求1的載體，其還包括與編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操 作地連接的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
4. 權(quán)利要求1的載體，其還包括與編碼GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操 作地連接的人巨細(xì)胞病毒早早期啟動(dòng)子(HCMVIEp)。
5. 權(quán)利要求1的載體，其中所述編碼GAD蛋白的序列插入到重組HSV 的UL41、 ICP4或ICP27基因座。
6. 權(quán)利要求l的載體，其還缺失至少一種必需HSV基因。
7. 權(quán)利要求6的載體，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期 HSV基因。
8. 權(quán)利要求1的載體，其還缺失選自由下列各項(xiàng)組成的組的早早期基因 ICP22和ICP47，以及它們的組合。
9. 權(quán)利要求l的載體，其中所述重組HSV是復(fù)制缺陷型的。
10. —種病毒儲(chǔ)液，其包括權(quán)利要求1或9的載體。
11. 一種組合物，其包括權(quán)利要求1或9的載體和生理學(xué)可接受的媒介物。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的載體在用于制備治療哺乳動(dòng)物內(nèi)的脊髓損 傷疼痛或外周神經(jīng)性疼痛的藥物中的應(yīng)用。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
14. 一種HSV載體，其包括ICP4、 ICP27的延長的缺失以及UL55的缺 失。
15. 權(quán)利要求14的HSV載體，其還包括缺失至少一種其它必需HSV基 因。
16. 權(quán)利要求15的載體，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期 HSV基因。
17. 權(quán)利要求16的載體，其中所述早早期基因選自由下列各項(xiàng)組成的組:ICP22、 ICP47以及它們的組合。
18. 權(quán)利要求14的載體，其中所述重組HSV是復(fù)制缺陷型的。
19. 權(quán)利要求14的載體，其還包括轉(zhuǎn)基因。
20. 權(quán)利要求19的載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼GAD。
21. 權(quán)利要求19的載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼腦啡肽。
22. 權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)的載體在制備藥物中的應(yīng)用。
23. 與HSVICP4、 ICP27和UL55基因互補(bǔ)的細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供一種載體，優(yōu)選單純皰疹病毒(HSV)載體，其包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本發(fā)明還提供這樣的載體的儲(chǔ)液以及包括這樣的載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供治療哺乳動(dòng)物中的疼痛諸如脊髓損傷疼痛的方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效治療脊髓損傷疼痛的量的包括編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列的載體。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101203530SQ200580044783
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者戴維·J·芬克, 戴維·克里斯基, 約瑟夫·C·格格廖索, 達(dá)瑞恩·沃爾夫 申請(qǐng)人:匹茲堡大學(xué)高等教育聯(lián)邦體系;美國退伍軍人事務(wù)部