根特異性表達AhMtan啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及根特異性表達啟動子，其克隆、功能驗證其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 栽培花生(AracMs hypogaea L.)屬于豆科作物，是世界重要的油料作物和經(jīng)濟 作物，2015年，我國花生產(chǎn)量達1670萬噸，居世界首位。花生的產(chǎn)量受到一些生物和非生物 脅迫的影響，尤其是地下害蟲、真菌、細(xì)菌等。近年來花生田地下害蟲發(fā)生獵獄，嚴(yán)重影響了 花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成花生大面積減產(chǎn)。
[0003] 地下害蟲是指生活史中某一階段危害植物近±表主莖、根、種子的雜食性害蟲，造 成植物根系受損，影響植物吸收水分和無機鹽，導(dǎo)致植物生長遲緩，甚至死亡。地下害蟲的 種類很多，主要有蛇蠟、峻姑、金針蟲等。其中蛇蠟是危害我國主要的地下害蟲，也是重要的 世界性害蟲，在印度、日本、美國等國都曾造成作物的減產(chǎn)，危害玉米、花生、甘馨、大豆、李 子等。
[0004] 蛇蠟是銷翅目金龜子科（Scarabaeoidae)幼蟲的總稱，W植食性蛇蠟危害最為廣 泛。一般造成的花生減產(chǎn)為1~2成，嚴(yán)重地塊達5成W上，甚至顆粒無收。山東新泰市農(nóng)業(yè)局 數(shù)據(jù)顯示，2008~2011年期間花生芙果平均受害率分別為15%、25%、28%、35%，呈逐年增 加趨勢，個別地塊因蛇蠟危害幾乎絕產(chǎn)，造成重大的經(jīng)濟損失。2008年，貴州高爾夫球場蛇 蠟暴發(fā)成災(zāi)，草坪草失綠、萎黨、根系壞死，導(dǎo)致草坪草大片枯死。
[0005] 目前，主要用物理防治、化學(xué)防治和生物防治=種手段防治地下害蟲蛇蠟。物理防 治主要是根據(jù)成蟲的趨光性，用黑光燈誘殺成蟲，但對幼蟲沒有什么效果。進行化學(xué)防治 時，使用巧喃丹、樂斯本、辛硫林、嚷蟲胺化學(xué)藥劑進行的防治，雖然毒殺蛇蠟的效果很好， 但同時也存在一定的弊端。首先，化學(xué)藥劑嚴(yán)重的污染環(huán)境;其次，有些殺蟲劑是高殘留的， 直接危害到人類的健康，尤其是施用的農(nóng)民，更有致殘甚至致死的情況。
[0006] 用于生物防治的主要有線蟲、病原真菌、病原細(xì)菌等。雖然對運些生物的防治有較 長的研究歷史，但并沒有廣泛的應(yīng)用。究其原因，一方面有些生物本身具有致病性，導(dǎo)致花 生染病;另一方面，如線蟲的批量生產(chǎn)、儲藏溫度、儲藏時間等都會對防治效果產(chǎn)生影響，病 原真菌及細(xì)菌中的大部分容易受到環(huán)境的影響等。為實現(xiàn)蛇蠟的綠色防控，急需開辟新的 防治途徑。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用分子手段培育抗蟲害花生新品種，已成為目前新的防 治途徑。
[0007] W生物防治、抗性作物品種及通過輪作控制害蟲生長環(huán)境為基礎(chǔ)的綜合害蟲防 治，已經(jīng)在世界范圍廣泛應(yīng)用，運主要歸功于抗性作物品種的發(fā)展，而生物技術(shù)在培育抗性 品種方面起到了重要的作用?？瓜x基因主要有=大類，植物源殺蟲基因（班豆膜蛋白酶抑制 劑(CpTI)基因，植物次生代謝物等）；動物源殺蟲基因（幾下質(zhì)酶基因，蜘蛛毒素基因等）；微 生物源殺蟲基因（蘇云金芽胞桿菌(Bt)殺蟲晶體蛋白基因，膽固醇氧化酶基因等）。國內(nèi)外 對抗蟲害轉(zhuǎn)基因花生的研究起步較晚，目前應(yīng)用的抗蟲基因也主要集中在微生物源殺蟲基 因。
[0008] 目前，組織特異性啟動子被廣泛應(yīng)用于基因工程。通過基因工程手段將組織特異 表達的啟動子與抗病基因相連，使抗病基因在特定部位定時、高效表達，達到防治病蟲害的 目的，為農(nóng)民提供更多的生態(tài)安全和安全管理策略的機會。
[0009] 植物根系是重要的地下器官，可吸收水分、無機鹽等W供植物正常生長所需;植物 根部的一些抗逆性基因表達的抗性蛋白等，會減緩一些生物及非生物脅迫對植物的影響， 使地上部分免受重金屬、干旱、致病菌等的危害?，F(xiàn)有技術(shù)中已克隆到一些對蛇蠟高毒力的 cry8類基因，而蛇蠟主要哨食花生的地下部分，所W尋找在整個花生生長季都高效表達的 根特異啟動子，驅(qū)動cry8類基因在花生根中高效、特異表達，達到防治蛇蠟的作用，不僅可 W實現(xiàn)了蛇蠟的綠色防控，而且為改良花生品質(zhì)、培育抗地下害蟲花生新品種提供重要分 子基礎(chǔ)。
[0010] 崔珊珊(崔姍姍，喬亞科，李桂蘭，等.黑芥子酶基因pyklO根特異啟動子在番茄中 的驗證[J].生物技術(shù)通報，2012( 11): 73-77.)等用PkylO-GUS融合的植物表達載體轉(zhuǎn)化番 茄后進行GUS染色后發(fā)現(xiàn)，pyklO啟動子驅(qū)動GUS基因在根部特異表達。Van曲an (Vau曲an SP,James DJ,Lindsey K,et al.Characterization of FaRBT,a near root-specific gene from strawberry(FragariaXananassa Duch.)and promoter activity analysis in homologous and heterologous hosts.J Exp Bot[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57(14): 3901-3910.)等發(fā)現(xiàn)草替化RB7啟動子為根特異啟動子，為作物基因 工程提供了一個有價值的根特異性啟動子。Cu(Cu R，ZhaoL，Zhang Y，et al. Isolation Of a maize beta-gulcosidase gene Pormoter[J]. Plant Cel !Reports ,2006,25:1157-1165.)等克隆了玉米的Zmglul啟動子，之后發(fā)現(xiàn)，該啟動子驅(qū)動GUS基因在玉米根中的表達 量最高。目前已克隆獲得很多根特異啟動子，其來源包括煙草、水稻、玉米、擬南芥、番茄、大 豆等，但是花生根特異啟動子報道比較罕見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明基于轉(zhuǎn)錄組測序構(gòu)建了基因數(shù)字表達譜的分析結(jié)果克隆花生根部特異表 達的啟動子，可使目的基因在根部特定表達，在使用方面無后顧之憂。
[0012] 本發(fā)明克隆花生根特異啟動子，并通過截短實驗確定啟動子核屯、區(qū)域，驗證各啟 動子的功能，為我國花生生物技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展奠定基礎(chǔ);為獲得雙價抗蛇蠟花生品種提供 高效、穩(wěn)定、特異表達的啟動子提供重要分子基礎(chǔ)。
[0013] 根特異性表達啟動子，其核巧酸序列如沈Q ID N02、沈Q ID N03或沈Q ID N04所 /J、- O
[0014] AhMtan基因，其核巧酸序列如沈Q ID NOl所示。
[0015] -種表達載體，含有上述特異表達啟動子。
[0016] 上述的表述載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0017] 所述的應(yīng)用，該表達載體中插入有抗蟲基因，將該表達載體轉(zhuǎn)入植物中，使其根中 表達該抗蟲基因，W防治地下害蟲。
[0018] 上述根特異性表達啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0019] 所述的應(yīng)用，為將含有上述根特異性表達啟動子和抗蟲基因的表達載體轉(zhuǎn)入植物 中，使其在種子或根尖表達該抗蟲基因，W防治地下害蟲。
[0020] 本發(fā)明克隆了一個花生5 甲硫腺巧/S-腺巧半脫氨酸核巧酶（5'-methyIthioadenosine/S-adenosy!homocysteine nucleosidase)基因上游1486bp的啟動 子序列，將其初步命名為AhMtan啟動子。對該啟動子序列進行生物信息學(xué)分析表明，該區(qū)段 含有12個R00TM0TIFTAP0X1元件，2個0SE2R00TN0DULE元件，二者都是與根特異表達相關(guān)的 順式作用元件。根據(jù)根特異表達順式作用元件的分布情況，構(gòu)建了 3個5'端系列缺失的植物 表達載體，轉(zhuǎn)化煙草后，將獲得的卡那抗性苗進行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pAhMtani247、 pAhM化n日23、pAhMtan23日載體的煙草根部均被染成藍色，而葉片無藍色斑點，證明AhM化n啟動 子為根特異啟動子，其最小核屯、區(qū)235bp的啟動子片段仍能指導(dǎo)報告基因在根部的特異表 達。S個啟動子的核巧酸序列見沈Q ID N02、沈Q ID N03、沈Q ID N04所示。
[0021] 通過基因工程手段將本發(fā)明的根特異表達的啟動子與抗病/抗蟲基因相連，使抗 病/抗蟲基因在根部定時、高效表達，達到防治病蟲害的目的，為農(nóng)民提供更多的生態(tài)安全 和安全管理策略的機會。通過上述報告基因轉(zhuǎn)入及在根部的特異表達結(jié)果說明，可W構(gòu)建 含有本發(fā)明的根特異表達啟動子的表達載體，再插入對地下害蟲高毒力的殺蟲基因，轉(zhuǎn)入 植株，使該殺蟲基因在根部特異表達，W防治地下害蟲，特別是對蛇蠟有高毒力cry8類基 因，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)入花生植株，使其在根部表達，防治蛇蠟。
【附圖說明】
[0022] 圖1 contig219746上游序列的PCR擴增結(jié)果
[0023] 圖2 AhMtan基因片段的擴增結(jié)果
[0024] M:DL2 000 DNA Marker; 1-5:PCR擴增產(chǎn)物;CK為相應(yīng)負(fù)對照
[0025] 圖3 AhM化n基因結(jié)構(gòu)示意圖
[00%]灰色陰影區(qū)域:外顯子化1-E5);空白區(qū)域：內(nèi)含子(11-14)
[0027]圖 4 AhMl:an gene 的 3'-racePCR結(jié)果 [002引圖5 AhM化n啟動子的生物信息學(xué)分析
[0029] 圖6 AhMtan根特異啟動子各截短示意圖
[0030] 圖7根特異啟動子植物表達載體構(gòu)建流程圖
[0031] 圖8植物表達載體pAhM化nl247(左圖KpAhMtan 523(中）、pAhM化n235(右圖）的 載體構(gòu)建圖1:各截短PCR片段;2:負(fù)對照;3:相應(yīng)的植物載體的雙酶切化ind III+BamH I); 4:p2300GUSplus化ind III+BamH 1);5:相應(yīng)的復(fù)制型載體的雙酶切化ind III+BamH I); M1:DM2000；M2:DM15000
[0032] 圖9 pAhMtanl247(l-2)、pAhMtan 523(3-4)、pAhMtan235(5-6)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 LBA4404 PCR擴增結(jié)果M:DL2000Marker; CK:相應(yīng)負(fù)對照；1、2:pAhMtanl247轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的 PCR擴增結(jié)果;3、4: pAhMtan 523轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR擴增結(jié)果；5、6: pAhM化n235轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的 PCR擴增結(jié)果，
[0033] 圖10煙草的遺傳轉(zhuǎn)化體系
[0034] A:葉盤;B:誘導(dǎo)芽;C:抗性芽伸長;D、E:抗性芽生根。
[0035] 圖11轉(zhuǎn)pAhM化nl 247煙草的GUS染色結(jié)果
[0036] 圖12轉(zhuǎn)pAhM化n 523煙草的GUS染色結(jié)果
[0037] 圖13轉(zhuǎn)pAhM化n235煙草的GUS染色結(jié)果
【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明。