Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗病毒藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領(lǐng)域,具體涉及組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明,本發(fā)明的組合物具有抗病毒作用,具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗病毒藥 物中的應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領(lǐng)域,具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV-l)和單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virus,HSV-2)屬于皰疹科病毒,HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹,同 時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴重感染甚至宮內(nèi)感染的重要病原。
[0003] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染, 在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎,是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
[0004] 甲型流感病毒(Influenza A virus,F(xiàn)lu_A)屬于正粘科病毒,在人類和其他生物 每年都有小范圍的流行,引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時,可引起嚴重呼吸系統(tǒng)感染,甚者 引起肺炎、腦炎甚至死亡。
[0005] 上述三種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題,從天然產(chǎn)物 中尋找化合物或先導化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物,從而得到高效低毒的潛在藥物 最有重要價值。
[0006] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2012年發(fā)表(Bing-Xin Zhao et al ., 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的化合物,我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾,獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化 合物IV,并用化合物III和化合物IV制備了組合物,并對該組合物抗病毒活性進行了評價, 其具有抗病毒活性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物,該組合物由化合物III和化合物IV組成,該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%。
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0010] 藥效學實驗表明,本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學上可接 受的鹽具有同樣的藥效。
[0011]組合物的體外實驗表明,組合物具有很強的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性, 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
[0012]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明,但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制,而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1化合物Virosaine A的制備
[0014] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(Bing-Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法 D
[0016] 實施例2Virosaine A的0-溴乙基衍生物(II)的合成
[0017] 將化合物I (235mg,1. OOmmo 1)溶于20mL苯,向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB) (0.088),1,2-二溴乙烷(3.76(^,20.00臟〇1)和51^的50%氫氧化鈉溶液?;旌衔镌?5攝氏 度攪拌Shdh之后將反應液倒入冰水中,立即用二氯甲烷萃取兩次,合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次,再用無水硫酸鈉干燥,最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇,v/V),收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(26lmg,78% )。
[0018] 4 MMR(500MHz,DMS0-d6)S5.91(s,lH),4.07(s,lH),3.81(s,2H),3.59(s,lH), 3.43(s,2H),3.33(s,lH),2.26(s,lH),1.58(d,J=9.8Hz,3H),1.41(s,2H).
[0019] 13C 匪R(125MHz,DMS0-d6)Sl71.81(s),106.71(s),79.95(s),74.33(s),69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0020] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci4Hi7BrN〇4:342.0341 ;found 342.0343.
[0022] 實施例3 Virosaine A的0_(哌嗪基)乙基衍生物(III)的合成
[0023] 將化合物II(17lmg,0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當中,向其中加入無水碳酸鉀(690mg, 5.0mmol),碘化鉀(168mg,1 .Ommol)和無水哌嗪(3446mg,40mmol),混合物加熱回流3h。反應 結(jié)束后將反應液倒入冰水中,用等量二氯甲烷萃取2次,合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相,再用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇,v/v),收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物III的淡棕色固體(123.2mg,71 % )。
[0024] MMR(500MHz,DMS0-d6)S5.90(s,lH),4.04(s,lH),3.59(s,lH),3.50(s,2H), 3.40(d,J=65.9Hz,lH),2.64(s,4H),2.54(s,2H),2.31(s,4H),2.22(s,lH),1.62(s,2H), 1.56(s,lH),1.43(s,2H),0.97(s,lH).
[0025] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)Sl71.84(s),106.72(s),79.94(s),74.33(s),66.72(d, J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0026] HRMS(ESI):m/z[M+H].calcd for Ci8H26N3〇4:348.1923;found:348.1927。
[0029] 實施例4Virosaine A的0_(咪唑基)乙基衍生物(IV)的合成
[0030] 將化合物II(17lmg,0.5mmo 1)溶于25mL乙腈當中,向其中加入無水碳酸鉀(690mg, 5 ? Ommo 1),碘化鉀(2 5 2mg,1 ? 5mmo 1)和咪唑(8 7 Omg,1 Ommo 1),混合物加熱回流2h。反應結(jié)束 后將反應液倒入25mL冰水中,用等量二氯甲烷萃取3次,合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相,再用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:0.3,v/v),收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物IV的淡棕色固體(144. lmg,71 % )。
[0031] XH NMR(500MHz,DMS0-d6)87.86(s,lH),7.12(s,lH),6.71(s,lH),5.99(s,lH), 4.09(s,lH),3.89(d,J=16.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.58(s,lH),3.35(s,lH),2.31(s,lH), 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0032] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)13C 匪R(125MHz,Common 匪R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s),128.67(s),119.31(s),106.70(s),79.92(s),74.31(s),67.61(s),66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0033] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci7H2〇N3〇4:330.1454;found:330.1458。
[0035]實施例5組合物抗病毒活性
[0036](一)實驗例:組合物對皰疹病毒的作用研究:
[0037] (1)細胞株與病毒株:
[0038] 人胚腎細胞(HEK293,為HSV-1、HSV-2病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司;單純 皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引自中國⑶C病毒病研究所。 [0039] (2)細胞毒性測定:
[0040] 組合物的制備:將研磨之后過200目網(wǎng)的20mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的80mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物, 使用時用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0041]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008;24(1):25~27)的方法,將各樣品以2倍比做系列稀釋(2<) -5),然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上,每孔100uL,每稀釋度縱向重復3孔 (A、B、C行),平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照,7~12孔不接種細胞為空白對照,顯微鏡 下每日觀察CPE,連續(xù)觀察7d,中性紅染色,在540nm波長測定0D值,將實驗組與細胞對照組 0D值相比計算細胞存活率,用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0042] (3)抑毒試驗:
[0043]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008; 24( 1): 25~27)的方法,將樣品按稀釋順序(2^3>14)橫向接 種于96板孔中的單層細胞上,每孔100uL,每稀釋度縱向重復4孔,微孔板的A、B、C行加含100 個TCID 5Q的病毒100uL作為試驗組,D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照,平行設(shè) F行作為病毒對照,E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 %⑶2培養(yǎng),每日觀察CPE,連續(xù)觀察 4d。病毒對照出現(xiàn)90%以上CPE時,加1 %中性紅染色,用酶標儀在波長540nm波長讀取A值, 各組A值去除病毒對照組A值,將各試驗組與細胞對照組A值相比,獲得細胞存活率,用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC 5Q),最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[0044] (4)結(jié)果:
[0045]①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物 III 和化合物 IV 的 TD5Q 在 HEK293 分別為 2-2'34、2-2'16、2-2' 29。
[0046]②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn),HSV-1、HSV-2病毒對 照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%以上的CPE,HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細胞融合 (HSV 1致多個細胞融和成大泡,而HSV 2致融合為小泡)、變圓、脫落為主要特征。
[0047]而組合物抑毒試驗各組細胞,按照組合物樣品稀釋梯度,梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE: HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀釋度之前細胞完全被保護,之后出現(xiàn) CPE,CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0048]而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。 [0049] 將上述實驗板用1%中性紅染色、用酶標儀測450nmA值,各組A值減掉病毒對照組A 值后,各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC 5Q,IC5Q與TD5Q相比獲得組合物的TI:抑制 HSV-1、HSV-2在HEK293細胞發(fā)生CPE,IC 5Q分別為2-11 ?76、2-11 ?14,TI分別為685 ? 0、445 ? 7?;?物III的TI:對應的IC5Q分別為2i95、24' 68,TI分別為3.5、5.7?;衔?¥的11:對應的1(:50分 別為2- 4'72、2-4'88,TI 分別為5 ? 4、6 ? 0。
[0050]結(jié)論:組合物具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-UHEV-2)的作用,而且安全性 高,因此組合物在治療皰疹病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?;衔颕II和化合物IV不 具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-l、HEV-2)的作用,而且安全性極低,因此化合物III和 化合物IV在治療皰疹病毒感染疾病中沒有應用背景。
[0051 ](二)實驗例:組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
[0052] (1)組合物、化合物III和化合物IV的配置:將藥物溶于細胞維持液(含2 %新生牛 血清的MEM,GIBIC0公司產(chǎn)品)中備用。
[0053] (2)細胞株與病毒株:
[0054] 人胚腎細胞(HEK293,RSV病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司;呼吸道合胞病毒 (RSV)Long株引自中國⑶C病毒病研究所。
[0055] (3)細胞毒性測定:
[0056]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008;24(1):25~27)的方法,將樣品以2倍比做系列 稀釋(2°^6),然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上,每孔100uL,每稀釋度縱向 重復3孔(A、B、C行),平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照,7~12孔不接種細胞為空白對照, 顯微鏡下每日觀察CPE,連續(xù)觀察7d,中性紅染色,在540nm波長測定0D值,將實驗組與細胞 對照組0D值相比計算細胞存活率,用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。 [0057] (4)抑毒試驗:
[0058]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008;24(1):25~27)的方法,將樣品按稀釋順序(2 _2一 13)橫向接種于96板孔中的單層細胞上,每孔100uL,每稀釋度縱向重復4孔,微孔板的A、 B、C行加含100個TCID5Q的病毒100uL作為試驗組,D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥 物對照,平行設(shè)F行作為病毒對照,E行的1~12作為細胞對照。37°C、5%⑶2培養(yǎng),每日觀察 〇卩£,連續(xù)觀察4(1。病毒對照出現(xiàn)90%以上0?£時,加1%中性紅染色,用酶標儀在波長54〇11111 波長讀取A值,各組A值去除病毒對照組A值,將各試驗組與細胞對照組A值相比,獲得細胞存 活率,用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC 5Q),最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù) (TI)。
[0059] (5)結(jié)果:
[0060] ①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對HEK293的TD 5Q分別為T2'27、2^13、2<'65。
[0061 ]②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn),RSV病毒對照組在第 2d出現(xiàn)90%以上的CPE,RSV在HEK293CPE以折光性增強、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0062]而組合物抑毒試驗各組細胞,按照樣品稀釋梯度,梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0063] RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前,細胞完全被保護,之后出現(xiàn)CPE,CPE隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0064]而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。 [0065] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值,各組A值減掉病毒對照組A 值后,各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q,IC 5Q與TD5Q相比獲得TI:組合物抑制RSV 在 HEK293細胞發(fā)生 CPE,IC5Q 為2-11 ?94,TI 為 814.6;化合物III 的 IC5Q 為2-4'36,TI 為4.7;化合物 1¥的比5()為2-4.15,1'1為2.8。
[0066]結(jié)論:組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用,可以用來制備 抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?;衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV的作用,不可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
[0067](三)實驗例:組合物對甲型流感病毒的作用研究:
[0068] (1)細胞株與病毒株:狗腎細胞(MDCK,流感病毒敏感細胞)引自中國CDC病毒病研 究所;流感病毒甲型(Flu A) 1995. All: 32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
[0069] (2)細胞毒性測定:
[0070]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008;24(1): 25~27)的方法,將各樣品以2倍比做系列稀釋(2 4-5),然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上,每孔100uL,每稀釋度縱向重復3孔 (A、B、C行),平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照,7~12孔不接種細胞為空白對照,顯微鏡 下每日觀察CPE,連續(xù)觀察7d,中性紅染色,在540nm波長測定0D值,將實驗組與細胞對照組 0D值相比計算細胞存活率,用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0071] (3)抑毒試驗:
[0072]參照文獻(汪受傳,王霖,陳超等,清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究,南京中醫(yī)藥大學學報,2008; 24( 1): 25~27)的方法,將樣品按稀釋順序橫向接種于96板 孔中的單層細胞上,每孔100uL,每稀釋度縱向重復4孔,微孔板的A、B、C行加含100個TCID 50 的病毒100uL作為試驗組,D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照,平行設(shè)F行作為 病毒對照,E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 % C02培養(yǎng),每日觀察CPE,連續(xù)觀察4d。病毒對 照出現(xiàn)90 %以上CPE時,加1 %中性紅染色,用酶標儀在波長540nm波長讀取A值,各組A值去 除病毒對照組A值,將各試驗組與細胞對照組A值相比,獲得細胞存活率,用Reed-Muench方 法計算半數(shù)抑毒濃度(IC 5Q),最終將TD5Q和IC5Q相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[0073] ⑷結(jié)果:
[0074]①樣品TD5Q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對的TD5Q在MDCK分別為2-3 ?19、2-2 ?83、2-2 ?65。
[0075] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn),F(xiàn)lu A在MDCK CPE以 折光性增強、壞死、破碎為主要特征。
[0076]而組合物抑毒試驗各組細胞,按照樣品稀釋梯度,梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE :FluA_MDCK組 細胞在第8稀釋度之前細胞完全被保護,之后出現(xiàn)CPE,CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0077]而化合物III和化合物IV處理組在濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。 [0078]將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值,各組A值減掉病毒對照 組A值后,各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q,IC 5Q與TD5Q相比獲得TI:組合物抑制 Flu A在MDCK細胞發(fā)生CPE,IC5Q為2-n'74,TI為374.8 ;化合物111的1(:5()為2-4'32,1'1為2.8 ;化 合物^的扣印為]-4'16,!!*〗』。
[0079] 結(jié)論:組合物對甲型流感病毒具有很強的抑制作用,而且安全,因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景。化合物III和化合物IV對甲型流感病毒沒 有顯著的抑制作用,而且安全性極低,因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染 疾病中沒有應用背景。
[0080] 實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0081] 取2克組合物,加入制備片劑的常規(guī)輔料18克,混勻,常規(guī)壓片機制成100片。
[0082] 實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0083]取2克組合物,加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克,混勻,裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物,其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成,該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%,2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法,其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述病毒為甲型流 感病毒。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述病毒為單純皰 疹病毒。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述病毒為呼吸道 合胞病毒。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述單純皰疹病毒 為單純皰疹病毒1型或者單純皰癥病毒2型。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述單純皰疹病毒 1型為單純皰疹病毒1型的Sm44株。9.如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用,其特征在于:所述單純皰疹病毒 2型為單純皰癥病毒2型333株。
【文檔編號】A61K31/439GK105853425SQ201610274881
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔣登旭
【申請人】鎮(zhèn)江瑪珂蕘生物醫(yī)藥科技有限公司