Virosaine A的四氫吡咯基和嗎啉基衍生物的組合物在抗病毒藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的四氫吡咯基和嗎啉基衍生物的組合物在抗病 毒藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus，HSV-l)和單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virus，HSV-2)屬于皰疹科病毒，HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹，同 時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴重感染甚至宮內感染的重要病原。
[0003] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染， 在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎，是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
[0004] 甲型流感病毒（Influenza A virus，F(xiàn)lu_A)屬于正粘科病毒，在人類和其他生物 每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴重呼吸系統(tǒng)感染，甚者 引起肺炎、腦炎甚至死亡。
[0005] 上述三種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產物 中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物 最有重要價值。
[0006] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2012年發(fā)表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化 合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物，并對該組合物抗病毒活性進行了評價， 其具有抗病毒活性。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為15%和85%。
[0008]
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0010] 藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學上可接 受的鹽具有同樣的藥效。
[0011]組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
[0012]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1化合物Virosaine A的制備
[0014] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(Bing-Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B, Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[0015]
[0016] 實施例2 Virosaine A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0017] 將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(3.76(^，20.00臟〇1)和51^的50%氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏 度攪拌Shdh之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(26lmg，78% )。
[0018] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(s，lH)，3.81(s，2H)，3.59(s，lH)， 3.43(s,2H),3.33(s,lH),2.26(s,lH),1.58(d,J=9.8Hz,3H),1.41(s,2H).
[0019] 13C 匪R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s),106.71(s),79.95(s),74.33(s),69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0020] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci4Hi7BrN〇4:342.0341 ；found 342.0343.
[0021]
買施例3 Virosaine A的0_(四氫吡唂基）乙基佑生物（III)的合成
[0023] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2.5mmo 1)，碘化鉀(84mg，0.5mmo 1)和吡略燒（1420mg，20mmo 1)，混合物加熱回流lh。反應結 束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水 洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品 用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1.5，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得 到Virosaine A的0-(四氫吡咯基）乙基衍生物（III)的淡黃色膠狀固體(111.6mg，67% )。
[0024] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.92(s，lH)，4.11(s，lH)，3.66(s，lH)，3.53(s，2H)， 3.45(d,J=66.9Hz,lH),2.64(s,2H),2.52(s,4H),2.29(s,lH),1.71(s,4H),1.64(s,2H), 1.61(s,lH),1.50(s,2H).
[0025] 13C NMR( 125MHz，DMS0-d6)Sl71.83(s), 106.73(s),79.97(s),74.35(s),66.72((1, J = 9.2Hz),54.42(d ,J = 17.1Hz),44.23(s),35.58(s),25.86(s),25.23(s),21.90(s).
[0026] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci8H25N2〇4:333.1814;found:333.1811。
[0027]
[0028] 實施例4 Virosaine A的0_(嗎啉基）乙基衍生物的合成
[0029] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmo 1)，碘化鉀(84mg，0 · 5mmo 1)和嗎啉（1742mg，20mmo 1)，混合物加熱回流lh。反應結束 后將反應液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集黃色集中洗脫帶即得 到Virosaine A的0-(嗎啉基）乙基衍生物的黃色固體(IV) (125.3mg，72% )。
[0030] 咕 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.95(s，lH)，4· 12(s，lH)，3.68(s，lH)，3.63((1, J = 8·4Ηζ，1Η)，3.61(s，4H)，3.57-3.26(m，3H)，2.61(s，2H)，2.56(s，2H)，2.51-2.03(m，5H)， 1.70(d ,J = 3.1Hz,lH),1.65(d ,J = 25.6Hz,lH),1.52(s,2H).
[0031] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.85(s)，106.73(s)，79.95(s)，74.34(s)，66.75(t, J=4.6Hz),54.46(s),52.93(s),44.22(s),35.55(s),25.88(s),21.89(s).
[0032] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci8H25N2〇5:349.1763;found:349.1761。
[0033
[0034」實施例5組合物抗病毒活性
[0035](一)實驗例:組合物對皰疹病毒的作用研究：
[0036] (1)細胞株與病毒株：
[0037] 人胚腎細胞(HEK293，為HSV-1、HSV-2病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；單純 皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引自中國⑶C病毒病研究所。 [0038] (2)細胞毒性測定：
[0039] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的15mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的85mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0040]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008;24(1):25~27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋（2<) -5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔 (A、B、C行），平行設微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定0D值，將實驗組與細胞對照組 0D值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0041 ] (3)抑毒試驗：
[0042]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008; 24( 1): 25~27)的方法，將樣品按稀釋順序(24>14)橫向接 種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100 個TCID 5Q的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設 F行作為病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察 4d。病毒對照出現(xiàn)90%以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值， 各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5Q)，最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù)(ΤΙ)。
[0043] ⑷結果：
[0044]①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物 III 和化合物 IV 的 TD5Q 在 HEK293 分別為 2-2·13、2-2·75、2-2· 68。
[0045] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-1、HSV-2病毒對 照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%以上的CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細胞融合 (HSV 1致多個細胞融和成大泡，而HSV 2致融合為小泡）、變圓、脫落為主要特征。
[0046] 而組合物抑毒試驗各組細胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE: HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn) CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0047]而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。 [0048] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q，IC5Q與TD5Q相比獲得組合物的ΤΙ:抑制 HSV-l、HSV-2在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC5()分別為2-11·12、2- 11·58，TI分別為508·5、699·4?；?物III的ΤI:對應的IC5Q分別為Τ 3·41、24·76，ΤI分別為1.6、4.0?；衔颕V的ΤI:對應的IC 50分 別為 2-4·12、2-4·33，TI 分別為2.7、3.1。
[0049]結論：組合物具有顯著的抗皰疹科病毒（包括HSV-UHEV-2)的作用，而且安全性 高，因此組合物在治療皰疹病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景。化合物III和化合物IV不 具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-l、HEV-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III和 化合物IV在治療皰疹病毒感染疾病中沒有應用背景。
[0050](二)實驗例:組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
[0051 ] (1)組合物、化合物III和化合物IV的配置:將藥物溶于細胞維持液(含2 %新生牛 血清的MEM，GIBIC0公司產品）中備用。
[0052] (2)細胞株與病毒株：
[0053] 人胚腎細胞(HEK293，RSV病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病毒 (RSV)Long株引自中國⑶C病毒病研究所。
[0054] (3)細胞毒性測定：
[0055] 參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品以2倍比做系列 稀釋(2°^ 6)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向 重復3孔(A、B、C行），平行設微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照， 顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定0D值，將實驗組與細胞 對照組0D值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0056] (4)抑毒試驗：
[0057]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品按稀釋順序(2 -2一 13)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、 B、C行加含100個TCID5Q的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥 物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37°C、5%⑶ 2培養(yǎng)，每日觀察 CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%以上CPE時，加 l%中性紅染色，用酶標儀在波長540nm 波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存 活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5Q)，最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù) (TI)。
[0058] (5)結果：
[0059] ①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對HEK293的TD 5Q分別為、2<·47、2<·52。
[0060] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在第 2d出現(xiàn)90 %以上的CPE，RSV在HEK293 CPE以折光性增強、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0061 ]而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0062] RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前，細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0063]而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。 [0064] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q，IC5Q與TD5Q相比獲得ΤΙ:組合物抑制RSV 在 HEK293細胞發(fā)生 CPE，IC5〇 為 2-11 ·16，ΤΙ 為 568.1;化合物III 的 IC5〇 為2-4·12，ΤΙ 為3.1;化合物 IV 的 IC5Q 為 2-4·64，ΤΙ 為 4.3。
[0065]結論:組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用來制備 抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV的作用，不可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
[0066](三)實驗例:組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0067] (1)細胞株與病毒株:狗腎細胞(MDCK，流感病毒敏感細胞）引自中國CDC病毒病研 究所;流感病毒甲型(Flu Α) 1995. All: 32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
[0068] (2)細胞毒性測定：
[0069]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008;24(1): 25~27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋（2 4-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔 (A、B、C行），平行設微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定0D值，將實驗組與細胞對照組 0D值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0070] (3)抑毒試驗：
[0071]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008; 24( 1): 25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板 孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID 50 的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為 病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 % C02培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對 照出現(xiàn)90 %以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去 除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方 法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5Q)，最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[0072] ⑷結果：
[0073]①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對的TD5Q在MDCK分別為2-2 ·75、2-2 ·19、2-2 ·34。
[0074] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu A在MDCK CPE以 折光性增強、壞死、破碎為主要特征。
[0075] 而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE :FluA_MDCK組 細胞在第8稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0076] 而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。 [0077]將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q，IC 5Q與TD5Q相比獲得TI:組合物抑制 Flu A在MDCK細胞發(fā)生CPE，IC5q為2-η·14，ΤΙ為335.5 ;化合物111的1(：5()為2-4'22，1'1為4.1 ;化 合物 IV 的 IC5Q為 2-4·37，ΤΙ 為4.1。
[0078] 結論:組合物對甲型流感病毒具有很強的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒沒 有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染 疾病中沒有應用背景。
[0079] 實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0080] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0081] 實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0082] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物HI和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為15%和85%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數(shù)分別為15%和85%充分混合。3. -種如權利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述病毒為甲型流 感病毒。5. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述病毒為單純瘤 疹病毒。6. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述病毒為呼吸道 合胞病毒。7. 如權利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 為單純瘤疹病毒1型或者單純瘤癥病毒2型。8. 如權利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 1型為單純瘤疹病毒1型的Sm44株。9. 如權利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 2型為單純瘤癥病毒2型333株。
【文檔編號】A61P31/14GK105935360SQ201610278636
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔣登旭
【申請人】鎮(zhèn)江瑪珂蕘生物醫(yī)藥科技有限公司