專利名稱：結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于癌癥的革巴向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy,CTGVT)領域，具體涉及結(jié)直腸癌特異性的靶向基因-病毒治療(CancerTargetingGene-Viro-Therapy Specific for Colorectal Cancer, CTGVT-CRC),更具體的，是關于一種結(jié)直腸癌特異性基因-病毒治療藥物。
背景技術：
1999-2001年，劉新垣創(chuàng)建了一種癌癥治療策略，叫癌癥的靶向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Thearpy, CTGVT),它是將抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus, 0V)而成，故 CTGVT 策略即 OV-(gene)策略或 Gene ArmedOncolyticVirus Therapy (GAOVT)策略，后者也是OV-(gene)，CTGVT (GAOVT)把基因治療和溶瘤病毒治療各自的優(yōu)勢結(jié)合起來了，因為溶瘤病毒本身就有抗癌作用，又可能特異性地在癌細胞中復制數(shù)百倍，插入其中的抗癌基因也可隨之復制數(shù)百倍，故其抗癌效果大大地增加，既比相應單獨基因治療好很多，也比相應單獨溶瘤病毒治療好很多，故現(xiàn)在成為國際熱點課題?；蛑委?，雖然2009年被Science評為全球十大科學成果之一，但那都是對單基因缺乏的遺傳病所獲得的成果，對癌癥這樣復雜又是多基因突變的疾病，基因治療的抗癌效果，遠不如CTGVT(GAOVT)的抗癌效果，基因治療為Ad-(gene)，其中所用的載體Ad無癌癥靶向性，在癌細胞中無復制能力(即非復制型Ad)，故其抗癌效果，遠遠不如CTGVT。如圖5所示，腺病毒有早期基因有El、E2、E3、E4及晚期基因L1、L2、L3、L4、L5。其中El又可分為E1A、E1B，最重要的是E1A，其次是E1B。ElA的天然啟動子被結(jié)直腸癌特異性的啟動子替換，則此腺病毒只能在結(jié)直腸癌細胞中感染復制。溶瘤病毒(Oncolytic Virus，0V)，是指在腫瘤中特異表達和感染復制的病毒，有癌細胞IE向性，還能復制，但非結(jié)直 腸癌特異性。任何病毒(Adenovirus (腺病毒),SimplexHerpes Virus (HSV-1)(皰疫病毒)，Poxvirus (痘苗病毒))經(jīng)改造后均可構(gòu)成為0V。溶瘤病毒攜帶gene則為0V-gene,但Ad-gene即基因治療(其中Ad無祀向性,無復制倍增能力)。

發(fā)明內(nèi)容
在CTGVTJP ov-(gene)的構(gòu)建與應用中，OV(Oncolytic Virus)主要決定其靶向性，可用各式各樣的方法加以構(gòu)建，使它產(chǎn)生不同靶向性，本申請只涉及特異性靶向結(jié)直腸癌領域，目的是提供一種結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，CTGVT-CRC及其應用。Gene主要決定殺傷性，光OV的殺傷作用有限，故需加殺傷基因以增強其抗癌作用，構(gòu)成OV-(gene)，即CTGVT (GAOVT)，才能構(gòu)成很強的抗癌藥物，對CTGVT還需要更多改進，如將兩個CTGVT合用，其抗癌作用更強，?？砂岩浦残阅[瘤基因基本上消滅光。此外，如專門靶向癌癥干細胞，則有根除癌癥和徹底消滅癌癥的可能性。本發(fā)明具體采用如下技術方案
本發(fā)明是用結(jié)直腸癌特異性啟動子CEA替換ElA本身的天然啟動子，則此腺病毒變成了對結(jié)直腸癌特異性溶瘤腺病毒，可簡寫為(CRC) ^ncoAd,即一種靶向結(jié)直腸癌的OV載體，這是本專利的根本要求，此外，對ElB的表達也可改造，如缺失其中55KD，則為ElB (Δ 55), Δ為缺失之意，稱ZD55，也可寫成D55 ;Ε1Β有兩個基因，即19KD與55KD基因，如這兩個基因雙缺失則為ΛΕ1Β。Ad ·Ε1Β的天然啟動子也可用HIF(低氧誘導因子)取代，構(gòu)成Ad · HIF · Ε1Β，總的要求是構(gòu)成Ad · CEA · ElA · ^ ElB ( ^ Ε1Β，表示可對ElB進行的任意改造)。至于基因方面，對結(jié)直腸癌來說，或者加入結(jié)直腸癌特異性抑癌基因，如ST13，構(gòu)成Ad · CEA · ElA · D55_(ST13),如抗癌能力還不夠強，還可在同樣載體上加用抗癌作用很強但無專一性的抗癌基因如TRAIL，構(gòu)成Ad · CEA · ElA · D55-(TRAIL)與上述帶ST13的CTGVT-CRC合用，則可取得更好的抗癌效果。除TRAIL外，也可用IL-24、MnSOD, Smac,GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNA1、microRNA、Caspase 3,Bax 等等，使用兩個基因時，其中必有一個為結(jié)直腸特異性的抗癌基因，兩個基因可用如下方法構(gòu)建A.使用兩個重組子，分別各帶一個抗癌基因—個重組子中分別用兩個基因表達框表達；C.兩個基因用連接子連接起來。如用F · 2A或IETD四個氨基酸。在本發(fā)明的第一個方面，提供一種結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，即CTGVT-CRC，其特征在于，所述藥物是將結(jié)直腸癌特異的抗癌基因插入到結(jié)直腸癌特異的溶瘤病毒中而制成。所述溶瘤病毒為溶瘤腺病毒，早期基因El分為E1A、E1B，E1A的啟動子被結(jié)直腸癌特異性啟動子取代。根據(jù)本發(fā)明，所述結(jié)直腸癌特異性啟動子為結(jié)直腸癌特異性啟動子CEA或其它結(jié)直腸癌特異的啟動子。根據(jù)本發(fā)明，首先是結(jié)直腸癌特異的抗癌基因，如ST13，也可增加其它抗癌效果很好的抗癌基因，如 TRAIL、IL-24、MnS0D、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNA1、microRNA、Caspase 3、或Bax等，使用兩個基因，但其中必需有結(jié)直腸特異性基因如ST13。如果是兩個抗癌基因，相互之間可用不同方式聯(lián)合使用，所述方式為A、用兩個重組子；B、在一個重組子中帶有兩個基因的表達框；或C、兩個基因用聯(lián)接子連接起來加到一個載體中(即為一個表達)，連接子可為F · 2A或IETD四個氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，所述ElB可進行如下改造(1)、所述ElB的天然啟動子被HIF取代；(2)、刪除 ElB 中的 55KD ;(3)、刪除 ElB 中的兩個基因 19KD 和 55KD(AE1B)。本發(fā)明為結(jié)直腸癌特異性基因-病毒治療的藥物，具有很高靶向抗結(jié)直腸癌的治療作用，對正常細胞基本無影響。


圖1A顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的構(gòu)建原理框架圖。
圖1B 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α(Δ 24)的具體構(gòu)建過程。圖1C為Ad · (ST13) · CEA · ElA(Δ 24)的鑒定，用PCR，使用CEA啟動子兩端的引物得到424bp。圖1D為Ad· (ST13) · CEA · ElA ( Λ 24)的鑒定，用PCR，使用ST13兩端的引物得到IllObp0圖2A為帶雙基因CTGVT-CRC的構(gòu)建原理。圖2B為帶雙基因CTGVT-CRC的具體構(gòu)建過程。圖3A 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的劑量依賴性體體外(in vitro)抗癌效果。圖3B 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的時間依賴性體體外(in vitro)抗癌效果。圖4A顯示了各種物質(zhì)的抗癌作用，圖4B表示癌癥模式中小鼠的存活率。圖5為腺病毒基因組圖。
具體實施方案CTGVT-CRC是結(jié)直腸癌特異性的溶瘤腺病毒(CRC) -OncoAd攜帶結(jié)直腸癌特異性的抗癌基因(CRC)-gene, S卩(CRC) · OncoAd-(CRC)-gene。(CRC) · OncoAd的構(gòu)建，是將Ad · ElA的天然啟動子換成結(jié)直腸癌特異性啟動子 CEA(Carcinoma Embryonic Antigen),即 Ad · CEA · ElA,其中 ElA 也可改造，此專利ElA中Ad 923-946堿 基則被刪除24bp，靶向Rb缺失的腫瘤，至于Ad的E1B，任何改造均可(即μ ElB)，不改造亦可，μ E1B，可靶向癌癥細胞，但無特異性，Ad · CEA( Λ 24) · ElB0Ad· CEA· ElA · ElB所攜帶的基因為結(jié)直腸癌特異性抗癌基因(如ST13)等，其總的結(jié)果為Ad· (ST13) · CEA · ElA (Λ 24) · Ε1Β，基因在括號中表示此gene的表達框(Λ 24表示刪除24bp，非基因，故此括號不是表達框)。如抗癌還不理想，可選用抗癌作用較強的普通抗癌基因，如 TRAIL,則構(gòu)成 Ad · CEA · ElA · ElB- (TRAIL)，與上述帶 ST13 的 CTGVT-CRC 共用，這種合用也叫CTGVT-CRC。此外，除TRAIL外，還可用其他基因，如MnS0D、IL-24等。此外，兩基因也可用聯(lián)接子(Linker)連成(TRAIL-Linker_ST13)作為一個基因加入(CRC) · OncoAd中，則成為 Ad.CEA.ElA·^ E1B(TRAIL-Linker-ST13)。圖 2 則用 TRAIL 加強其殺傷作用，Ad · CEA · ElA · ElB(Λ 55)-(TRAIL-1ETD-ST13)。以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、CTGVT-CRC的構(gòu)建實施例實施例1 :圖1A p Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的構(gòu)建原理框架圖在腺病毒的ElA中刪除24bp (從923_946bp被刪除)，并用CEA啟動子代替其天然啟動子進行調(diào)控，在CEA之前加一個ST13的表達框(ST13)。圖1B =Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)構(gòu)建的具體步驟及其分子結(jié)構(gòu)圖。(I)將CEA啟動子插入到pAd · ElA(Δ 24)用XhoI和SnaB I雙酶切的質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒 pAd · CEA · ElA ( Λ 24)；(2)將pCA13_ST13(有商品)用EcoRV和HindIII雙酶切，切下ST13基因，連接到用同一酶切的 PMD18-T Simple-HCMV-MCS-polyA (SV40)載體上，構(gòu)成 pMD18_TSimpIe-HCMV-ST13-poIyA (SV40)(注pMD18_T Simple 有商品)。(3)將 pMD 18-T S imp Ie-HCMV-ST 13-po IyA (SV40)用 Sail 酶切，得至 Ij“ HCMV-ST13-po I yA(SV40) ” 表達框；將插入到 pAd .CEA ·Ε1Α(Δ24)用 XhoI 酶切的位點中，構(gòu)成 pAd .ST13 .CEA · ElA ( Λ 24) (pMD18_T Simple 有商品)，由于 Sail 和 XhoI 是同尾酶，二者可以連接，但連接后酶切位點消失。(4)將純化后的pAd · (ST13) · CEA · Ε1Α(Δ 24)質(zhì)粒與腺病毒大質(zhì)粒pBHGE3在HEK293 內(nèi)進行重組，構(gòu)建 Ad · (ST13) · CEA · ElA ( Λ 24)。(5)重組病毒構(gòu)建成功后，提取病毒DNA，鑒定構(gòu)建成功后使用。實施例2 Ad · CEA · ElA · ElB ( Λ 55) - (TRAIL-1ETD-ST13)的構(gòu)建(圖 2)圖2Α Ad · CEA · ElA · ElB ( Δ 55) - (TRAIL-1ETD-ST13)的構(gòu)建原理框架2B Ad · CEA · ElA · ElB ( Λ 55) - (TRAIL-1ETD-ST13)的具體構(gòu)建過程⑴pZD55用Xho1-SnaBl切開，將帶同樣酶切位點的CEA裝入其中，得到pZD55 · CEA promoter 中(9234bp)；(2)將9234bp質(zhì)粒用Xho1-MfeI切開與同樣酶切的pSW(6568bp)聯(lián)接，得到pSff *CEA ·Ε1Α ·Ε1Β(Δ55) (9033bp) (pSff 由已有商品的 pShuttle 用 Xho1-MfeI 切開，加入ElA · ElB 而成)；(3)將 pCA13 · TRAIL-1ETD-ST13 用 BglII 切開，裝入上 9033bp 質(zhì)粒，得至IjpSff · CEA · TRAIL-1ETD-ST13 即 pAd · CEA · ElA · ElB(Λ 55KD)-(TRAIL-1ETD-ST13)(11582bp)(前一括號內(nèi)的Δ表不刪除55KDa基因，非表達框,后一括號才為表達框)；(4)將純化的pSW·CEA·ElA·ElB(Λ55KD)-(TRAIL-1ETD-ST13)與腺病毒的大質(zhì)粒pBHGE3在Bj5183細菌中重組后，再轉(zhuǎn)到HEK293細胞中包裝，最后得到Ad .CEA ·Ε1Α ·Ε1Β(Δ 55KD) - (TRAIL-1ETD-ST13)病毒。(5)重組病毒構(gòu)建成功后，提取病毒DNA，鑒定構(gòu)建成功后使用。二、CTGVT-CRC的應用實施例實施例3 =Ad · (ST13) · CEA ·Ε1Α(Δ 24)的體外(invitro)抗癌效果(圖 3A 和圖3B)圖3A :劑量依賴性體外抗癌效果分別用下列不同劑量的病毒(M01 O. 1、1.0、5. 0)，感染0NYX-015、Ad · (EGFP) · CEA · ElA ( Λ 24)及 Ad · (ST13) · CEA · ElA ( Λ 24)。四天后，用MTT法檢測，結(jié)果為三次檢測平均數(shù)土SD。結(jié)果由圖3Α可見，抗癌藥物對不同結(jié)直腸癌細胞SW620、HT116、HT29則有較大的殺傷作用(圖3A)，而對所有藥物對正常細胞組QSG7701、WI38均無殺傷作用(圖3A)，對Hela的殺傷作用小于結(jié)直腸癌。圖3B :時間依賴性體外抗癌效果將癌細胞及正常細胞接種于24孔板(細胞數(shù)為5-10 X IO3)，當細胞生長至接近飽和時(如80%飽和)(飽和指細胞長滿了全孔)。對不同細胞包括正常對照細胞QSG7701、WI38及非CRC的對照細胞Hela (宮頸癌)、結(jié)直腸癌細胞SW620、HT116、HT29，分別用IOMOI不同病毒感染24、48、72、96小時后。結(jié)果由圖3B可見，抗癌藥物對不同結(jié)直腸癌細胞SW620、HT116、HT29則有較大的殺傷作用(圖3B)，而對所有藥物對正常細胞組QSG7701、WI38均無殺傷作用(圖3B)，對Hela的殺傷作用小于結(jié)直腸癌。實施例4 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的體內(nèi)(in vivo)抗癌效果(圖 4)選用4周齡的雌裸鼠(nude mice)，購自上海實驗動物中心，所有的實驗操作符合美國國家衛(wèi)生研究院關于實驗動物保護和使用的指導原則，使用3X106SW620結(jié)直腸癌細胞在150μ I DMEM培養(yǎng)中，皮下接種于每個小鼠的背側(cè)，等候腫瘤生長到80-150mm3，將小鼠隨機分成4組，PBS及其它藥物組，如0NYX-015，Ad · (AGFP) · CEA · ElA · D55，Ad· (ST13) · CEA · ElA (Λ 24)治療組，每天腫瘤內(nèi)注射治療一次，每次O. 5 X 108pfu連續(xù)4次，總共劑量各組均為2X 109pfu，然后每周用caliper尺測量腫瘤的長與寬，腫瘤的大小(V)按下面公式計算，V = 1/2長X寬2。結(jié)果如圖4A和圖4B所示，圖4A和圖4B顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA(Δ 24)的體內(nèi)(in vivo)抗癌能力，其中圖4A為各種物質(zhì)的抗癌作用，橫坐標為時間，縱坐標為腫瘤體積的大小。瘤體積越小，抗癌作用越強，其抗癌強弱次序:Ad· (ST13) *CEA*D55-(ST13)> Ad · (EGFP) · CEA · D55 > ONYX-015 > > PBS ；圖 4B 為小鼠的生存率，其中Ad · (ST13) .C EA · ElA ( Λ 24)組一個nude mice也不死，而PBS則基本很快死光，只剩一只小鼠未死。
權利要求
1.一種結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，即CTGVT-CRC(ColorectalCancer)，其特征在于，所述藥物是將結(jié)直腸癌特異的抗癌基因插入到結(jié)直腸癌特異性的溶瘤病毒中而制成。
2.如權利要求1所述的結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，其特征在于，所述結(jié)直腸癌特異性啟動子可為CEA，或其它結(jié)直腸癌特異的啟動子。
3.如權利要求1所述的結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，其特征在于，所述抗癌基因為結(jié)直腸癌特異的ST13。
4.如權利要求3所述的結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，如抗癌能力還不夠強，可在同一載體中加上其它如下抗癌基因與之共用如 TRAIL、IL-24、MnSOD, CD、Smac, GM-CSF, IFN、IL-12、p53、RNA1、microRNA、Caspase3、或 Baxο
5.如權利要求4所述的結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，用兩個抗癌基因時，可用不同方式聯(lián)合使用，其方式為 Α、用兩個重組子； B、在一個重組子中帶有兩個基因的表達框；或 C、兩個基因用聯(lián)接子連接起來加到一個載體中，連接子可為F·2Α或IETD四個氨基酸。
6.如權利要求1所述的結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，其特征在于，ElB作如下改造 (1)、所述ElB的天然啟動子被HIF取代； (2)中的 55KD ； ⑶、同時刪除ElB中的兩個基因19KD和55KD。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物。使用腺病毒，其早期基因E1A的天然啟動子被結(jié)直腸癌特異性啟動子CEA等取代，構(gòu)成一種溶瘤腺病毒，后者攜帶結(jié)直腸癌特異的抗癌基因ST13，如其抗癌作用還不夠強，不足以基本全部消滅癌癥，則可在同一載體上加上下述基因與之共用，如TRAIL、IL-24、MnSOD、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3及Bax，或采用將兩個基因用各種方案連接起來使用。本發(fā)明為結(jié)直腸癌特異性基因-病毒治療的藥物，具有很高靶向結(jié)直腸癌的治療作用，對正常細胞基本無影響。
文檔編號A61P35/00GK103055325SQ20111031943
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權日2011年10月20日
發(fā)明者劉新垣, 楊敏, 周秀梅, 謝國良 申請人:中國科學院上海生命科學研究院