專利名稱：RSV、PIV和其它呼吸道病毒的RNAi調(diào)節(jié)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呼吸道病毒治療領(lǐng)域以及用于調(diào)控病毒復(fù)制的組合物和方法，特別涉及由寡核苷酸經(jīng)由RNA干擾對呼吸道病毒的某個(gè)基因(多個(gè))的下調(diào)，其中所述寡核苷酸通過吸入/鼻內(nèi)被局部施用到肺部和鼻通道或經(jīng)由注射/脈內(nèi)被施用到全身。
背景技術(shù)：
呼吸道的天然功能要求其暴露于大量能夠引起各種呼吸疾病的空氣傳播病原體。在發(fā)達(dá)國家，呼吸道病毒感染是嬰兒住院治療的最普遍原因，在美國預(yù)計(jì)每年有91,000人因此住院，花費(fèi)3億美元。人呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)是呼吸道疾病的兩個(gè)主要因素。同時(shí)，它們感染上下呼吸道，導(dǎo)致哮吼、肺炎和細(xì)支氣管炎(Openshaw，P.J.M..Respir.Res.3(Suppl 1)，S15-S20(2002)，Easton，AJ.，et al.，Clin.Microbiol.Rev.17，390-412(2004))。一歲以下嬰兒僅RSV感染就達(dá)到了65％，兩歲以下的所有兒童基本上都被感染。在老年人中它也是發(fā)病和死亡的主要原因。RSV感染后的免疫既不完全又不持久，因此在所有的年齡組都存在反復(fù)感染。經(jīng)歷RSV細(xì)支氣管炎的嬰兒在其生命的晚期很可能發(fā)展成哮鳴和哮喘。對RSV的有效治療和疫苗的研究在近四十年已經(jīng)取得了一些成果(Openshaw，P.J.M..Respir.Res.3(Suppl 1)，S15-S20(202)，Maggon，K.et al，Rev.Med.Virol.14，149-168(2004))。但目前仍沒有一種針對RSV或PIV的疫苗在臨床中是有效的。兩種病毒的株系也存在于非人類的動(dòng)物中，例如牛、山羊、豬和綿羊，農(nóng)業(yè)、牛奶場和肉類加工業(yè)因此遭到了重大損失(Easton，A.J.，et al.，Clin.Microbiol.Rev.17，390-412(2004))RSV和PIV都包含非節(jié)段性的負(fù)鏈RNA基因組(nonsegmentednegative-strand RNA genome)并且屬于Paramyxoviridae科。這些病毒的許多特征都增加了對它們預(yù)防和治療的困難。由于RNA基因組缺乏復(fù)制校閱機(jī)制所以病毒基因組會(huì)高速突變，這給可靠疫苗或抗病毒藥的設(shè)計(jì)提出了重大的挑戰(zhàn)(Sullender，W.M.Clin. Microbiol.Rev.13，1-15(2000))。有希望的RSV融合蛋白質(zhì)(F)的抑制劑被放棄，其中部分原因?yàn)椴《景l(fā)展了繪制到F基因的抗性突變(Razinkov，V，et.al.，Antivir.Res.55，189-200(2002)，Morton，C.J.et al.Virology311，275-288(2003))。兩種病毒與細(xì)胞蛋白質(zhì)的聯(lián)合增加了獲得用于疫苗接種的無細(xì)胞病毒材料的困難(Burke，E.，et al.，Virology 252，137-148(1998)，Burke，E.，et al.，J.Virol.74，669-675(2000)，Gupta，S.，et al.，J.Virol.72，2655-2662(1998))。最后，這兩種病毒，尤其是RSV的免疫學(xué)非常的復(fù)雜(Peebles，R.S.，Jr.，et al.，Viral.Immunol.16，25-34(2003)，Haynes，L.M.，et al.，J.ytrol 77，9831-9844(2003))。變性的RSV蛋白質(zhì)作為疫苗的使用導(dǎo)致“免疫強(qiáng)化”或疫苗增強(qiáng)疾病(vaccine-enhanced disease)(Polack，F(xiàn).P.et al.J.Exp.Mea. 196，859-865(2002))，并且該現(xiàn)象對于PIV既沒有測試到也沒有被排除。最近結(jié)束的許多抗RSV生物藥物方案強(qiáng)調(diào)了所有問題。
RSV基因組包含單股負(fù)鏈RNA(single strand of negative sense RNA)，該RNA長度為15,222個(gè)核苷酸并能產(chǎn)生11個(gè)主要蛋白質(zhì)。(Falsey，A.R.，and E.E.Walsh，2000，Clinical Microbiological Reviews 13371-84.)這些蛋白質(zhì)中的兩個(gè)，F(xiàn)(融合)和G(附著)糖蛋白是主要的表面蛋白并且是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最重要的蛋白。SH(小分子疏水)蛋白、M(基質(zhì))蛋白、和M2(22kDa)蛋白與病毒包膜相關(guān)但不誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。N(主要核殼關(guān)聯(lián)蛋白)、P(磷蛋白)和L(主要聚合酶蛋白)蛋白質(zhì)與病毒體RNA相關(guān)。兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2，估計(jì)參與宿主-病毒交互作用，但不存在于感染性病毒體中。
人RSV株系被分成兩大類，A和B。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G糖蛋白在RSV蛋白中是最不同(divergent)。兩類RSV之間或之內(nèi)的RSV G糖蛋白的變異性確信對于RSV引起疾病年度爆發(fā)的能力是重要的。G糖蛋白包含289-299個(gè)氨基酸(根據(jù)RSV株系)，并且具有細(xì)胞內(nèi)、跨膜、和高度糖基化的90kDa的柄結(jié)構(gòu)(stalkstructure)，還有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。糖蛋白以分泌和結(jié)合有膜的形式存在。
目前還沒有治療RSV感染的成功方法(Maggon and Barik，2004，Reviews inMedical Virology14149-68)。在大部分情況下RSV引起的下呼吸道感染是自限性疾患。對于具有疾病的嬰兒和兒童如何治療或何時(shí)入院或出院沒有確定的指導(dǎo)方針或規(guī)范。與RSV感染有關(guān)的缺氧可以通過鼻套管用氧氣治療。對呼吸衰竭、休克、或復(fù)發(fā)呼吸暫停的兒童進(jìn)行機(jī)械換氣能夠降低死亡率。一些醫(yī)師的處方使用了類固醇。然而，許多研究已經(jīng)顯示類固醇治療不能對具有細(xì)支氣管炎入院的嬰兒和兒童的臨床療程產(chǎn)生效果。這樣，單獨(dú)使用皮質(zhì)甾類或與支氣管擴(kuò)張藥聯(lián)合使用可能對除了健康的通氣不暢的患者之外的細(xì)支氣管炎的治療是無效的。在具有如下潛在心肺疾病的嬰兒和兒童中，如支氣管肺性語言障礙癥(bronchopulmonary dysphasia)和哮喘，也已經(jīng)使用類固醇。
自從1980年代中期，具有抗病毒活性的鳥苷類似物利巴韋林也被用于治療患有RSV細(xì)支氣管炎的嬰兒和兒童，但許多研究已經(jīng)評(píng)價(jià)它的使用已經(jīng)顯示出不一致的結(jié)果。在大部分中心，現(xiàn)在已經(jīng)限制利巴韋林用于免疫妥協(xié)患者和那些具有嚴(yán)重疾病的患者。
RSV細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度已經(jīng)與低血清視黃醇濃度相關(guān)聯(lián)，但是對就醫(yī)的RSV細(xì)支氣管炎兒童的試驗(yàn)已將顯示出維生素A的補(bǔ)充沒有提供有益效果。對于RSV的下呼吸道感染進(jìn)行靜脈注射1500mg/kg RSV免疫球蛋白或吸入100mg/kg免疫球蛋白的治療試驗(yàn)也沒有顯示出實(shí)質(zhì)上有益效果。
在發(fā)達(dá)國家，RSV下呼吸道感染的治療一般限制于癥狀治療。因?yàn)楦哔M(fèi)用和缺乏效果一致性，抗病毒治療通常限于生命危機(jī)的情況。在發(fā)展中國家，輸氧是主要療法(當(dāng)可以利用時(shí))，并且是通過預(yù)防降低死亡率的唯一方式。
RNA干擾或“RNAi”是最初由Fire與其同事創(chuàng)造的術(shù)語，用于描述觀察到的雙鏈RNA(dsRNA)引入蠕蟲時(shí)能夠阻礙基因表達(dá)(Fire et al，Nature 391806-811，1998)。在許多生物體中，包括脊椎動(dòng)物，短dsRNA指導(dǎo)基因特異的轉(zhuǎn)錄后沉默，并提供了一種新的研究基因功能的工具。RNAi已經(jīng)被建議作為開發(fā)新一類治療劑的方法。然而，到目前為止，由于沒有RNAi能夠用于治療的證據(jù)，該方法通常是個(gè)建議。
因此，需要一種針對RSV的安全和有效的疫苗，尤其是對嬰兒和兒童的安全和有效的疫苗。還需要用于治療所有年齡階段的RSV感染和免疫妥協(xié)個(gè)體的試劑和方法。還需要一種科學(xué)的方法以表征對RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答，這樣可以研究疾病的發(fā)病機(jī)制，并有利于篩選可用的治療劑和疫苗。本發(fā)明克服了目前該領(lǐng)域存在的缺陷，其是通過提供有效調(diào)制或預(yù)防RSV和PIV甚至其它呼吸道病毒感染的方法和組合物而實(shí)現(xiàn)的。特別是本發(fā)明通過提供已經(jīng)顯示出降低體內(nèi)RSV和PIV水平的iRNA試劑和這類分子治療活性的展示發(fā)展了該領(lǐng)域。而且本發(fā)明證明了一種以上的病毒能夠同時(shí)治療。
發(fā)明概述本發(fā)明基于鼻內(nèi)施用RNAi試劑以及腸胃外施用該試劑可抑制RSV和PIV的體內(nèi)證據(jù)。而且，本發(fā)明顯示了同時(shí)使用兩種不同的iRNA試劑治療處理一種以上的病毒能夠有效地降低病毒效價(jià)。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了通常的和特定的組合物和方法用于降低受試者如哺乳動(dòng)物例如人的RSV或PIVmRNA水平、RSV或PIV蛋白水平以及RSV和PIV病毒效價(jià)。這些發(fā)現(xiàn)可被應(yīng)用于其它呼吸道病毒。
本發(fā)明特別提供了iRNA試劑，該試劑的組成為或包含有RSV、PIV或其它呼吸道病毒基因之一的基因中的15個(gè)連續(xù)核苷酸，特別是RSV或PIV的P基因和RSV的N、G、F、SH、M和L基因。iRNA試劑優(yōu)選每條鏈包含少于30個(gè)核苷酸，例如21-23個(gè)核苷酸。雙鏈iRNA試劑或者具有平末端或者更優(yōu)選在試劑的一個(gè)或兩個(gè)3’末端具有1-4個(gè)核苷酸的突出端。
而且，iRNA試劑或者僅包含天然存在的核糖核苷酸亞單位、或者可通過合成以包含一個(gè)或多個(gè)位于該試劑的核糖核苷酸亞單位的糖或堿基上的修飾。也可以進(jìn)一步修飾iRNA試劑使其粘附到配體上，該被選擇的配體是用于改進(jìn)試劑的穩(wěn)定性、分布或?qū)缒懝檀嫉脑噭┑募?xì)胞吸收。進(jìn)一步地，iRNA可以是被分離出的單獨(dú)形式或是作為藥物組合物的一部分用于本文描述的方法，特別是作為配制成可遞送到肺部或鼻道的藥物組合物或配制成胃腸道外給藥劑型的藥物組合物。藥物組合物可以包含一種或多種iRNA試劑，并且在一些實(shí)施方案中，可以包含兩種或多種iRNA試劑，其中，每種針對不同的呼吸道病毒，例如RSV和PIV。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種降低細(xì)胞中RSV、PIV或其它呼吸道病毒mRNA的方法。本發(fā)明的方法利用RNA干擾相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制選擇性地降低細(xì)胞中病毒mRNA，其包含用本發(fā)明的抗病毒iRNA試劑中的一種接觸細(xì)胞的步驟。該方法可以直接實(shí)施于細(xì)胞或通過將本發(fā)明的iRNA試劑/藥物組合物中的一種施用于受試者而作用于哺乳動(dòng)物受試者。細(xì)胞中病毒mRNA的降低導(dǎo)致病毒蛋白產(chǎn)量的降低，并且在生物體中，導(dǎo)致復(fù)制病毒效價(jià)的降低。實(shí)施例用PIV和RSV證明了這個(gè)結(jié)論，并且該結(jié)論可以擴(kuò)展到其它呼吸道病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了降低細(xì)胞中兩種或多種呼吸道病毒mRNA水平的方法，每種mRNA來自不同的病毒。該方法利用RNA干擾相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制選擇性地降低細(xì)胞中不同病毒mRNA，其包含用本發(fā)明的兩種抗病毒iRNA試劑接觸細(xì)胞的步驟。該方法可以直接實(shí)施于細(xì)胞或?qū)⒈景l(fā)明的兩種iRNA試劑施用于受試者而作用于哺乳動(dòng)物受試者。細(xì)胞中的兩種病毒mRNA的降低導(dǎo)致兩種病毒蛋白產(chǎn)量的降低，并且生物體中，導(dǎo)致兩種病毒的復(fù)制病毒效價(jià)的降低。實(shí)施例用PIV和RSV以及同時(shí)施用多種iRNA試劑證明了這個(gè)結(jié)論。本發(fā)明的該實(shí)施方案可以應(yīng)用于任何兩種呼吸道病毒。
對于本發(fā)明的方法和組合物，例如所述方法和iRNA組合物，可以以本文描述的任何劑量和/或配方，以及本文描述的任何給藥方式而使用。特別重要的是本文顯示了iRNA試劑的鼻內(nèi)給藥，以及其在呼吸組織中抑制病毒復(fù)制的能力。該發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于其它呼吸道病毒，如實(shí)施例中顯示的PIV，也可應(yīng)用其它方式局部遞送到肺部，如通過吸入/噴霧法。
本發(fā)明的一個(gè)和多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)描述參考下面的附圖和附圖描述進(jìn)行。本發(fā)明的其它的特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將通過說明書、附圖、和權(quán)利要求的描述更加清楚。本申請以引用方式全文并入所有引證參考、專利、和專利申請的全部內(nèi)容。
附圖簡述

圖1.先體外后體內(nèi)(ex vivo)的抗病毒siRNA滴定。(a)RSV感染的A549細(xì)胞(先體外后體內(nèi))全蛋白免疫印跡分析，用肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profilin)作為內(nèi)部對照。方框中的數(shù)字表示siRNA處理后的靶PmRNA水平，其表示為占未治療水平的百分?jǐn)?shù)。在下面的三個(gè)組中，施用siRNA后4小時(shí)接種病毒。(b)RSV感染的小鼠中的肺感染病毒(每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)n＝8)，(c)HPIV3感染的小鼠中的肺感染病毒(每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)n＝8)。(d)與(b)相同，但除了無轉(zhuǎn)染試劑下施用siRNA之外。星號(hào)表示顯著抑制(P＜0.05)。siRNA描述在表1中。
圖2.在siRNA治療的鼠肺中病毒抗原在無IFN激活下被擊倒。a)施用siRNA后4小時(shí)接種病毒，接種4天后(4days p.i.)通過肺間接免疫組織學(xué)檢測病毒抗原(綠色，RSV；紅色，HPIV3)。(1)假性感染，用RSVP抗體探測；(2-6)RSV感染，用RSVP抗體探測；(7-8)HPIV3感染，用HPIV3抗體探測。然后使用siRNA(5nmole，約70μg)(1，2)無；(3)siRNA#1加上TransIT-TKO試劑；(4)siRNA#1，無試劑；(5)陰性對照siRNA加上TransIT-TKO試劑；(6)luc-siRNA加上TransIT-TKO；(7)無；(8)siRNA#4加上TransIT-TKO。代表的肺組織是接種5天(5days p.i.)(Bar＝400um)。(b)在施用siRNA后2天，使用RSV P DNA作為探針，通過不同量的肺組織總RNA印跡分析檢測siRNA#1的反義鏈。針對RSV NS1的探針沒有反應(yīng)，顯示了檢測的特異性。(c)IN siRNA(每只鼠10nmole或140μg)沒有激活高于檢測閥值(約10pg/ml)的類型I(IFN-α)或類型II(IFN-γ)的肺IFN，然而，在對照肺中，RSV感染激活了類型II和低水平的類型I。泳道1，siRNA#1；2，siRNA#4；3，Luc siRNA；4，無siRNA但有RSV感染(顯示誤差范圍)。siRNA被施用后2天和感染后4天獲取肺(每個(gè)圖中n＝4)，(d)通過間接免疫組織學(xué)測量siRNA介導(dǎo)的RSV和HPIV3的雙感染抑制(綠色，RSV；紅色，HPIV3)。(1，5)無siRNA；(2，6)siRNA#1，5納摩爾(70μg)；(3，7)siRNA#4，5納摩爾(70μg)；(4，8)siRNA#1和siRNA#4，每個(gè)5納摩爾。(1-4)用RSVP抗體探測；(5-8)用HPIV3抗體探測。施用siRNA4小時(shí)后接種病毒，并且接種4天后檢查肺組織(Bar＝400um)。
圖3.RSV和HPIV3雙感染下高濃度siRNA的競爭性病毒抑制。(a)實(shí)時(shí)PCR(體外)；(b)免疫印跡(體外)；(c)用羊抗病毒抗體進(jìn)行的肺免疫印跡。定量各個(gè)病毒N蛋白帶強(qiáng)度并表示為無siRNA治療肺樣品的百分含量。施用siRNA后4小時(shí)接種病毒，并且在接種5天后檢查(對于每個(gè)數(shù)值點(diǎn)，n＝4)肺組織。黑條，RSV；白條，HPIV3。顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖4.siRNA#1治療的鼠體內(nèi)肺病理的減輕和哮喘標(biāo)記的降低，(a)呼吸速率；(b)肺組織病理；(c)白細(xì)胞三烯。在所有分析中P＜0.002；對于每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，n＝4；顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。施用siRNA后4小時(shí)接種病毒(70ug)。陰性對照siRNA治療的小鼠與未用siRNA治療的之間沒有差別(未顯示數(shù)據(jù))。
圖5.RSV疾病的siRNA治療效果。小鼠的RSV感染期間(a)體重和(b)肺病毒效價(jià)的改變。顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差；對于每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，n＝6。箭頭表示施用siRNA(70ug)的日期。
發(fā)明詳述為方便理解，本文有時(shí)使用的術(shù)語“核苷酸”或“核糖核苷酸”是指RNA試劑的一個(gè)或多個(gè)單體亞單位。應(yīng)當(dāng)理解的是，在修飾的RNA或核苷酸替代物的情況下，本文所用的術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指修飾的核苷酸、或替代物替換部分，如下面的一處或多處所作的描述。
本文所用的“RNA試劑”是未修飾的RNA、修飾的RNA或核苷替代物，它們均在本文有所描述或在RNA合成領(lǐng)域是熟知的。當(dāng)描述多個(gè)修飾的RNA和核苷替代物時(shí)，優(yōu)選的實(shí)例包括比未修飾的RNA具有更強(qiáng)的抵抗核酸酶降解能力的那些RNA。優(yōu)選的實(shí)例包括具有如下修飾的ARNA2’糖修飾、單鏈突出端的修飾，優(yōu)選3’單鏈突出端的修飾，或，尤其是，如果是單鏈，包括一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)類似物的5’修飾。
本文中，有時(shí)稱作“RNAi試劑”的“iRNA試劑”(“干擾RNA試劑”的縮寫)是RNA試劑，其能夠下調(diào)目標(biāo)基因如RSV的表達(dá)。不期望受到理論的限制，iRNA試劑可以通過一個(gè)或多個(gè)機(jī)制作用，包括靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后切割，該mRNA在本領(lǐng)域有時(shí)是指RNAi，或轉(zhuǎn)錄前或翻譯前機(jī)制。iRNA試劑可以包括一個(gè)單鏈或可以包括一個(gè)以上的單鏈，例如其可以是雙鏈(ds)iRNA試劑。如果iRNA試劑是單鏈，那么其特別是優(yōu)選包括5’修飾，該5’修飾包括一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)類似物。
本文的“單鏈iPNA試劑”是單分子組成的iRNA試劑。其可以包括通過鏈內(nèi)配對形成的雙鏈區(qū)，例如其可以是，或包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)或鍋柄結(jié)構(gòu)。單鏈iRNA試劑優(yōu)選反義于靶分子。
本文的“dsiRNA試劑”(“雙鏈iRNA試劑”的縮寫)是包括多于一個(gè)，優(yōu)選2個(gè)鏈的iRNA試劑，其鏈間雜交可形成雙鏈區(qū)。
本文描述的包括dsiRNA試劑和siRNA試劑的分離出的單獨(dú)iRNA試劑可以介導(dǎo)靶基因的沉默，例如通過RNA降解。方便起見，該RNA在本文也指被沉默的RNA。這樣的基因也指靶基因。優(yōu)選地，被沉默的RNA是內(nèi)源RSV基因的產(chǎn)物。
如本文所用，短語“介導(dǎo)RNAi”是指試劑以序列特異性方式沉默靶基因的能力?！俺聊谢颉笔且环N過程，當(dāng)不與試劑接觸的時(shí)候，細(xì)胞包含和/或分泌基因的某些產(chǎn)物，當(dāng)與試劑接觸的時(shí)候，與不接觸試劑的相似細(xì)胞相比，細(xì)胞包含和/或分泌至少少于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的該基因產(chǎn)物。該靶基因的產(chǎn)物，例如，可以是信使RNA(mRNA)、蛋白或調(diào)控元件。
在本發(fā)明的抗病毒用途中，靶基因的沉默將導(dǎo)致細(xì)胞中病毒效價(jià)降低。如本文所用，“病毒效價(jià)降低”是指細(xì)胞產(chǎn)生的或在經(jīng)受病毒靶基因沉默的生物體中發(fā)現(xiàn)的存活病毒數(shù)量降低。細(xì)胞的病毒生成量的減少將首先導(dǎo)致經(jīng)過治療的受試者的組織中產(chǎn)生的可測量病毒量的減少和病毒感染癥狀程度的減輕。本發(fā)明的iRNA試劑也稱作“抗病毒iRNA試劑”。
如本文所用，“RSV基因”是指在RSV病毒基因組中所鑒別的任一個(gè)基因(參見Falsey，A.R.，and E.E.Walsh，2000，Clinical Microbiological Reviews 13371-84)。這些基因在本領(lǐng)域易于得知，它們包括F、G、SH、M、N、P和L基因。
如本文所用，“PIV基因”是指在PIV病毒基因組中所鑒別的任一個(gè)基因(參見GenBank Accession#NC_001796)。這些基因在本領(lǐng)域易于得知，它們包括N、P、C、D、V、M、F、HN和L基因。
如本文所用，“呼吸道病毒”是指在呼吸系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒。這些病毒包括，但不限于RSV、PIV、流感病毒、偏肺病毒、腺病毒、和冠狀病毒(如SARS)。
如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)”用于表示充分的互補(bǔ)，以致于本發(fā)明的化合物和靶RNA分子，如RSV、PIV或其它呼吸道病毒mRNA分子之間發(fā)生穩(wěn)定和特異性的結(jié)合。特異性結(jié)合需要互補(bǔ)充分，以避免低聚化合物與非靶序列在特異性結(jié)合所需的條件下的非特異性結(jié)合，該條件也就是在體內(nèi)分析或治療性處理下的生理?xiàng)l件，或體外分析時(shí)進(jìn)行分析的條件。非靶序列一般至少具有4個(gè)核苷酸的差異。
如本文所用，如果iRNA試劑降低了細(xì)胞中靶RNA編碼的蛋白的生成量，那么iRNA試劑就流分地互補(bǔ)于靶RNA，例如靶mRNA(例如靶RSV或PIVmRNA)。iRNA試劑也可以“嚴(yán)格地互補(bǔ)”(排除包含亞單位(一個(gè)或多個(gè))的SRMS)于靶RNA，例如靶RNA和iRNA試劑退火優(yōu)選形成雜交體，該雜交體均是由嚴(yán)格互補(bǔ)區(qū)內(nèi)的Watson-Crick堿基對形成?！俺浞只パa(bǔ)”的iRNA試劑可以包括嚴(yán)格互補(bǔ)于靶病毒RNA的內(nèi)部區(qū)域(例如至少10個(gè)核苷酸的區(qū)域)。而且，在一些實(shí)施方案中，iRNA試劑特異地識(shí)別單核苷酸的差異。在該情況下，如果發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格互補(bǔ)發(fā)生在此區(qū)域(例如單核苷酸差異在7個(gè)核苷酸以內(nèi))，那么iRNA試劑僅介導(dǎo)RNAi。優(yōu)選的iRNA試劑將基于或包含實(shí)施例提供的有義和反義序列，或由實(shí)施例提供的有義和反義序列組成。
如本文所用的，當(dāng)涉及第一個(gè)核苷酸序列和第二核苷酸序列比較的時(shí)候，“基本相同”是指第一核苷酸序列和第二核苷酸序列除了至多一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸取代(例如用尿嘧啶取代腺苷)外其它都相同。
如本文所用的，“受試者”是指由于病毒表達(dá)如RSV或PIV感染而患病并接受治療的或是被預(yù)防性處理以防止病毒感染的哺乳動(dòng)物生物體。受試者可以是任何哺乳動(dòng)物，如靈長目動(dòng)物、牛、馬、小鼠、大鼠、狗、豬、羊。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是人。
如本文所用的，治療RSV感染、PIV感染或其它的呼吸道病毒感染是指任何生物學(xué)終點(diǎn)或病理學(xué)終點(diǎn)的改善，其中所述終點(diǎn)是指1)部分由于受試者中存在的病毒所介導(dǎo)，和2)其結(jié)果可受病毒蛋白存在水平降低的影響。
如本文所用的，“聯(lián)合施用”是指給受試者施用兩種或多種試劑，尤其是兩種或多種iRNA試劑。試劑可以包含于單一的藥物組合物中并同時(shí)施用，或試劑包含在分開的劑型中并相繼施用于受試者。只要兩種試劑能眵在受試者體內(nèi)同時(shí)被檢測到，兩種試劑就可以說是聯(lián)合施用。
在許多情況下因?yàn)榻閷?dǎo)沉默的iRNA試劑可以在施用iRNA試劑組合物后維持幾天，所以可以每天少于一次的頻率施用該組合物，或，對于一些情況，在整個(gè)治療方案中僅施用一次。
iRNA試劑的設(shè)計(jì)和選擇本發(fā)明基于如下的證明，即局部施用iRNA試劑到肺和鼻通道后，體內(nèi)呼吸道病毒基因中的靶基因被沉默，從而導(dǎo)致病毒感染得到治療，其中所述施用是通過鼻內(nèi)施藥/吸入或通過注射進(jìn)行系統(tǒng)/非腸胃給藥。本發(fā)明進(jìn)一步將iRNA試劑的用途擴(kuò)展到一種以上的呼吸道病毒，并且使用兩種或多種試劑聯(lián)合給藥同時(shí)治療兩種病毒感染。
基于這些結(jié)果，本發(fā)明特別提供了能夠用于治療病毒感染、特別是呼吸道病毒和特別是RSV或PIV感染的iRNA試劑，該試劑是分離出的單獨(dú)形式或作為下述的藥物組合物。該試劑包括具有互補(bǔ)于病毒基因的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈和具有互補(bǔ)于有義鏈序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈。特別有益的試劑是包含來自RSV或PIV的P蛋白基因的核苷酸序列的iRNA試劑。RSV中的其它靶基因包括F，G，SH，M，N和L。PIV中的其它基因包括N，P，C，D，V，M，F(xiàn)，HN和L基因。在表1中提供了示例試劑。
候選的iRNA試劑可以通過執(zhí)行，例如，要作為iRNA靶點(diǎn)的病毒基因的基因步查分析來設(shè)計(jì)?？梢陨a(chǎn)和測試相應(yīng)于所有或部分轉(zhuǎn)錄區(qū)的重疊、毗連、緊密間隔(closely spaced)的候選試劑?？梢詼y試和分析每個(gè)iRNA試劑下調(diào)目標(biāo)基因表達(dá)的能力(參加下面“候選iRNA試劑的分析”)。
可以根據(jù)序列信息和所需特性合理地設(shè)計(jì)iRNA試劑。例如，可以根據(jù)候選雙鏈體的相關(guān)變性溫度設(shè)計(jì)iRNA試劑。一般地，雙鏈體的反義鏈的5’末端比其反義鏈的3’末端具有較低的變性溫度。
因此，本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的iRNA試劑，每個(gè)鏈包含至少15，16，17，18，19，20，21或23個(gè)核苷酸序列，如上所述，該序列與來自呼吸道病毒的基因、特別是RSV或PIV的P蛋白基因的部分基本相同。示例iRNA試劑包含來自表1提供的一個(gè)試劑中的且含有15個(gè)連續(xù)核苷酸的那些。
iRNA試劑的反義鏈長度應(yīng)該等于或至少是15，16，17，18，19，25，29，40或50個(gè)核苷酸。其長度應(yīng)該等于或少于50，40或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選的長度范圍是15-30，17-25，19-23，和19-21個(gè)核苷酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，試劑應(yīng)該包含來自表1的一個(gè)試劑的15個(gè)核苷酸。
iRNA試劑的有義鏈的長度應(yīng)該等于或至少是15，16，17，18，19，25，29，40或50個(gè)核苷酸。其長度應(yīng)該等于或少于50，40或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選的長度范圍是15-30，17-25，19-23，和19-21個(gè)核苷酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，試劑應(yīng)該包含來自表1的一個(gè)試劑的15個(gè)核苷酸。
iRNA試劑的雙鏈部分的長度應(yīng)該等于或至少是15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，29，40或50個(gè)核苷酸對。其長度應(yīng)該等于或少于50，40或30個(gè)核苷酸對。優(yōu)選的長度范圍是15-30，17-25，19-23，和19-21個(gè)核苷酸對。
表1中提供的試劑的每個(gè)鏈長度為21個(gè)苷酸。iRNA試劑包含19個(gè)核苷酸雙鏈區(qū)，試劑的雙鏈區(qū)的每個(gè)3’末端具有2個(gè)核苷酸突出。如本文所述，這些試劑能夠被修飾以獲得至少包含這些序列的一部分或/和寡核苷酸堿基和連接子的修飾的等同物。
一般地，本發(fā)明的iRNA試劑包含充分互補(bǔ)于病毒基因，如RSV或PIV的P蛋白的區(qū)域，并且就核苷酸而言足夠長，這樣，iRNA試劑或其片段能眵介導(dǎo)特異性病毒基因的下調(diào)節(jié)。本發(fā)明iRNA試劑的反義鏈優(yōu)選完全互補(bǔ)于病毒基因的mRNA基因，如本文的RSV或PIV的P蛋白的mRNA基因。然而，iRNA試劑和靶之間沒有必要完全互補(bǔ)，但是它們之間應(yīng)具有足夠的一致性以使得iRNA試劑或其切割產(chǎn)物能夠控制序列特異性沉默，例如通過對RSV mRNA的RNAi切割。
這樣，本發(fā)明的iRNA試劑包含有義鏈和反義鏈，每個(gè)鏈包含至少有16，17和18個(gè)核苷酸的序列，如上所述，除了每個(gè)鏈上少于1，2或3個(gè)核苷酸分別被其它核苷酸取代(如尿嘧啶取代腺苷)外，該序列與病毒基因、特別是是RSV或PIV的P蛋白基本上相同，同時(shí)其基本上保留抑制培養(yǎng)人細(xì)胞中的RSV表達(dá)，如下詳細(xì)說明。因此，除了引入相對于目標(biāo)病毒mRNA序列或在有義鏈和反義鏈之間的1，2或3個(gè)堿基錯(cuò)配外，這些試劑將與病毒基因、特別是RSV或PIV的P蛋白基因序列中的一個(gè)具有至少15個(gè)核苷酸相同。末端區(qū)域的相對于目標(biāo)病毒mRNA序列的錯(cuò)配最易被接受，尤其是在反義鏈中，而且，如果有錯(cuò)配出現(xiàn)的話，優(yōu)選存在于1個(gè)末端區(qū)域或多個(gè)末端區(qū)域，例如在5’和/或3’末端的6，5，4，或3個(gè)核苷酸中，最優(yōu)選是在有義鏈的5’末端或反義鏈的3’末端的6，5，4，或3個(gè)核苷酸中。有義鏈僅需要充分互補(bǔ)于反義鏈以維持分子的整體雙鏈特性。
優(yōu)選的是，選擇有義鏈和反義鏈以致于iRNA試劑的分子一端或兩端包含單鏈或未配對區(qū)域，例如表1中示例的那些。這樣，iRNA包含有義鏈和反義鏈，優(yōu)選它們配對后具有突出，例如一個(gè)或兩個(gè)5’或3’突出，但優(yōu)選2-3個(gè)核苷酸的3’突出。最優(yōu)選的實(shí)施方案是具有3’突出。優(yōu)選siRNA試劑具有單鏈突出，優(yōu)選在siRNA試劑的一個(gè)或兩個(gè)末端具有長度為1-4個(gè)、或優(yōu)選2或3個(gè)核苷酸的3’突出。突出是一個(gè)鏈長于另一個(gè)鏈得到的，或相同的兩條鏈錯(cuò)開后得到的。5’末端優(yōu)選被磷酸化。
優(yōu)選雙鏈區(qū)的長度為15-30，更優(yōu)選為18，19，20，21，22，和23個(gè)核苷酸長，例如，如上討論的siRNA試劑范圍。在其中的一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA試劑的兩條鏈被連接，例如還包括共價(jià)連接。發(fā)夾或其它提供所需雙鏈區(qū)的單鏈結(jié)構(gòu)、以及優(yōu)選的3’突出也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
候選iRNA試劑的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)候選iRNA試劑下調(diào)靶基因表達(dá)的能力。例如，提供候選iRNA試劑，然后將其與細(xì)胞接觸，例如人細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)被目標(biāo)病毒感染或?qū)⒈桓腥?，所述病毒例如為含靶基因的病毒。可選擇的，細(xì)胞被表達(dá)靶病毒基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，這樣不再需要病毒感染性模型。將與候選iRNA試劑接觸前后的靶基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，例如對mRNA、蛋白水平或病毒效價(jià)進(jìn)行比較。如果與iRNA試劑接觸后所測量的RNA、蛋白或靶基因的病毒表達(dá)降低，則可以總結(jié)出iRNA試劑下調(diào)靶基因表達(dá)。細(xì)胞中靶病毒RNA或病毒蛋白水平或細(xì)胞中的病毒效價(jià)可以通過任何想到的方法測量。例如可以通過RNA印跡分析、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、bDNA分析、或RNA酶保護(hù)分析來測量靶RNA的水平。蛋白的水平可以通過例如蛋白印跡分析或免疫熒光來測量。病毒效價(jià)可以通過空斑形成分析來測量。
IRNA試劑的穩(wěn)定性測試、改進(jìn)，和再測試評(píng)價(jià)候選iRNA試劑的穩(wěn)定性，如其對核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶切割的靈敏度，例如當(dāng)將iRNA試劑引入受試者體內(nèi)時(shí)。可以采用鑒別對修飾的敏感位點(diǎn)、尤其是對切割、如受試者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組分的切割敏感位點(diǎn)的方法。當(dāng)鑒別到對切割敏感的位點(diǎn)時(shí)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)和/或合成iRNA試劑，其中潛在切割位點(diǎn)被制備成抗切割，例如在切割位點(diǎn)引入2’修飾，例如2’-O-甲基。對iRNA試劑進(jìn)一步測試其穩(wěn)定性，而且該過程可以反復(fù)進(jìn)行直到iRNA試劑表現(xiàn)出所需的穩(wěn)定性。
體內(nèi)測試被鑒定能夠抑制RSV基因表達(dá)的iRNA試劑可以在動(dòng)物模型(例如，哺乳動(dòng)物，如小鼠或大鼠)體內(nèi)進(jìn)行功能測試，如實(shí)施例所示。例如，將iRNA試劑施用于動(dòng)物，然后測量iRNA試劑的有關(guān)生物分布、穩(wěn)定性、和其抑制病毒，如RSV或PIV的能力，基因表達(dá)或降低病毒效價(jià)方面的能力。
可將iRNA試劑直接施用于目標(biāo)組織，例如通過注射，或者，可將iRNA試劑通過與將其施用于人相同的方式施用于動(dòng)物模型。如本文所示，所述試劑優(yōu)選通過吸入給藥來作為治療病毒感染的手段。
也可以評(píng)價(jià)iRNA試劑的細(xì)胞內(nèi)分布。該評(píng)價(jià)包括測量iRNA試劑是否被吸收進(jìn)入細(xì)胞。該評(píng)價(jià)也可以包括測量iRNA試劑的穩(wěn)定性(如半衰期)。iRNA試劑的體內(nèi)評(píng)價(jià)可以通過使用連接了可追蹤標(biāo)記物(例如熒光標(biāo)記物，如熒光素；放射性標(biāo)記，如35S、32P、33P、或3H；金顆粒；或用于免疫組織化學(xué)的抗原顆粒)的iRNA試劑來促進(jìn)。
用于檢測生物分布的iRNA試劑在體內(nèi)可以缺少基因沉默活性。例如，iRNA試劑可以靶向動(dòng)物中不存在的基因(例如，注射到小鼠中的iRNA試劑靶向熒光素酶)，或iRNA試劑具有非有義鏈序列，其不靶向任何基因(例如任何的內(nèi)源基因)。iRNA的位置和生物分布可以檢測，例如通過粘附到iRNA試劑上的可追蹤標(biāo)記，如上面所述的可追蹤試劑。
可以評(píng)價(jià)iRNA試劑下調(diào)病毒基因表達(dá)的能力?？梢詼y量病毒基因在體內(nèi)的表達(dá)水平，例如，通過原位雜交，或通過從與iRNA試劑接觸前與接觸后的組織中分離出RNA。為了獲得組織，需要宰殺動(dòng)物，未處理的對照動(dòng)物用于比較?？梢酝ㄟ^所需方法測量靶病毒mRNA，包括但不限于RT-PCR，RNA印跡、支鏈DNA分析、或RNA酶保護(hù)分析。可選擇的，或其它的，可以通過對iRNA試劑處理的組織提取物實(shí)施蛋白印跡分析來檢測病毒基因表達(dá)。可以通過使用空斑形成單位測定病毒效價(jià)。
iRNA化學(xué)本文所述的是單獨(dú)的iRNA試劑，例如介導(dǎo)RNAi抑制病毒基因表達(dá)如RSV或PIV的P蛋白的RNA分子(雙鏈；單鏈)。
本文論述的RNA試劑包括未修飾的RNA，同時(shí)包括為提高功效而被修飾的RNA，和核苷替代物的聚合物。未修飾的RNA是指分子中的核酸的組分，也就是糖、堿基和磷酸部分與天然存在的分子、優(yōu)選人體中天然存在的分子相同和基本相同的分子?，F(xiàn)有技術(shù)中把稀有的或獨(dú)特的但天然存在的RNA稱為修飾的RNA，參見如Limbach et al.，(1994)Nucleic Acids Res.222183-2196。這些稀有的或獨(dú)特的RNA，經(jīng)常稱為修飾的RNA(modified RNA)(很明顯，因?yàn)檫@些分子是轉(zhuǎn)錄后修飾的結(jié)果)，是屬于所述的未修飾RNA的范圍。如本文所用，本文所用的修飾的RNA是指分子中的核酸的一個(gè)或多個(gè)組分，也就是糖、堿基、和磷酸部分是不同于天然存在的，優(yōu)選與人體中存在的不同。當(dāng)它們被稱作修飾的“RNA”時(shí)，因?yàn)樾揎?，所以它們?dāng)然包括不是RNA的分子。核苷替代物是其中的核糖磷酸骨架被非核糖磷酸構(gòu)建體替換的分子，該非核糖磷酸構(gòu)建體允許堿基以正確的空間關(guān)系呈現(xiàn)，從而使雜交基本相似于與核糖磷酸骨架雜交中所見的雜交，如核糖磷酸骨架的非荷電模擬物。本文論述了上述的每個(gè)實(shí)例。
本文所述的修飾可以實(shí)施到任何的雙鏈RNA和本文的RNA樣分子，如iRNA試劑。修飾iRNA試劑的反義鏈和有義鏈中的一個(gè)或兩個(gè)可能是需要的。當(dāng)核酸是亞單位或單體的聚合物時(shí)，下述的許多修飾可以在核酸內(nèi)的重復(fù)位置進(jìn)行，例如堿基修飾，或磷酸部分修飾，或磷酸部分的未連接的O修飾。在許多情況中，修飾可以在核酸分子所有的目標(biāo)位置發(fā)生，但在許多，和實(shí)際的大多數(shù)情況下并不能發(fā)生。通過實(shí)施例，修飾可僅發(fā)生在3’和5’末端位置，可僅發(fā)生在末端區(qū)域，例如在末端核苷酸和在鏈的最后2，3，4，5或10個(gè)核苷酸。修飾可以在雙鏈區(qū)，單鏈區(qū)或兩者同時(shí)發(fā)生。例如，在未連接的O位的硫代磷酸酯修飾可僅發(fā)生在一個(gè)或兩個(gè)末端，可僅發(fā)生在末端區(qū)，例如在末端核苷酸位置或在鏈的最后2，3，4，5或10個(gè)核苷酸，或發(fā)生在雙鏈和單鏈區(qū)，尤其是在多個(gè)末端。同樣地，修飾可以發(fā)生在有義鏈、反義鏈，或兩者。在一些情況下，有義鏈和反義鏈將具有相同修飾或相同類別的修飾，但在另外的情況下，有義鏈和反義鏈將具有不同的修飾，例如，在一些情況下其可能僅需要修飾一條鏈，例如有義鏈。
將修飾引入iRNA試劑的兩個(gè)主要目的是生物環(huán)境中對降解的穩(wěn)定性和藥理學(xué)性質(zhì)的改進(jìn)，例如藥效學(xué)性質(zhì)，其在下面進(jìn)一步討論。對于iRNA試劑中的糖、堿基或骨架的其它的適當(dāng)修飾描述在同時(shí)享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/01193中，申請日是2004年4月16日。iRNA試劑可以包括非天然存在的堿基，例如描述于共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/011822中，申請日是2004年4月16日。iRNA試劑可以包括非天然存在的糖，例如非糖類環(huán)載體分子(non-carbohydrate cyclic carrier molecule)。iRNA試劑中使用的非天然存在糖的示例特征描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/11829中，申請日是2003年4月16日。
iRNA試劑可以包括用于增強(qiáng)核酸酶抗性的核苷酸間鍵(例如手性硫代磷酸酯鍵)。另外，或可選擇地，iRNA可以包括核糖模擬物以增加核酸酶抗性。用于增加核酸酶抗性的示例核苷酸間鍵和核糖模擬物描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/07070中，申請日為2004年3月8日。
iRNA試劑可以包括結(jié)合配體的亞單位和單體，以用于寡核苷酸的合成。示例性單體描述在共同享有的美國申請?zhí)?0/916,185中，申請日是2004年8月10日。
iRNA可以具有ZXY結(jié)構(gòu)，例如描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/07070中，申請日為2004年3月8日。
iRNA試劑可以與兩性部分復(fù)合，用于iRNA試劑的示例性兩性部分描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/07070中，申請日為2004年3月8日。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA試劑可以復(fù)合到以模塊復(fù)合物(modularcomplex)為特征的遞送試劑上。復(fù)合物包括連接到一個(gè)或多個(gè)如下(優(yōu)選是兩個(gè)或多個(gè)，更優(yōu)選是所有的三個(gè))的載體試劑(a)冷凝劑(例如能夠吸引，如結(jié)合核酸的試劑，如通過離子或靜電作用)；(b)融合劑(如能夠融合和/或通過細(xì)胞膜被轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑)；和(c)靶基團(tuán)，如細(xì)胞或組織的靶向試劑，例如凝集素、糖蛋白，脂質(zhì)或蛋白，例如結(jié)合到特定的細(xì)胞類型的抗體。復(fù)合到遞送試劑的iRNA試劑描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/07070中，申請日為2004年3月8日。
iRNA試劑具有如在iRNA雙鏈體中的有義鏈和反義鏈序列之間的非規(guī)則配對，非規(guī)則配對的iRNA試劑的示例特征描述在共同享有的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/07070中，申請日為2004年3月8日。
增強(qiáng)的核酸酶抗性iRNA試劑，例如靶向RSV的iRNA試劑對核酸酶具有增強(qiáng)的抗性。一種增強(qiáng)抗性的方式是鑒定切割位點(diǎn)并修飾該位點(diǎn)以阻止切割。例如，二核苷酸5’-UA-3’，5′-UG-3′，5′-CA-3’，5′-UU-3’，或5′-CC-3’能眵作為切割位點(diǎn)。
為增強(qiáng)核酸酶抗性和/或?qū)δ繕?biāo)的結(jié)合親和力，iRNA試劑，例如iRNA試劑的有義鏈和/或反義鏈可以包括，例如，2’修飾的核糖單位和/或代磷酸酯鍵。例如，2’羥基(OH)可以被修飾或用許多不同的“氧”或“脫氧”替代物替換。
“氧”-2’羥基修飾的示例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如，R＝H，烷基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；2’羥基通過亞甲基橋連接到相同核糖的4’碳上的“封閉”核酸(LNA)；O-AMINE(AMINE＝NH2；烷基胺，二烷基胺，雜環(huán)，芳基胺，二芳基胺，雜芳基胺，或二雜芳基胺，乙二胺，多胺)和氨基烷氧基，O(CH2)nAMINE(例如AMINE＝NH2；烷基胺，二烷基胺，雜環(huán)，芳基胺，二芳基胺，雜芳基胺，或二雜芳基胺，乙二胺，多胺)。值得注意的是僅包含甲氧乙基(MOE)的寡核苷酸，(OCH2CH2OCH3，PEG衍生物)，比用強(qiáng)的硫代磷酸酯修飾的那些表現(xiàn)出核酸酶穩(wěn)定性。
“脫氧”修飾包括氫(也就是脫氧核糖，其與部分雙鏈RNA的突出部分特別關(guān)聯(lián))；鹵素(如氟)；氨基(如NH2；烷基胺，二烷基胺，雜環(huán)，芳基胺，二芳基胺，雜芳基胺，二雜芳基胺或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基胺，二烷基胺，雜環(huán)，芳基胺，二芳基胺，雜芳基胺或二雜芳基胺)，-NHC(O)R(R＝烷基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜芳基或糖)，氰基；巰基；烷基硫代烷基；硫代烷氧基；和烷基，環(huán)烷基，芳基，烯基和炔基，它們可以任選被如氨基官能團(tuán)取代，優(yōu)選取代基是2’-甲氧基乙基，T-OCH3，2’-C-烯丙基，2’-烯丙基，和2’-氟。
為了最大化核酸酶抗性，2’修飾可以同一個(gè)或多個(gè)磷酸連接修飾(例如硫代磷酸酯)結(jié)合使用。所謂的“嵌合”(chimeric)寡核苷酸是包含兩個(gè)或多個(gè)不同修飾的那些。
在某些實(shí)施方案中，iRNA試劑的所有嘧啶都具有2’-修飾，并且其中iRNA試劑已經(jīng)增強(qiáng)了對核酸內(nèi)切酶的抗性。增強(qiáng)的核酸酶抗性也可以通過修飾5’核苷酸獲得，可得到結(jié)果的，例如，在至少一個(gè)5′-尿苷-腺嘌呤-3′(5′-UA-3’)二核苷酸中，其中尿苷是2’修飾的核苷酸；至少一個(gè)5′-尿苷-鳥嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸，其中5′-尿苷是2’修飾的核苷酸；至少一個(gè)5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸，其中5′-胞苷是2’修飾的核苷酸；至少一個(gè)5′-尿苷-尿苷-3′(5′-UU-3′)二核苷酸，其中5′-尿苷是2’修飾核苷酸；或至少一個(gè)5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸，其中5′-胞苷是2’修飾核苷。iRNA試劑可以包括至少2個(gè)，至少3個(gè)，至少4個(gè)或至少5個(gè)這樣的二核苷酸。
寡核苷酸骨架中內(nèi)含呋喃糖也可以降低核酸內(nèi)切酶切割。iRNA試劑可以進(jìn)一步通過包含3’陽離子基團(tuán)而修飾，或通過在3’末端用3’-3’-鍵轉(zhuǎn)化核苷。在其它的可選擇中，3’末端可以用氨基烷基封閉，例如3’C5氨基烷基dT。其它的3’結(jié)合可以抑制3′-5′核酸外切酶切割。當(dāng)不局限于理論的時(shí)候，3’結(jié)合物，如萘普生或布洛芬，可以通過空間封閉核酸外切酶與寡核苷酸3’末端的結(jié)合來抑制核酸外切酶切割。甚至小的烷基鏈、芳基、或雜環(huán)結(jié)合物或被修飾的糖(D-核糖，脫氧核糖，葡糖等)可以封閉′-5′-核酸外切酶。
同樣，5’結(jié)合物可以抑制5′-3′核酸外切酶切割。當(dāng)不局限于理論的時(shí)候，5’結(jié)合物，如萘普生或布洛芬，可以通過空間封閉核酸外切酶與寡核苷酸5’末端的結(jié)合來抑制核酸外切酶切割。甚至小的烷基鏈、芳基、或雜環(huán)結(jié)合或被修飾的糖(D-核糖，脫氧核糖，葡萄糖等)可以封閉′-5′-核酸外切酶。
當(dāng)雙鏈iRNA試劑在至少一個(gè)末端包含單鏈核苷酸突出的時(shí)候，iRNA試劑能夠增強(qiáng)對核酸酶的抗性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷酸突出包括1-4個(gè)，優(yōu)選2-3個(gè)未配對核苷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，直接與末端核苷對臨近的單鏈突出的未配對核苷酸包含嘌呤堿基，和末端核苷酸對是G-C對或最后4個(gè)互補(bǔ)核苷酸對中的至少兩個(gè)是G-C對。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核苷酸突出可以具有1或2個(gè)未配對核苷酸，以及在示例實(shí)施方案中該核苷酸突出是5′-GC-3’。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷突出是在反義鏈的3’末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA試劑在反義鏈的3’末端包含基序5′-CGC-3′，這樣形成了2nt的突出5′-GC-3’。
這樣，iRNA試劑可以包含已被修飾的單體以抑制如核酸酶的降解，核酸酶如受試者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶。這些單體在本文是指NRM或核酸酶抗性促進(jìn)單體或修飾體。在許多情況下，這些修飾體還將調(diào)節(jié)iRNA試劑的其它性質(zhì)，例如與蛋白相互作用的能力，蛋白如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如血清白蛋白，或RISC的一個(gè)成員，或第一和第二序列與其它序列形成雙鏈體或與其它序列如目標(biāo)分子形成雙鏈體的能力。
優(yōu)選的可用于產(chǎn)生適合上述定義的核酸抗性標(biāo)準(zhǔn)的iRNA試劑的修飾包括糖、堿基、和/或磷酸骨架的一個(gè)或多個(gè)下述化學(xué)和/或立體化學(xué)修飾(i)手性(Sp)硫代酯(thioates)。至此，優(yōu)選的NRM包含核苷酸二聚體，該二聚體具有富含或完全是特定手性形式的修飾的磷酸基團(tuán)，該磷酸基團(tuán)在非橋接處如Sp或Rp，在一般被氧占位的X位置含有雜原子。在X處的原子也可以是S，Se，Nr2或Br3。當(dāng)X是S的時(shí)候，富含或完全是手性Sp連接是優(yōu)選的。富含是指是優(yōu)選形式的至少70，80，90，95或99％。該NRM在下面更詳細(xì)地討論。
(ii)一個(gè)或多個(gè)陽離子基團(tuán)在糖、堿基和/或磷酸的磷原子或修飾的磷酸骨架部分上的附著。至此，優(yōu)選的NRM在末端位置包含單體，所述末端位置為陽離子基團(tuán)衍生而來。由于反義鏈序列的5’末端應(yīng)該具有末端-OH或磷酸基團(tuán)，該NRM優(yōu)選不用于反義序列的5’末端。該基團(tuán)應(yīng)該附著在堿基的某一位置，所述位置干擾H鍵和雜交的程度最小，例如遠(yuǎn)離與其它鏈上的互補(bǔ)堿基形成的面，如嘧啶的5’位或嘌呤的7位。這些在下面更詳細(xì)的討論。
(iii)末端的非磷酸酯鍵合。至此，優(yōu)選的NRM包含非磷酸酯鍵合，如4個(gè)原子的鍵合，其產(chǎn)生了比磷酸酯鍵更強(qiáng)的剪切抗性。實(shí)例包括3’CH2-NCH3-O-CH2-5′和3′CH2-NH-(O＝)-CH2-5’。
(iv)3’-橋接硫代磷酸酯和5’橋接硫代磷酸酯。至此，優(yōu)選的NRM可以包含這些結(jié)構(gòu)。
(v)L-RNA，2′-5′鍵合，反向鍵合，a-核苷。至此，其它優(yōu)選的NRM包括L核苷和由L核苷衍生的二聚體核苷酸；2′-5 ’磷酸酯，非磷酸酯和修飾的磷酸酯鍵合(例如硫代磷酸酯，氨基磷酸酯和磷酸硼)；具有反向鍵合的二聚物，例如3′-3′或5′-5′鍵合；在糖的1位具有α鍵合的單體，如本文描述的具有α鍵合的結(jié)構(gòu)。
(vi)結(jié)合基團(tuán)。至此，優(yōu)選的NRM包含，例如本文描述的與單體結(jié)合的靶向部分或結(jié)合配體，例如通過糖、堿基或骨架。
(vii)無堿基鍵合。至此，優(yōu)選的NRM可以包含無堿基單體，例如本文描述的無堿基單體(如無核酸堿基單體)；如本文描述的芳香族或雜環(huán)或聚雜環(huán)芳香族單體(polyheterocyclic aromatic monomer)；和(viii)5’-磷酸酯和5’-磷酸酯前藥。至此，優(yōu)選的NRM包含單體，優(yōu)選在末端位置，例如在5’位，其中一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基團(tuán)的原子被保護(hù)基團(tuán)衍生，該保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))由于組分在受試者體內(nèi)(例如羧基酯酶或受試者體內(nèi)的酶)的作用而被除去。例如，磷酸酯前藥，其中的羧基酯酶切割受保護(hù)的分子導(dǎo)致硫代酯(thioate)陰離子的產(chǎn)生，該硫代酯陰離子進(jìn)攻臨近磷酸酯的O的碳原子并導(dǎo)致無保護(hù)的磷酸酯的產(chǎn)生。
一個(gè)或多個(gè)不同的NRM修飾可以引入到iRNA試劑中或引入到iRNA試劑的序列中。NRM修飾可以在序列中或在iRNA試劑中使用一次以上。由于NRM干擾雜交，所引入的總量應(yīng)該使iRNA試劑的雙鏈體形成維持在可接受的水平。
在一些實(shí)施方案中，將NRM修飾引入到末端切割位點(diǎn)或序列的切割區(qū)域(有義鏈或序列)，所述序列不靶向受試者體內(nèi)的目的序列或基因。這樣能夠減少脫靶沉默。
核酸酶抗性修飾包括一些僅在末端被替換的修飾和其它的在任何位點(diǎn)的修飾。一般地，能夠抑制雜交的修飾僅用于末端區(qū)域，并且優(yōu)選不在切割位點(diǎn)或靶向受試者序列或基因的序列的切割區(qū)域。如果iRNA試劑的兩個(gè)序列之間的充分雜交能眵維持，那么它們可以用于有義序列的任何位置。在一些實(shí)施方案中，需要將NRM置于切割位點(diǎn)或不靶向受試者序列或基因的序列的切割區(qū)域，因?yàn)檫@樣能夠最小化脫靶沉默。
在大部分情況下，促進(jìn)核酸酶抗性的修飾的分布取決于該序列是否將靶向受試者的序列(經(jīng)常是指作為反義序列)或?qū)⒉话邢蚴茉囌咝蛄?經(jīng)常是指有義序列)。如果序列將靶向受試者序列，干擾或抑制核酸內(nèi)切酶切割的修飾將不能插入到RISC介導(dǎo)切割的區(qū)域，例如切割位點(diǎn)或切割區(qū)域(如Elbashir et ah，2001，Genes and Dev.15188中所述，在此作為參考并入本文)。靶的切割發(fā)生在向?qū)NA中間約20-21nt，或互補(bǔ)于向?qū)蛄械牡谝粋€(gè)核苷酸上游的約10-11核苷酸。如本文所用，切割位點(diǎn)是指在切割位點(diǎn)的任一側(cè)的核苷酸，該切割位點(diǎn)是在靶上或在與其雜交的iRNA試劑鏈上。切割區(qū)域含義是切割位點(diǎn)的任意方向的具有1，2或3個(gè)核苷酸的核苷酸。
這樣的修飾可以引入到靶向受試者中的序列或不靶向受試者中的序列的末端區(qū)域，例如在末端的位點(diǎn)或在具有2，3，4或5個(gè)位點(diǎn)的末端位置。
束縛配體(Tethered ligand)iRNA試劑的性質(zhì)，包括其藥理學(xué)性質(zhì)，可以被改變或調(diào)控，例如通過引入配體，如束縛配體。
很多種實(shí)體，如配體，可以被束縛到iRNA試劑，如束縛到結(jié)合配體的單體亞單位的載體上。實(shí)例描述在下面的結(jié)合配體的單體亞單位的內(nèi)容部分，但其僅僅是優(yōu)選的，實(shí)體可以在其它位點(diǎn)被耦合到iRNA試劑。
優(yōu)選的部分是配體，其通過插入束縛而直接或間接地被耦合到載體，優(yōu)選是共價(jià)耦合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體通過插入束縛而被附著到載體上。當(dāng)結(jié)合配體的單體被引入至正在增長的鏈中時(shí)，配體或束縛配體可以存在于結(jié)合配體的單體上。在一些實(shí)施方案中，在結(jié)合配體的“前體”單體亞單位(“precursor”ligand-conjugated monomer subunit)已經(jīng)被并入正在增長的鏈中后，可以將配體并入該“前體”結(jié)合配體的單體亞單位中。例如，具有例如端氨基束縛的單體，如TAP-(CH2)nNH2的單體可以被并入至正在增長的有義或反義鏈中。在接下來的操作中，也就是前體單體亞單位并入鏈中之后，具有親電基團(tuán)的配體，如具有五氟苯基酯基團(tuán)或醛基的配體可以通過將配體的親電基團(tuán)與前體結(jié)合配體的單體亞單位束縛的末端親核基團(tuán)的耦合后束縛到前體結(jié)合配體的單體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體改變了其所并入的iRNA試劑的分布、靶向或生命期。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相比較于缺少配體的種類，配體提供了增強(qiáng)的對所選擇靶的親和性，該選擇靶如為分子、細(xì)胞或細(xì)胞類型、代謝區(qū)域，如細(xì)胞或器官的代謝區(qū)域、組織、器官或身體的一部分。
優(yōu)選的配體能夠改進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)、雜交、和特異性質(zhì)并且也可以改進(jìn)合成的天然或修飾的寡核苷酸的核酸酶抗性，或改進(jìn)包含本文所述的單體的任何結(jié)合的聚合分子的核酸酶抗性，和/或改進(jìn)天然的或修飾的核糖核苷酸的核酸酶抗性。
配體一般包含治療性修飾物，如，用于增強(qiáng)吸收；診斷化合物或報(bào)道基團(tuán)，如用于檢測分布；交聯(lián)劑；賦予核酸酶抗性的部分；和天然或特異的核糖堿基。一般的例子包括親脂體、脂質(zhì)體、類固醇(如烏發(fā)醇、hecigenin、diosgenin)、萜(如三萜，如薩灑皂苷配基，無羈萜，表木栓醇衍生的石膽酸)、維生素(如葉酸，維生素A，生物素，吡哆醛)、糖類、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合劑、整聯(lián)蛋白靶分子(integrin targeting molecule)、聚陽離子固色劑(polycationics)、肽、多胺、和肽模擬物。
配體可以包括天然存在的物質(zhì)，(如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)，或球蛋白)；糖類(如，葡聚糖，支鏈淀粉，殼多糖，菊糖，環(huán)糊精或透明質(zhì)酸)；氨基酸，或脂。配體也可以是重組或合成的分子，如合成的聚合物，如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的例子包括聚氨基酸是聚賴氨酸(PLL)，聚L-天冬氨酸，聚L-谷氨酸，苯乙烯-馬來酸酐共聚物，聚(L-乳酸羥基乙酸)共聚物，乙烯醚-馬來酸酐共聚物，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨基甲酸乙酯，聚(2-乙基丙烯酸)，N-異丙基丙烯酰胺聚合物，或聚膦嗪。多胺的例子包含聚氮丙啶，聚賴氨酸(PLL)，肌胺，精脒，多胺，偽肽-多胺，擬肽類多胺，枝形大分子多胺，精氨酸，脒，魚精蛋白，陽離子部分，如陽離子脂質(zhì)，陽離子卟啉，多胺的季鹽，或α螺旋肽。
配體可以包含靶向基團(tuán)，如，細(xì)胞或組織靶向試劑，如，凝血素，糖蛋白，脂質(zhì)或蛋白，如，抗體，其結(jié)合到特異性的細(xì)胞類型，如肝細(xì)胞或空腸細(xì)胞。靶向基團(tuán)可以是促甲狀腺激素，促黑素，凝血素，糖蛋白，表面活化蛋白A，粘蛋白糖類，多價(jià)乳糖，多價(jià)半乳糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-gulucosamine多價(jià)甘露糖，多價(jià)鹽皮質(zhì)，糖基化的聚氨基酸，多價(jià)的半乳糖，轉(zhuǎn)鐵蛋白，二膦酸酯，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，脂質(zhì)，膽固醇，類固醇，膽汁酸，葉酸鹽，維生素B12，生物素，或RGD肽或RGD肽模擬物。
配體可以是蛋白質(zhì)，如糖蛋白，或肽，如對協(xié)同配體具有特異性親和力的分子，或抗體，如結(jié)合到特定細(xì)胞類型如癌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或骨細(xì)胞的抗體。配體還可以包含激素和激素受體。它們還可以包含非肽類，如脂類，凝集素，糖類，維生素，輔因子，多價(jià)乳糖，多價(jià)半乳糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-gulucosamine多價(jià)甘露糖，多價(jià)鹽皮質(zhì)。配體可以是，例如脂多糖，p38 MAP激酶的激活劑，或NF-κB的激活劑。
配體可以是物質(zhì)，如，藥物，其能眵增加iRNA試劑吸收至細(xì)胞，例如，通過破壞細(xì)胞的細(xì)胞胃架，如通過破壞細(xì)胞的微管，微絲，和/或中間絲。藥物可以是，例如，taxon，長春新堿，長春堿，松胞菌素，諾考達(dá)唑，japlakinolide，微絲解聚劑A，鬼筆環(huán)肽，swinholide A，吲達(dá)尼定，或myoservin。
一方面，配體是脂質(zhì)或脂基分子。如脂質(zhì)或脂基分子優(yōu)選結(jié)合到血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)。結(jié)合配體的HSA允許結(jié)合物向靶組織的分布，例如肝組織，包括肝組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。能眵結(jié)合HSA的其它分子也可以用于配體，例如，可以使用neproxin或阿司匹林。脂質(zhì)或脂基配體可以(a)增加對結(jié)合物的降解抗性，(b)增加靶向或輸送至靶細(xì)胞或細(xì)胞膜，和/或(c)可以用于調(diào)節(jié)與血清蛋白如人血清白蛋白的結(jié)合。
脂基配體可以用于調(diào)節(jié)，例如調(diào)控結(jié)合物與靶組織的結(jié)合。例如，越強(qiáng)烈地結(jié)合到HSA的脂質(zhì)或脂基配體就越不可能被定位于腎，因此更不可能從身體中清除。較弱結(jié)合到HSA的脂質(zhì)或脂基配體可以用于將結(jié)合物靶向腎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂基配體結(jié)合HSA。優(yōu)選地，其以充分的親和力結(jié)合HSA，以致于結(jié)合物將優(yōu)選分布到非腎組織。然而，優(yōu)選親和力不是如此的強(qiáng)，以至于HSA-配體結(jié)合不能逆轉(zhuǎn)。
另一方面，配體是一個(gè)部分，例如維生素，其被目標(biāo)細(xì)胞如增殖細(xì)胞吸收。這些特別有益于不需要的細(xì)胞增殖為特征的病癥，細(xì)胞增殖如惡性或非惡性類的，如癌細(xì)胞。示例的維生素包含維生素A，E，和K。其它示例維生素包含B族維生素，如葉酸，B12，核黃素，生物素，吡哆醛或其它的被癌細(xì)胞吸收的維生素或營養(yǎng)素。還包括的是HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
在另一方面，配體是細(xì)胞滲透劑，優(yōu)選為螺旋細(xì)胞滲透劑。優(yōu)選地，試劑是兩性分子。示例的試劑是tat或antennopedia。如果試劑是肽，其可以被修飾，包括肽基模擬物，反轉(zhuǎn)異構(gòu)體(invertomer)，非肽或偽肽鍵合，和D-氨基酸的使用。螺旋劑優(yōu)選為α-螺旋劑，其優(yōu)選具有親脂相和疏脂相。
5′-磷酸酯修飾在優(yōu)選的實(shí)施方案中，iRNA試劑是5’-磷酸化的或在最初的5’末端(5’-primeterminus)處含有磷?；念愃莆?。反義鏈的5′-磷酸酯修飾包含適于RISC介導(dǎo)基因沉默的那些。適當(dāng)?shù)男揎棸?’單磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′) ；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5’-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化的)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5’-腺苷帽(Appp)，和任何的修飾的或未修飾的核苷酸帽結(jié)構(gòu)(N-O-5′-(OH)(O)P-O-(OH)(O)P-(HO)(O)-O-5′)；5’-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5’-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)，5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5′)；任何其它的氧/硫替代的單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯(5’-α-硫代磷酸酯，5’-γ-硫代三磷酸酯等)的結(jié)合，5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’，(HO)(NH2)(O)P-O-5′)，5’-烷基磷酸酯(R＝烷基＝甲基，乙基，異丙基，丙基，等，如RP(OH)(O)-O-5′-，(OH)2(O)P-5′-CH2-)，5’-烷基醚磷酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)，乙氧基甲基，等，如RP(OH)(O)-O-5′-)。
為了阻止有義鏈的活性和防止活性RISC的形成，可以對有義鏈進(jìn)行修飾，這樣潛在地降低了脫靶效應(yīng)。這可以通過防止有義鏈的5’-磷酸化的修飾來實(shí)現(xiàn)，例如用5’-O-甲基核糖核苷酸修飾(參見Nykanen et ah，(200 1)ATP requirementsand small interfering RNA structure in the RNA interference path way.Cell 107，309-321)。其它的防止磷酸化的修飾也可以采用，例如僅用H取代5’-OH而非O-Me?？蛇x擇的，大量的基團(tuán)可以加到5’-磷酸酯，將其轉(zhuǎn)換為磷酸二酯鍵。
iRNA試劑向組織和細(xì)胞的傳送劑型制備本文描述的iRNA試劑以施用于受試者，優(yōu)選通過吸入或鼻內(nèi)例如通過注射局部地施于肺或鼻道(呼吸組織)。為簡易表述，該部分討論的劑型、組合物，和方法很多是關(guān)于未修飾的iRNA試劑。需要了解的是，無論如何，這些劑型、組合物、和方法可以使用于其它的iRNA試劑，例如使用修飾的iRNA試劑，并且該使用是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
制備的組合物可以呈現(xiàn)各種狀態(tài)。在一些實(shí)施例中，組合物至少部分是結(jié)晶，均勻的結(jié)晶和/或無水的(例如少于80，50，30，20或10％的水)。在其它的例子中，iRNA在水相中，例如在含水的溶液中，該劑型是通過吸入給藥的優(yōu)選劑型。
水相或結(jié)晶組合物可以摻入傳送媒介，例如脂質(zhì)體(特別是對于水相)，或顆粒(例如，例如適于晶體組合物的微顆粒)。一般地，iRNA組合物以適于所需給藥方法的劑型配制。
制備iRNA制劑可以結(jié)合其它的試劑，如其它的治療試劑或使iRNA穩(wěn)定的試劑，如與iRNA復(fù)合以形成iRNP的蛋白。還有其它的試劑包括螯合劑，如EDTA(如，用于除去二價(jià)陽離子，如Mg2+)，鹽，RNA酶抑制劑(如特異性廣泛的RNA酶抑制劑，如RNAsin)等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA制劑包括其它的iRNA試劑，如能眵介導(dǎo)第二基因的RNAi的第二iRNA試劑。還有其它的制劑可以包括至少3，5，10，20，50或100或更多的不同iRNA種類。在一些實(shí)施方案中，試劑被定向于相同病毒，但不同的靶序列。在其它的實(shí)施方案中，每個(gè)iRNA試劑定向于不同的病毒。如實(shí)施例所證明，多于一個(gè)病毒可以被聯(lián)合施用的兩種iRNA試劑在很短的間隔時(shí)間同時(shí)抑制，每個(gè)定向于被治療的病毒中的一個(gè)。
治療方法和傳送方式包含本發(fā)明的iRNA試劑的組合物，例如靶向RSV或PIV的iRNA試劑，可以通過許多路徑傳送到受試者。示例性的路徑包括吸入，鞘內(nèi)，薄壁組織，靜脈，鼻內(nèi)，口服，和眼部傳送。優(yōu)選的施用本發(fā)明iRNA試劑的方式是通過直接施用到肺和鼻道或通過胃腸外施用的系統(tǒng)性給藥。
iRNA試劑可以摻入到適于施用的藥物組合物中。例如組合物包含一種或多種iRNA試劑和藥物可接受的載體。如本文所用，術(shù)語“藥物可接受的載體”意為包含適合于藥物施用的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌和抗真菌劑，等滲和吸收延期劑等。用于藥學(xué)上活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的用途在本領(lǐng)域是已知的。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑的范圍外，它們在組合物中的用途是考慮到的。增加的活性物質(zhì)也可納入到組合物中。
根據(jù)是否需要局部或系統(tǒng)治療和被治療的區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以以許多方式給藥?？梢允蔷植?包括眼睛，鼻內(nèi)，經(jīng)皮，肺內(nèi))，口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包含靜脈滴注，皮下，腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射，或鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。
一般情況下，本發(fā)明的iRNA試劑的傳送是為實(shí)現(xiàn)向受試者的感染部位的遞送。實(shí)現(xiàn)該目的的優(yōu)選方式是通過局部施用到肺或鼻道，例如通過吸入或鼻內(nèi)施用到呼吸組織，或者通過系統(tǒng)性施用，例如胃腸外施用。吸入或胃腸外施用的劑型在本領(lǐng)域是公知的。該劑型可以包括無菌水溶液，其也可以含有緩沖液，稀釋劑和其它合適的添加劑。對于靜脈使用，應(yīng)該控制溶液的總濃度以保證制劑的等滲。
本文公開的活性化合物優(yōu)選以適當(dāng)?shù)姆绞绞┯玫绞茉囌叩姆?或兩個(gè))或鼻道?；钚曰衔锟梢酝ㄟ^可呼吸顆粒的氣霧劑施用，其中的顆粒包含受試者吸入的一種活性化合物或多種活性化合物?；钚曰衔锟梢砸远喾N形式霧化，例如，但不限于，干粉吸入劑，計(jì)量劑量吸入劑，或液體/液體懸浮液?？珊粑念w粒可以是液體或固體。顆粒可以任選地包含其它的治療組分，如阿米洛利，苯扎明或苯丙胺，并包含的有效量的所選化合物，以抑制從氣管粘液分泌物中再吸收水，如美國專利號(hào)4,501,729中所述。
微粒子藥物組合物可以任選地與載體組合用于輔助分散或傳輸。可以將適當(dāng)?shù)妮d體如糖(也就是乳糖，蔗糖，海藻糖，D甘露醇)與一種活性化合物或多種活性化合物以任意合適的比例(如重量比1∶1)混合。
實(shí)施本發(fā)明的含有活性化合物的顆粒應(yīng)該包含可呼吸尺寸的顆粒，也就是，顆粒的尺寸要足夠小以通過嘴或鼻子和喉，接著吸入和進(jìn)入肺的支氣管和肺泡。一般地，范圍在1-10微米大的顆粒(更優(yōu)選地，尺寸小于約5微米)適于呼吸。包含在氣霧劑中的非呼吸尺寸的顆粒傾向于沉積喉部和被吞咽，并且氣霧劑中非呼吸顆粒的量優(yōu)選最小化。對于鼻部施用，優(yōu)選10-500μM的顆粒尺寸確保滯留于鼻腔中。
制備氣霧劑的活性化合物的液體藥物組合物可以通過組合活性化合物和適當(dāng)?shù)拿浇閬碇苽?，媒介如滅菌無熱原水。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的高滲生理鹽水溶液優(yōu)選是滅菌的，無熱原的，包含1-15％(重量)的生理可接受的鹽，并且更優(yōu)選是包含3-7％重量的生理可接受的鹽。
包含活性化合物的液體顆粒氣霧劑可以通過適當(dāng)?shù)姆绞街苽洌缡褂脡毫F化器和超聲波霧化器，參見如美國專利號(hào)4,501,729。霧化器是商業(yè)上可得到的設(shè)備，其轉(zhuǎn)換活性成分的溶液或懸浮液為治療的氣霧劑霧，該轉(zhuǎn)換借助壓縮氣體(一般是空氣或氧氣)的激發(fā)通過狹窄的文氏管孔，或通過超聲波振蕩。
對于霧化器中用的適當(dāng)配方包含液體載體中的活性組分，配方中含有至多40％w/w的活性組分，但優(yōu)選不少于20％w/w。載體一般是水(并且最優(yōu)選是滅菌、無熱原的水)或水稀釋的乙醇溶液，優(yōu)選是等滲制備，但可通過加入如氯化鈉使其對體液是高滲的。如果制劑沒有滅菌，任選的添加劑包含防腐劑，如羥苯甲酯，抗氧化劑，調(diào)味劑，揮發(fā)油，緩沖劑和表面活性劑。
包含活性成分的固體顆粒氣霧劑同樣可以使用任何的固體顆粒治療用的煙霧發(fā)生器。用于給藥固體顆粒治療到受試者的煙霧發(fā)生器生產(chǎn)可呼吸的顆粒和以適于人體給藥的速度產(chǎn)生含有預(yù)先定量劑量的治療劑的氣霧劑體積。固體顆粒煙霧發(fā)生器的一個(gè)示例類型是吹入器。適于吹入法給藥的適當(dāng)配方包含精細(xì)粉碎粉末，其可以通過吹入器被傳送或通過吸筆入至鼻腔。在吹入器中，粉末(如實(shí)現(xiàn)本文所述治療的有效的定量劑量)包含在一般由明膠或塑料制備的膠囊或藥桶中，其在原處是刺孔或者是開口并且粉末通過吸入設(shè)備或通過手工操作泵的驅(qū)動(dòng)而被空氣傳輸。在吹入器中使用的粉末或者包含單獨(dú)活性成分或者是包含活性成分、合適的粉末稀釋劑，如乳糖，和任選的表面活性劑的混合粉末。一般在配方中包含0.1-100％w/w的活性成分。
示例煙霧發(fā)生器的第二種類型包含計(jì)量劑量吸入器。計(jì)量劑量吸入器是被施壓的氣霧劑配藥機(jī)，一般包含或液化推進(jìn)劑中的活性成分的懸浮液制劑或溶液制劑。在使用這些設(shè)備期間，通過適于傳輸定量體積的閥門排放制劑以產(chǎn)生含有活性成分的精細(xì)顆粒噴霧，定量體積一般為10-200μl。適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑包含某些氯氟烴化合物，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，克立氟烷和它們的混合物。制劑可以另外含有一種或多種輔助溶劑，如，乙醇，表面活性劑，如甘油三油酸酯或脫水山梨醇三油酸酯，抗氧化劑和適當(dāng)?shù)恼{(diào)味劑。
可以是受試者給藥或是其他人如護(hù)理者給藥。護(hù)理者可以是對人提供護(hù)理的任何實(shí)體，例如，醫(yī)院，晚期病人醫(yī)院，醫(yī)師診室，門診所；衛(wèi)生保健工作者，如醫(yī)生，護(hù)士，或其它的從業(yè)者；或配偶或監(jiān)護(hù)人，如父母。藥物可以所定劑量的形式提供或以傳送計(jì)量的劑量的分配器的形式提供。術(shù)語“治療有效量”是存在于組合物中的量，該量提供給需要治療受試者的所需藥物水平以達(dá)到預(yù)期的生理反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)施用兩種或多種iRNA試劑的治療有效量到受試者，每個(gè)試劑針對不同的呼吸道病毒，例如RSV和PIV。
術(shù)語“生理學(xué)有效量”是遞送給受試者以提供所需的減輕或治療效果的量。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意為載體可以被送入到肺中對肺沒有顯著的負(fù)面的毒理學(xué)影響。
用作載體的藥物賦形劑的類型包括穩(wěn)定劑，如人血清白蛋白(HSA)，填充劑如糖，氨基酸和多肽；pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液；鹽如氯化鈉；及其類以物。這些載體可以是晶體或無定形形式或可以是兩種的混合物。
尤其重要的填充劑包含合適的糖，多肽，氨基酸或它們的組合。適當(dāng)?shù)奶前瑔翁?，如半乳糖，D-甘露糖，山梨糖，及其類似物；二糖，如乳糖，海藻糖，及其類似物；環(huán)糊精，如2-羥丙基-β-環(huán)糊精；和多糖，如棉子糖，糊精-麥芽糖復(fù)合劑，葡聚糖，及其類似物；糖醇，如甘露醇，木糖醇，及其類似物。優(yōu)選的糖包含乳糖，threhalose，棉子糖，糊精-麥芽糖復(fù)合劑，和甘露醇。適當(dāng)?shù)亩嚯陌於１奖彼峒柞ァ０被岚彼岷透拾彼?，?yōu)選甘氨酸。
適當(dāng)?shù)膒H調(diào)節(jié)劑和緩沖液包含由有機(jī)酸和堿制備的有機(jī)鹽，檸檬酸鈉，抗壞血酸鈉，及其類似物；優(yōu)選檸檬酸鈉。
劑量。iRNA試劑的施用劑量為單位劑量小于約75mg/kg體重，和少于約70，60，50，40，30，20，10，5，2，1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001，或0.0005mg/kg體重，和少于200nmole的RNA試劑(例如，約4.4×1016份)/kg體重，和少于1500，750，300，150，75，15，7.5，1.5，0.75，0.15，0.075，0.015，0.0075，0.0015，0.00075，0.00015nmole的RNA試劑/kg體重。例如，單位劑量可以通過下述方式施用注射(如，靜脈注射或肌內(nèi)注射，鞘內(nèi)注射，或直接注射到器官)，吸入劑量，或局部施用。
可以以約0.00001mg至3mg/器官的劑量等級(jí)直接遞送iRNA到器官(如，直接到肝)，或優(yōu)選為0.0001-0.001mg/器官，約0.03-3.0mg/器官，約0.1-3.0mg/器官或約0.3-3.0mg/器官。
劑量可以是治療或預(yù)防疾病或病癥的有效量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通常以少于每天一次的頻率施用單粒劑量，例如所述頻率少于2，4，8或30天一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不以頻率施用單位劑量(例如不規(guī)則頻率)。例如，單次施用單位劑量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以其它的傳統(tǒng)治療形式施用單位劑量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將起始劑量的iRNA試劑，和一次或多次維持劑量的iRNA試劑施用于受試者，所述iRNA試劑例如為雙鏈iRNA試劑，和siRNA試劑，(例如，前體，例如，能夠被加工成siRNA試劑的較大分子量的iRNA試劑，或能夠編碼iRNA試劑的DNA，例如雙鏈iRNA試劑，或iRNA試劑，或其前體)。維持劑量一般低于起始劑量，例如低于起始劑量的半劑量。
維持方案包含用每日0.01μg-75mg/kg體重的單一劑量或多劑量治療受試者，如每日70，60，50，40，30，20，10，5，2，1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001，或0.0005mg/kg體重。維持劑量優(yōu)選不超過每5，10或30天一次。另外，治療方案可以維持一段時(shí)間，該時(shí)間根據(jù)特定疾病的性質(zhì)嚴(yán)重性和受試者的全面狀況而變化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，劑量可以不超過每天一次的施用頻率，例如所述頻率不超過24，36，48，或更多小時(shí)一次，例如不超過5或8天一次。接下來的治療，可以監(jiān)測受試者病癥的改變和疾病狀態(tài)的癥狀的減輕?；衔锏膭┝炕蛘咴谑茉囌邔δ壳暗膭┝克椒磻?yīng)不顯著的情況下增加，或者是如果疾病狀態(tài)的癥狀減輕，如果疾病狀態(tài)已經(jīng)消除，或者如果出現(xiàn)不愿發(fā)生的副作用，那么劑量可以降低。
在特定的情況下，在適當(dāng)?shù)男枰蚩紤]時(shí)，有效劑量可以以單劑量或兩劑量或多劑量給藥。如果希望有利于重復(fù)或頻繁輸液，可以適當(dāng)?shù)刂踩雮鬏斣O(shè)備，如，泵，半固定支架(如靜脈，腹膜內(nèi)，腦池內(nèi)或囊內(nèi))，或儲(chǔ)存器。
在一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA試劑治療組合物包含多個(gè)iRNA試劑種類。IRNA試劑種類可以具有如下序列該序列相對于天然存在的靶序列(如RSV基因的靶序列)是非重疊的和非臨近的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，許多iRNA試劑種類特異于不同的天然存在的靶基因。例如，靶向RSV的P蛋白基因的iRNA試劑可以存在于靶向不同的基因(如N蛋白基因)的iRNA試劑的藥物組合物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA試劑特異于不同的病毒，如RSV和PIV。
成功的治療后，需要讓受試者進(jìn)行維持治療以防治疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中以0.01μg-100g/kg體重的維持劑量施用本發(fā)明的化合物(參見US6,107,094)。
iRNA試劑組合物的濃度是足以有效治療或預(yù)防疾病或調(diào)節(jié)人的生理狀況的量。所施用的iRNA試劑的濃度或量將依賴于所測量的試劑的參數(shù)和給藥方法，如鼻，含服，或肺。例如，鼻制劑傾向于要求一些組分的濃度較低，以避免對鼻道的刺激或灼傷。有時(shí)需要稀釋口服制劑到10-100倍以提供適當(dāng)?shù)谋侵苿?br> 某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性，先前的治療，受試者的綜合健康和/或年齡，和其它的已有的疾病。而且，使用治療有效量的iRNA試劑對受試者的治療可以包含單一治療或，優(yōu)選可以包含一系列的治療，其中的iRNA試劑如雙鏈iRNA試劑，或siRNA試劑(例如，前體，如，能夠被加工成siRNA試劑的較大分子量的iRNA試劑，或能夠編碼iRNA試劑的DNA，例如雙鏈iRNA試劑，或siRNA試劑，或其前體)?？梢岳斫鈏RNA試劑，如用于治療的siRNA試劑的劑量可以根據(jù)特定治療的過程而增加或降低。劑量的變化可取得療效并使得本文描述的診斷分析結(jié)果顯而易見。例如，可以在施用iRNA試劑組合物后監(jiān)測受試者。例如。根據(jù)檢測信息，可以施用附加量的iRNA試劑組合物。
定量給藥依賴于所治療疾病狀況的嚴(yán)重程度和反應(yīng)性，所述給藥伴隨有持續(xù)幾天到幾個(gè)月的治療過程，或伴隨有直到治療有效或疾病的狀態(tài)減輕的治療過程。最佳的定量給藥時(shí)間表可以由受試者體內(nèi)藥物累積的測量來計(jì)算。普通技術(shù)人員能夠很容易地確定最佳劑量、定量給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可以根據(jù)各個(gè)化合物的相對效力而變化，并且一般根據(jù)動(dòng)物模型的體內(nèi)或體外有效的EC50值來估計(jì)。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物模型包括表達(dá)人基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如生產(chǎn)靶RSV RNA的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于測試的組合物包含iRNA試劑，其互補(bǔ)于，至少在內(nèi)部區(qū)域互補(bǔ)于動(dòng)物模型的靶RSVRNA和人的靶RSV RNA之間的保守序列。
本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例解釋，其不應(yīng)該構(gòu)成進(jìn)一步的限制。
實(shí)施例設(shè)計(jì)防治RSV和HPIV3磷蛋白mRNA的抗病毒siRNA防治RSV P的siRNA和防治HPIV3PmRNA的siRNA已被化學(xué)合成(Bitko，V.&Bank，S.BMC Microbiol.1，34(2001))，并體外測量了它們的IC50(使目標(biāo)減少50％的siRNA濃度)(圖1a)。列出了siRNA序列和IC50值(表1)。抗RSV-P(#1，#2)的兩種siRNA和抗HPIV3(#4)的一種顯示了顯著的抑制活性，并且選擇它們用于進(jìn)一步研究。靶mRNA與蛋白的相關(guān)性，如siRNA#1(Fig.1a)的示例，與RNAi機(jī)理一致，并且如下面我們所展示的，siRNA的體外擊倒活性也與其在動(dòng)物(體內(nèi))中的活性匹配。這樣，體外的分析提供了可靠的、廉價(jià)、快速和方便的抗病毒siRNA藥物的初始篩選。
鼻內(nèi)(IN)siRNA抑制小鼠肺中RSV和HPIV3復(fù)制為了測定體外具有活性的siRNA在實(shí)際感染中是否具有效果，使用了動(dòng)物模型。BALB/c小鼠是沿用已久的RSV感染的實(shí)驗(yàn)室模型，其用于研究疾病的進(jìn)展、病理學(xué)，和免疫學(xué)(Graham，B.S.，et al.，J.Med.Virol.26，153-162(1988)，vanSchaik，S.M.，et al，J.Infect.Dis.177，269-276(1998)，Haeberle，H. A.et al.J.Virol.75，878-890(2001))。用復(fù)合了TransIT-TKO(R)的siRNA通過鼻內(nèi)處理小鼠，4小時(shí)后也通過鼻內(nèi)用107pfu的RSV或HPIV3攻擊每個(gè)動(dòng)物。在接種后約5-6天在鼠肺中觀察到最大化的RSV增長，并且該時(shí)間點(diǎn)用于進(jìn)一步研究。體外有效的(圖1a)siRNA在動(dòng)物體內(nèi)是高度抗病毒的(圖1b，c)。在每只小鼠鼻內(nèi)給藥的劑量為5nmol的siRNA(對于雙鏈siRNA平均約為70μg)時(shí)，siRNA#1和siRNA#4分別以約5000和100倍降低了每個(gè)感染的肺RSV和HPIV3的效價(jià)(圖1b，c)。重要的是，無轉(zhuǎn)染試劑的siRNA也顯著地抑制肺病毒效價(jià)(圖1d)。這說明了使用單一的含iRNA試劑的藥物組合物對于基于吸入給藥的抗病毒治療是可能的。值得一提的是HPIV3不能如RSV一樣易于感染小鼠(Durbin，A.P.，Elkins，W.R.&Murphy，B.R.Vaccine 18，2462-2469(2000))，這也是小鼠肺中HPIV3復(fù)制相對低的原因(圖1c)。以蔗糖純化的高效價(jià)HPIV3作為接種物能夠使模型獲得可測量的小鼠肺部感染。
實(shí)施例的其它的幾個(gè)特征可應(yīng)用于本發(fā)明的各種實(shí)施方案。首先，該結(jié)果證明了siRNA的病毒特異性效果(圖1)。甚至是效力最強(qiáng)的抗RSV的siRNA(#1)也僅抑制RSV而不能抑制HPIV3，反之亦然，其獨(dú)自能反駁IN siRNA具有非特異性抗病毒效果的言論。第二，對于抗熒光素酶siRNA(Elbashir，S.M.et al.Nature 411，494-498(2001))，即使以最高劑量測試(每只鼠50nmole或700ug)，其也不抑制任一病毒(圖1b-d)。最后，在未感染小鼠中，具有或不具有Transit-TKO試劑的IN siRNA沒有引起明顯的不舒適(通過普通表皮、活性、食欲和體重增加，和沒有任何呼吸不良的鑒定)，由此說明了其良好的藥理學(xué)作用，可用于潛在藥物開發(fā)。
值得注意的是在本文描述的所有試驗(yàn)中，病毒蛋白免疫印跡分析的結(jié)果通常與病毒效價(jià)相一致，因此，對于某一給定的試驗(yàn)，它們都能夠作為另一種試驗(yàn)的過剩標(biāo)記并且不提供所有的補(bǔ)充數(shù)據(jù)。
IN siRNA防治肺感染的特異性抗病毒效果雖然上面顯示的結(jié)果證明了對病病毒復(fù)制的抑制，但是它們沒有直接提供肺組織病毒感染的根除。因此，我們使用特異于適當(dāng)病毒的抗體在接種5天后探查雙肺的各個(gè)部分。用10pfu滴注每只小鼠，兩種病毒使健康肺感染。在一般的結(jié)果中(圖2a)，在用復(fù)合了TransIT-TKO的5nmole(70μg)抗RSV siRNA#1預(yù)治療的小鼠中高效地根治了感染。用5nmole的抗HPIV3的siRNA#4也相似地降低了HPIV3感染。同病毒效價(jià)一樣，無轉(zhuǎn)染試劑的siRNA顯示了對感染顯著的降低，如針對RSV所呈現(xiàn)的。對于同樣的siRNA量，我們估算了無試劑復(fù)合的siRNA大約等效于復(fù)合了TransIT-TKO的siRNA的70-80％。雖然在余下的篇幅中我們僅提供了復(fù)合了TransIT-TKO的siRNA，但這些結(jié)果指出了純化的、單純的和沒有其它化合物的siRNA的鼻內(nèi)遞送可以提供防治呼吸道病原體的實(shí)質(zhì)性保護(hù)。這特別重要，因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑本身可具有不良作用。我們在此指出聚乙烯亞胺(PEI)已經(jīng)成功地用作靜脈注射(IV)的載體，以及氣管內(nèi)(IT)遞送防治流感病毒的siRNA和DNA的載體(Ge，Q.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 101，8676-8681(2004))。然而，在我們的試驗(yàn)中，直接地鼻內(nèi)施用(INadministration)PEI，不管其是否具有siRNA，經(jīng)常導(dǎo)致小鼠的明顯患病和/或死亡。
IN siRNA定位于肺部并免激活干擾素為了提供肺部觀察的抑制是鼻部施用的siRNA的直接和特異效果的進(jìn)一步證據(jù)，進(jìn)行了兩種試驗(yàn)。首先，我們能夠通過特定的RNA分析檢測肺部的siRNA的反義鏈。第二，通過下述內(nèi)容排除siRNA抗病毒的效果是由于激活干擾素(IFNs)的可能性。一般而言，副粘病毒編碼各種機(jī)制抵抗IFNs；尤其是RSV對I型IFNs(IFN-α/β)非常穩(wěn)定，盡管其對II型IFN(IFN-γ)敏感(Schlender，J.，et al.，J.Virol.74，8234-8242(2000)，Ramaswamy，M.，et al，Am.J.Respir.CellMoI. Biol.30，893-900(2004))。我們早期的研究顯示siRNA在含有I型IFN基因缺失的Vero細(xì)胞中具有防治RSV和HPIV3的活性(數(shù)據(jù)為示出)。雖然如此，我們在用不同siRNA治療后的不同日期測量了鼠肺中IFN-α和IFN-γ的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有激活任一類型的IFN(圖2c)。
防治RSV和HPIV3混合感染的siRNA競爭保護(hù)由多種因素導(dǎo)致的呼吸道的同時(shí)感染通常是可能的，并且在一些研究中，RSV和HPIV3的聯(lián)合感染已經(jīng)被診斷(Coiras，M.T.，et al，J.Med.Virol.72，484-495(2004))。實(shí)際上，在能夠?qū)煞N病毒同時(shí)提供保護(hù)的期望下，已經(jīng)構(gòu)建了嵌合病毒和合并了RSV和HPIV3抗原的重組疫苗(Schmidt，A.C.，et al.，J.Virol.75，4594-4603(2001)，Bernhard，W.et[alpha]1.Am.J.Respir.Cell MoI.Biol.25，725-731(2001))。siRNA#1和siRNA#4防治RSV和HPIV3的特異抗病毒效果分別提示我們在兩種病毒混合感染的小鼠中測試它們(5nmole或70μg)。對照小鼠用單一種類的siRNA(或者#1或者#4)治療。因?yàn)殡y于確定混合病毒中的每一個(gè)的pfu，所以如上所述，我們借助免疫熒光顯微術(shù)，并使用抗RSV和抗HPIV3抗體的混合物對肺組織部分進(jìn)行雙染色。肺組織的混合感染通過該標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際完成(圖2d)。在用siRNA#1或siRNA#4預(yù)治療的小鼠中，RSV和HPIV3感染分別被抑制，如或者綠或者紅熒光的消失所示，但不是都消失(圖2d)。使用兩種siRNA(每種5nmole，也就是70μg)的組合，兩類熒光都消失了，證明了兩種病毒被抑制(圖2d)。如上，不含轉(zhuǎn)染試劑的相同siRNA也具有高活性(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
有趣的是，在雙感染分析中，當(dāng)過量使用一種siRNA的時(shí)候，另一種的siRNA的活性被抑制(圖3)。當(dāng)siRNA#1(抗RSVP)的濃度從0到20到200nM增加時(shí)，通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR，siRNA#4(抗HPIV3 P)的體外IC50以15，35，100nM增加。這些結(jié)果是經(jīng)免疫印跡的HPIV3 P蛋白的測量確認(rèn)有效的(圖3b)。在小鼠的雙感染中，每個(gè)病毒N蛋白的免疫印跡定量產(chǎn)生了基本上相同的結(jié)論在相同的模式下，每個(gè)siRNA為5nmole(70μg)時(shí)有效抑制兩種病毒，但50nmol的一種siRNA卻降低了相同模式下5nmole的另一種siRNA的效果。
IN siRNA抑制肺病理因?yàn)閟iRNA抑制感染，一個(gè)邏輯問題是它們是否也能夠抑制病理特征的發(fā)展。根據(jù)可見的觀察，siRNA治療的暴露于RSV的小鼠行為和表現(xiàn)基本同未感染的小鼠一樣具有正常的活動(dòng)、光亮的表皮和普通的健康。然后，我們測量了呼吸速率，白細(xì)胞三烯的降低，和肺的炎癥的降低。已知BALB/c小鼠的呼吸速率相應(yīng)于RSV感染增加(Haeberle，H.A.et al.J.Virol.75，878-890(2001)，Volovitz，B.，et al.，Pediatr.Res.24，504-507(1988))。脂氧合酶途徑產(chǎn)生的白細(xì)胞三烯結(jié)合到了存在于支氣管平滑肌的白細(xì)胞三烯受體并且在哮喘病人的呼吸分泌物、RSV感染的人嬰兒，和RSV感染的小鼠中提高(Volovitz，B.，et al.，Pediatr.Res.24，504-507(1988)，Welliver，R.C.，2nd，et al.，J Infect.Dis.187，1773-1779(2003))。這些化合物通過炎癥細(xì)胞激發(fā)了氣管粘液分泌，支氣管收縮和氣管浸潤，它們是嚴(yán)重RSV疾病的重要標(biāo)志。當(dāng)在施用RSV之前或在施用RSV的同時(shí)施用抗RSV的siRNA#1時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了呼吸速率顯著減少、肺組織病理的顯著降低和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞三烯的積累。這些值保持接近基線并基本相當(dāng)于假感染小鼠中的那些值。至少在感染后的14天，所有的參數(shù)都很低，表明siRNA實(shí)際上抑制了疾病而不只是延緩它。實(shí)際上，直到觀察的6周，siRNA治療的小鼠沒有顯示了可見的呼吸窘迫特征。陰性對照RNA或luc-siRNA(表1)顯示在所有的試驗(yàn)中沒有堿輕癥狀(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
IN siRNA是有效的感染后抗病毒藥已經(jīng)顯示了如果在感染前給藥，siRNA能夠抑制呼吸道病毒疾病，我們提出了一個(gè)問題，當(dāng)感染一旦發(fā)生，它們是否具有治療效果，因?yàn)檫@在兒科醫(yī)學(xué)中是重要的目標(biāo)。在該一系列試驗(yàn)中，我們在RSV感染的幾天后施用siRNA#1并每天稱量小鼠的體重。已知RSV感染后的至多8-10天一直減輕體重，之后根據(jù)起始接種物的過高或中等至低等，它們或者死亡或者緩慢恢復(fù)體重(Haeberle，HA.et al.J.Virol 75，878-890(2001))。在相似的一組小鼠中，在預(yù)定的天數(shù)采集肺樣品，以用于分析感染性病毒。如期望的一樣，無siRNA治療的小鼠維持其體重約4天(p.i.)，接著逐漸減輕直到至少9天(圖5a)。在RSV感染之前(數(shù)據(jù)沒有顯示)或與RSV感染的同時(shí)(0天)用siRNA治療的小鼠基本上顯示未感染狀態(tài)并持續(xù)不間斷增加體重。在1天的時(shí)候接受siRNA的大部分小鼠也很難與假感染對照相區(qū)分。在接下來的幾天(1-4天)接受siRNA的那些顯示越來越少的保護(hù)，盡管對于所有的治療在所有的時(shí)間觀察到了體重顯著的改善。
當(dāng)在第2，4，6，8，10，和16天測量這些小鼠的肺RSV效價(jià)的時(shí)候顯現(xiàn)了相似的圖象。在無siRNA治療的小鼠中，效價(jià)增長直到第4-5天，然后緩慢降低到第16天的無法檢測的水平。RSV感染之前或同時(shí)的siRNA治療在所有測試天數(shù)內(nèi)保持效價(jià)下降了5000倍的水平。越是在感染后的時(shí)間施用siRNA，其效果就越小，但是在測試的任何天數(shù)內(nèi)病毒效價(jià)一直低于未治療對照。這顯示了無論何時(shí)給藥siRNA，其降低了病毒復(fù)制的速率，產(chǎn)生了較低峰值的效價(jià)。接著，效價(jià)降低到可檢測水平之下，并且施用siRNA的時(shí)間越早，效價(jià)降低到可檢測水平之下所用的時(shí)間也越少。例如，在未治療的感染小鼠中肺RSV直到第16天(p.i.)可以檢測到肺RSV，但在第1天用siRNA治療(表1)的小鼠中第10天后就檢測不到了。如前述，陰性對照siRNA或熒光素酶siRNA(表1)在所有的試驗(yàn)中沒有效果(未顯示數(shù)據(jù))?？傊?，這些結(jié)果顯示了甚至當(dāng)感染后給藥，RSV P siRNA也具有治療效果，并且相比未治療組，小鼠通常具有更少的病狀且恢復(fù)地更快。
討論該文的主要發(fā)現(xiàn)是適當(dāng)設(shè)計(jì)的siRNA，經(jīng)鼻內(nèi)施用，對呼吸道感染提供保護(hù)，同時(shí)提供了感染后施用的顯著治療。通過簡單手持吸入器傳送的小顆粒氣霧劑的siRNA能夠用于預(yù)防和治療肺感染。當(dāng)我們的手稿處于準(zhǔn)備階段的時(shí)候，兩個(gè)報(bào)告顯示了在鼠模型中siRNA抑制了流感病毒，該病毒是另一個(gè)主要的呼吸道病原體((Ge，Q.，et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 101，8676-8681(2004)，Tompkins，S.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 101，8682-8686(2004))。在一個(gè)研究中(Ge，Q.，et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 101，8676-8681(2004))，合成的siRNA或表達(dá)siRNA的質(zhì)粒DNA通過TV和IT途徑的結(jié)合而被施用。在其它的研究中(Tompkins，S.M，et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 101，8682-8686(2004))，首先通過水壓IV遞送siRNA；均通過IV途徑在16-24小時(shí)后用流感病毒感染小鼠并給予第二劑量的脂質(zhì)載體中的siRNA。在2天后測試到肺病毒的存在，發(fā)現(xiàn)對不同的流感株系具有10-50倍的抑制。相對先前的研究，我們針對RSV和PIV的研究提供了以下改進(jìn)和簡單性(i)遞送只是單獨(dú)鼻內(nèi)給藥，因此，相對的非擴(kuò)散和無痛，使其適于基于吸入器或基于霧氣的治療；(ii)無任何載體的siRNA顯著有效，因此減少了潛在的載體負(fù)面作用的風(fēng)險(xiǎn)；(iii)約5納摩爾的siRNA(70μg的雙鏈RNA)的單一劑量顯示了對感染的全過程提供了有益效果。目標(biāo)序列(如RSV P)的更加廣泛的篩選，更新化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)用可以使得siRNA具有顯著的更低的IC50和更好的藥物動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致使用更低的劑量。siRNA表現(xiàn)了各種程度的非特異性、脫靶效應(yīng)，尤其是高濃度時(shí)(Jackson，A.L.et al.Nat.Biotechnol.21，635-637(2003)，Sledz，CA，et al.，Nat.CellBiol.5，834-839(2003)，Persengiev，S.P.，et al.，RNA 10，12-18(2004)，Bridge，AJ.，etal.，Nat.Genet.34，263-264(2003))。這在治療中是明顯關(guān)注的，并且siRNA的IV給藥可以產(chǎn)生系統(tǒng)性的副作用。相反，鼻內(nèi)遞送的siRNA更期望被集中在呼吸組織中(如果所述siRNA沒有被獨(dú)占性地局部定位)，這樣，最小化了副作用。通過鼻內(nèi)施用合成的siRNA不激活I(lǐng)FN該不激活支持和擴(kuò)展了這一發(fā)現(xiàn)先前的化學(xué)合成的缺少5’磷酸基的siRNA不能激活培養(yǎng)細(xì)胞的IFN途徑(Kim，D.H.et al.Nat.Biotechnol.22，321-325(2004))?？傊?，抗病毒活性與具有特異的mRNA擊倒的相關(guān)性(圖1)，靶組織(肺)中的siRNA檢測(圖2b)，IFN活性的缺乏(圖2c)，和siRNA的病毒特異性效果(圖1-3)，所有的這些提供了抗病毒效果是特異性的，定向和是RNAi介導(dǎo)的。(iii)呼吸道病毒，如RSV和PIV，在感染呼吸組織中的組織嗜性方面表現(xiàn)了高選擇性。這樣，IN遞送保證了siRNA被定向于感染的位點(diǎn)——這是藥理學(xué)的理想狀態(tài)。
雖然RSV和HPIV有時(shí)共感染，但是它們的相互作用被大大忽視。所觀察到的一個(gè)siRNA被另一個(gè)siRNA抑制的現(xiàn)象需要進(jìn)一步研究來確定其準(zhǔn)確的原因。這一事實(shí)也發(fā)生在體外(ex vivo(細(xì)胞培養(yǎng)))，從而反駁了認(rèn)為是動(dòng)物體內(nèi)的體液因子和細(xì)胞因子，如干擾素的作用的結(jié)論，當(dāng)然這些因素也不被安全排除。RSV實(shí)際上抑制了干擾素激活(Schlender，J.，et al.，J.Virol.74，8234-8242(2000)，Ramaswamy，M.，et al.，Am.J.Respir.Cell MoI.Biol.30，893-900(2004))，因此，其應(yīng)該促進(jìn)而不是抑制PIV生長。其它的可能性是一個(gè)病毒的生長抑制另一個(gè)生長，這是通過其它機(jī)理，如細(xì)胞內(nèi)資源的競爭。另一方面，已知細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)理是可飽和的，因此兩種siRNA可能潛在競爭該機(jī)理的固定量(Barik，S.Virus Res.102，27-35(2004)，(Hutvagner，G，et al.，PLoS Biol.2，E98(2004))。值得注意的是，該競爭僅在相對高的siRNA劑量下才能被觀察到，例如，使用幾十或幾百納摩爾(圖3)。然而，僅有幾納摩爾時(shí)，本發(fā)明的siRNA在小鼠中就提供了幾乎完全的保護(hù)。這樣，對于IC50在低納摩爾范圍的siRNA而言，所發(fā)現(xiàn)的競爭不能成為實(shí)際擔(dān)心的問題。
當(dāng)siRNA用作預(yù)防藥的時(shí)候，其不僅預(yù)防感染而且抑制所測的疾病過程中各個(gè)方面的表現(xiàn)，如體重，肺病理，呼吸參數(shù)和過敏反應(yīng)標(biāo)記(圖4)。小鼠和人類的疾病過程的動(dòng)力學(xué)比較相似，但當(dāng)感染RSV后，這兩個(gè)種類的免疫病理的改變就很快產(chǎn)生。當(dāng)siRNA用作感染發(fā)生后的治療藥物時(shí)，其不被期望能夠校正已經(jīng)發(fā)生的病理。即便如此，對病毒進(jìn)一步生長的抑制也會(huì)導(dǎo)致快速治愈和恢復(fù)(圖5)。因此，似乎治療的“機(jī)會(huì)之窗”時(shí)刻存在于RSV感染的患者中，但作為任何疾病，都是早治療應(yīng)該能夠獲得更好的預(yù)后。裸siRNA的有效性需要解釋。呼吸組織，尤其是肺可能本身更容易接受小分子的互換，或者是，可能被感染時(shí)才變得如此。
最后，根據(jù)siRNA-靶之間配對的嚴(yán)格性，暴露于siRNA可引起抗siRNA的病毒的選擇，并且這在HIV中已經(jīng)得到證明(Das，A T.et al.J.Virol.78，2601-2605(2004))。對于這里測試的siRNA，我們還沒有正視這個(gè)問題。從siRNA治療的鼠肺中移出的病毒生長在A549細(xì)胞培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)其對于siRNA表現(xiàn)出與原始接種物相同的IC50(沒有顯示數(shù)據(jù))。而且，對6個(gè)獨(dú)立噬斑純化的RSV隔離群中的P基因的siRNA區(qū)域的測序顯示了野生雙親序列(數(shù)據(jù)沒有顯示)。即使偶然的抗性在將來發(fā)生，可將具有低IC50且靶向PmRNA的不同區(qū)域或不同病毒的mRNA的第二siRNA用于多藥物方案中，由此減少病毒抗性發(fā)生的幾率。
方法病毒，siRNA和其它試劑RSVLong株系和人PIV類型3(HPIV3)JS株系生長在HEp-2單層上，如對RSV的描述(Burke，E.，et al.，Virology 252，137-148(1998)，Burke，E.，et al.，J.Virol.74，669-675(2000)，Gupta，S.，et al.，J.Virol.72，2655-2662(1998))。在約70小時(shí)從含游離的子代病毒的細(xì)胞外培養(yǎng)基收集RSV和在50小時(shí)收集HPIV3。純化病毒并用聚乙二醇(MW 8,000)沉淀，然后用蔗糖梯度離心，基本上如對RSV的描述(Ueba，O.Acta.Med.Okayama 32，265-272(1978))。最終的產(chǎn)品具有108-109pfu/ml的感染效價(jià)，然后以小部分將其冷凍在-80℃保藏。在Hep-2上用中性紅染色通過瓊脂糖空斑試驗(yàn)測定所有的傳染性病毒效價(jià)(pfu)(Burke，E.，et al.，Virology 252，137-148(1998)，Burke，E.，et al.，J.Virol.74，669-675(2000)，Gupta，S.，et al.，J.Virol.72，2655-2662(1998))。
從Dharmacon購買siRNA并按照生產(chǎn)者的建議處理(Bitko，V.&Barik，S.BMC Microbiol.1，34(200 1).The TransIT-TKO(R)reagent was from Minis Bio Corp(Madison，Wisconsin)。從家兔培植的RSV-P抗體，用于所有的免疫組織學(xué)染色(Bitk，V.&Barik，S.BMC Microbiol.1，34(2001))。在羊中培養(yǎng)抗病毒體的多克隆RSV和HPIV3抗體并從Chemicon(Temecula，California)和BiosPacific(Emeryville，California)分別購買；在免疫印跡中核殼蛋白(N)是用這些抗體檢測的主要病毒帶。肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profilin)抗體已有描述(Burke，E.，et al.，J.Virol.74，669-675(2000)，Gupta，S.，et al.，J.Virol.72，2655-2662(1998))。
病毒感染和siRNA治療在單層上對A549細(xì)胞生長進(jìn)行感染和siRNA治療描述在(Bitko，V.&Barik，S.BMC Microbiol.1，34(2001))中。對小鼠的RSV的鼻內(nèi)應(yīng)用是已經(jīng)確立的方法并引起細(xì)支氣管炎。從Charles River Laboratories購買體重為16-20g的無病原體的8-10周的雌性BALB/c小鼠。通過腹膜內(nèi)注射0.2ml的戊巴比妥(5mg/ml)進(jìn)行麻醉，用于感染或施用siRNA。用0.3ml的戊巴比妥麻醉后通過斷頸使其無痛死亡。在生產(chǎn)者提供的稀釋緩沖液中適當(dāng)?shù)叵♂宻iRNA以致于所需的量包含在1μl內(nèi)。試驗(yàn)前快速用5μl的TransIT-TKO(R)和35μl的Opti-MEM(Gibco Life Technologies，Invitrogen，Carlsbad，CA)將其混合以獲得總體積為41μl。當(dāng)使用無載體的siRNA時(shí)，用5μl的Opti-MEM替代5μl的轉(zhuǎn)染試劑。感染前快速將蔗糖純化的病毒適當(dāng)?shù)叵♂屧诶淞姿猁}緩沖鹽水(PBS)中，這樣107pfu的病毒包含在30μl中。假感染是用相同體積的無病毒PBS進(jìn)行。將siRNA混合物和病毒均分別平分到兩個(gè)鼻孔中，并用微量加液器給藥(也就是每個(gè)鼻孔接受20.5μl中的35μg siRNA和15μl中的0.5×107pfu病毒)。對于小鼠不需要任何的特殊設(shè)備，這是因?yàn)樾∈笸ㄟ^自然的呼吸吸入所有的液體。對于雙感染，將RSV和HPIV3原液稀釋，使得每個(gè)小鼠接受107pfu的每個(gè)病毒的以及5nmole(70μg)的混合物，所述混合物和前面所述的一樣，包括相同體積的siRNA#1和siRNA#4。所有的動(dòng)物試驗(yàn)遵從規(guī)定的指導(dǎo)并經(jīng)過IACUC核準(zhǔn)。
肺病毒分析和臨床測量每日檢查動(dòng)物并稱重。注意到了標(biāo)準(zhǔn)的RSV癥狀，所述癥狀包括鼻粘液，由于淤血和細(xì)支氣管炎而增加的呼吸速率，表皮暗淡，皮毛混亂和/或掉毛，和一般的嗜睡及抑郁。通過視頻記錄測量呼吸速率(每分鐘的呼吸次數(shù))(Volovitz，B.，et al.，Pediatr.Res.24，504-507(1988))。噴嚏，嗤鼻和嘆息不做記錄。在感染后(PL)的不同天數(shù)，將肺移出，通過加下描述的感染病毒分析、免疫印跡分析，或免疫染色對RSV進(jìn)行檢測。
為測量病毒效價(jià)，將肺在2％FBS補(bǔ)充的冷DMEM中勻漿(2mlDMEM/100mg組織)。提取物在2,000xg下高速離心10分鐘，然后測定懸浮液的系列稀釋液的pfu。對于病毒蛋白的免疫印跡(Burke，E.，et al.，Virology 252，137-148(1998))，將10μl的均勻樣品(離心前的)加入到10μl的2xSDS-PAGE樣品緩沖液中，在98℃下加熱上述混合物5分鐘，室溫下在微離心管中離心澄清，然后用羊抗RSV和抗HPIV3抗體通過免疫印跡分析10μl的澄清懸浮液。為測量IFN(Durbin，J.E.et al.J.Immunol.168，2944-2952(2002))，將肺在PBS中勻漿，如上處理，然后通過最小檢測量為10pg/ml的ELISA試劑盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)分析系列稀釋液。
對于肺組織病理，灌注肺并固定在10％緩沖甲醛中然后包埋在石蠟中。用蘇木精和伊紅染色多個(gè)厚度為4μm的切片，然后兩個(gè)獨(dú)立的研究人員在光學(xué)顯微鏡下分析細(xì)胞炎癥。通過計(jì)算脈管和細(xì)支氣管周圍的浸潤細(xì)胞的層數(shù)來分析炎癥浸潤。0-3層的浸潤細(xì)胞被認(rèn)為是正常的，而脈管或細(xì)支氣管的的周圍的50％或50％以上有多于三層的浸潤細(xì)胞的話，則認(rèn)為是不正常的。不正常的的血管周圍的空間和細(xì)支氣管周圍的空間除以全部的周圍空間就是作為病理分?jǐn)?shù)。每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)肺總量約為20個(gè)單位空間。使用107RSV(無siRNA)(Haeberle，H. A.et al.J.Virol.75，878-890(2001))，約30-35％的血管周圍和支氣管周圍的空間在早期如第1天發(fā)現(xiàn)并在第5天達(dá)到峰值。
對于免疫組織學(xué)(Haeberle，H.A.et al.J.Virol.75，878-890(2001))，將肺組織包埋在100％的OCT化合物，然后在-80℃下冷凍。將切片切割到載玻片上、風(fēng)干，在丙酮中固定，在PBS中洗滌，然后用0.2％的TritonX-100(PBS中)滲透，室溫下用10％羊血清在PBS中封閉20分鐘。在PBS中多次洗滌后，用PBS中稀釋的含1.5％羊血清的抗RSV-P或抗HPIV3抗體將組織在室溫下孵育2小時(shí)。在PBS中再次多次洗滌載玻片，然后用結(jié)合FITC的抗兔和結(jié)合TRITC的抗羊免疫球蛋白G抗體檢測兩種抗體。室溫下孵育1小時(shí)后，在PBS中最后洗滌載玻片，用DABCO-DAPI固定介質(zhì)固定，然后用熒光顯微鏡觀察(Bitko，V.&Barik，S.BMC Microbiol.1，34(2001))。
通過用5×1.0ml的普通生理鹽水(每ml含10μg的吲哚美辛)灌注支氣管和肺來收集支氣管肺泡灌注液(BALF)(Bernhard，W.et al.Am.J.Respir.CellMoI.Biol.25，725-731(2001))；每個(gè)鼠的總BALF回收物是4.2-4.4ml。丟棄含可見血污染的樣品。4℃下5000xg離心15分鐘從BALF中除去細(xì)胞，然后將樣品儲(chǔ)存在-80℃直到進(jìn)一步分析。使用ELISA試劑盒按照按照生產(chǎn)者的建議(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)測量BALF中的半胱氨酸白稀薄阿三烯結(jié)合物的濃度。根據(jù)產(chǎn)物插入(product insert)，試劑盒與各種白細(xì)胞三烯的交叉反應(yīng)性是LTC4 100％，LTD4 115％，LTE4 63％和LTB4 1.2％。
對于實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)，從HPIV3感染的細(xì)胞中分離RNA和用GeneAmp RNAPCR Core試劑盒(Perkin-Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)制備第一鏈cDNA。通過來自Premier Biosoft的Beacon Designer soflwarev 2.13設(shè)計(jì)引物。下面的引物用于擴(kuò)增HPIV3 P mRNA5′-GGTCATCACACGAATGTACAAC-3′(SEQ ID NO1)和5′-CTTGGAACATCTGCAGATTGTC-3′(SEQ ID NO2)使用iQ Sybr Green SuperMix在BioRad Laboratories(Hercules，California)的iCycler iQ Quantitative PCR系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。用生產(chǎn)者的軟件和GAPDH作為內(nèi)部對照計(jì)算基因表達(dá)測量。
提取肺中的siRNA反義鏈并使用末端標(biāo)記了32P的互補(bǔ)的合成寡核苷酸通過如描述于(Reinhart，B.J.，et al.，Genes&Dev.16，1616-1626(2002))的RNA印跡雜交進(jìn)行檢測。
統(tǒng)計(jì)分析。分析治療組之間和體外試驗(yàn)組之間的變化的手段如下通過單向方差分析(one-way ANOVA)，然后用Bonferroni校正的Student′st檢測。通過Mann-Whitney測試確定白細(xì)胞三烯濃度的增加。從至少3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)收集所有的數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為平均數(shù)±SEM(圖表中的錯(cuò)誤范圍)。P＜0.05時(shí)被認(rèn)為顯著差異。
表1siRNA序列

RSV-P、HPIV3-P和蟲熒光素酶序列的GenBank序列號(hào)分別是M22644、Z11575和X65324。注釋siRNA序列是基于我們實(shí)驗(yàn)室的病毒株的實(shí)際測試；因此，siRNA#2與GenBank序列具有一個(gè)核苷酸的差異(M22644中下劃線的C是U)。陰性對照siRNA序列來自Qiagen(Valenia，California)。
序列表<110>南阿拉巴馬州醫(yī)學(xué)科學(xué)基底(University of South Alabama College of Medicine)<120>RSV、PIV和其它呼吸道病毒的RNAi調(diào)節(jié)及其用途(RNAI MODULATION OF RSV，PIV AND OTHERRESPIRATORY VIRUSES AND USES THEREOF)<130>18358-002W01<150>US 11/151,976<151>2005-06-14<150>US 60/621,552<151>2004-10-22<150>US 11/151,893<151>2005-06-14<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ggtcatcaca cgaatgtaca ac 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2cttggaacat ctgcagattg tc 22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝deoxythymidine
<400>3cgauaauaua acugcaagan n21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>4ucuugcaguu auauuaucgn n21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>5cccuacacca agugauaaun n21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>6auuaucacuu gguguagggn n21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)
<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>7gaugc cauga uugguuuaan n 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>8uuaaaccaau cauggcaucn n21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>9cgaguuguau guguagcaan n21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>10uugcuacaca uacaacucgn n21<210>11<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>11gauagacuuc cuagcaggan n21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>12uccugcuagg aagucuaucn n21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>13cguacgcgga auacuucgan n21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)
<400>14ucgaaguauu ccgcguacgn n21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>15uucuccgaac gugucacgun n21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通過合成生成的寡核苷酸(Synthetically generated oligonucleotide)<220>
<221>misc_feature<222>20，21<223>n＝脫氧胸苷(deoxythymidine)<400>16acgugacacg uucggagaan n2權(quán)利要求
1.降低受試者體內(nèi)細(xì)胞中的病毒蛋白水平、病毒mRNA水平或病毒效價(jià)水平的方法，該方法包括將iRNA試劑施用于所述受試者的步驟，其中iRNA試劑包含具有互補(bǔ)于來自第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒基因的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈和具有互補(bǔ)于所述有義鏈的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物呼吸道病毒選自由PIV和RSV所組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述來自所述RSV的基因是P蛋白基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑包含選自表1中一種試劑的15個(gè)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述iRNA試劑是通過鼻內(nèi)施用于受試者的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述iRNA試劑是通過吸入或噴霧施用于受試者的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述iRNA試劑降低了所述受試者體內(nèi)的病毒效價(jià)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將第二iRNA試劑聯(lián)合施用于所述受試者，其中所述的第二iRNA試劑包含具有互補(bǔ)于來自第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒基因的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈和具有互補(bǔ)于所述有義鏈的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者被診斷為具有病毒感染。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒是RSV，所述第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒是PIV。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述受試者被診斷為被所述第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒和所述第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒所感染。
12.降低受試者體內(nèi)細(xì)胞中的第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒和第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒的病毒蛋白水平的方法，該方法包括將第一iRNA試劑和第二iRNA試劑聯(lián)合施用于所述受試者的步驟，其中所述第一iRNA試劑包含具有互補(bǔ)于來自第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒基因的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈和具有互補(bǔ)于所述有義鏈的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈，所述第二iRNA試劑包含具有互補(bǔ)于來自第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒基因的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈和具有互補(bǔ)于所述有義鏈的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一哺乳動(dòng)物呼吸道病毒是RSV，所述第二哺乳動(dòng)物呼吸道病毒是PIV。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述iRNA試劑是通過鼻內(nèi)而施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述iRNA試劑是通過吸入或噴霧而施用。
全文摘要
本發(fā)明基于如下體內(nèi)存在的事實(shí)，即鼻內(nèi)施用RNAi試劑以及腸胃外施用該試劑可以抑制RSV和PIV。而且本發(fā)明顯示了針對一種以上病毒的同時(shí)治療可以有效地降低病毒?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了通常的和特定的用于降低受試者體內(nèi)RSV或PIV mRNA水平、RSV或PIV蛋白水平和病毒效價(jià)的組合物和方法，所述受試者例如為哺乳動(dòng)物，如人。這些發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于其它呼吸道病毒。
文檔編號(hào)C07H21/04GK101087527SQ200580044486
公開日2007年12月12日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者賽倫·巴勒克 申請人:南阿拉巴馬州醫(yī)藥科學(xué)基地