馬鈴薯stu-miR9471及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明專利涉及一種microRNA(miRNA)及其應(yīng)用，具體地說(shuō)是馬鈴薯stu_miR9471及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約20 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNAt3HiiRNA基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過(guò)序列互補(bǔ)與特定革E基因的mRNA結(jié)合，通常在轉(zhuǎn)錄后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而對(duì)基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。
[0003]干旱脅迫是最主要的非生物脅迫之一，其對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量造成極其嚴(yán)重的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，地球上總土地面積的36%屬于缺水的干旱或半干早區(qū)域，我國(guó)干旱和半干早區(qū)域大約占國(guó)土地面積的1/2。即使在半濕潤(rùn)和濕潤(rùn)的農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)，也通常會(huì)受到季節(jié)性和周期性的旱災(zāi)侵襲。干旱脅迫對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量、質(zhì)量的影響相當(dāng)于其余自然災(zāi)害之和，其危害性在各種自然逆境脅迫中占首位，僅次于病蟲(chóng)害對(duì)作物造成的損失。解決干旱問(wèn)題的途徑，除了節(jié)水灌溉來(lái)提高水分的利用效率之外，就是培育節(jié)水抗旱的新品種以提高作物自身抵御干旱的能力。要達(dá)到這一目的，必須了解作物響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制。因此，對(duì)作物抗旱機(jī)理的研究以探索提高作物抗旱能力是各國(guó)科學(xué)家關(guān)注的研究熱點(diǎn)問(wèn)題。尤其是近年來(lái)對(duì)擬南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鑒定、克隆出大量耐旱相關(guān)的基因，已研究清楚了一些耐鹽相關(guān)的基因的調(diào)控模式。將抗旱、耐鹽基因通過(guò)基因工程的手段整合到目標(biāo)植物基因組中或有目的的抑制或誘導(dǎo)一些干旱相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植株，開(kāi)辟了培育高度抗旱性作物新品種的新途徑。隨著對(duì)植物抗旱機(jī)理的了解以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)獲得抗旱的育種材料或遺傳改良的新品種，已成為抗旱品種培育最具發(fā)展?jié)摿Φ姆较颉?br>[0004]谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一種在植物中普遍存在并參與多種細(xì)胞活動(dòng)的功能蛋白，具有參與植物次生代謝、解毒以及免受氧化損傷等重要作用。前人的的研究表明植物GSTs基因在植物響應(yīng)干旱、脫水、高鹽、冷害、輻射以及ABA等脅迫中發(fā)揮著重要的作用。例如，George等(2010)利用耐干旱的棻荑牧豆樹(shù)作為模式植物體系開(kāi)發(fā)非生物脅迫耐受相關(guān)基因的功能。通過(guò)構(gòu)建棻荑牧豆樹(shù)葉片cDNA文庫(kù)，鑒定出三個(gè)由生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。其中PjGSTUl被定位于線粒體的GST基因之一，并可以提高轉(zhuǎn)基因煙草干旱耐受能力。轉(zhuǎn)PjGSTUl基因的煙草株系在15% PEG脅迫下與非轉(zhuǎn)基因煙草相比起生長(zhǎng)狀態(tài)良好。GFP融合載體表明PjGSTUl蛋白也被定位于轉(zhuǎn)基因煙草的線粒體中表達(dá)。PjGSTUl的過(guò)氧化物酶活性和定位于線粒體表明該基因?qū)τ诨钚匝跗鹎宄饔?。GSTs可以清除植物在干旱脅迫下產(chǎn)生的過(guò)量的活性氧，進(jìn)而提高植物的干旱耐受能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供馬鈴薯stu-miR9471的前體序列、stu-miR9471調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)以研究靶基因功能的應(yīng)用、stu-miR9471調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品種的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
馬鈴薯stu-miR9471的前體序列如下(本發(fā)明中所列核苷酸序列均為5,—3'):uggucacucaacuauuauuaucuuagaaagucgucuuucuucuugauucagauuuuuucaacaaagaaauugacuuucugauauaauaacuguuuaguugagugucgauaugag(序列表SEQ ID NO: I) 0
[0007]馬鈴薯stu_miR9471的前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)式為:自5'端7bp_9bp和67bp_69bp形成環(huán)狀，自5'端19bp_22bp和55bp_57bp形成環(huán)狀，自5'端27bp_29bp和47bp_50bp形成環(huán)狀，自5'端32bp-44bp形成環(huán)狀;其他堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0008]編碼上述馬鈴薯stuiiR9471的前體序列的DNA序列為:tggtcactcaactattattatcttagaaagtcgtctttcttcttgattcagattttttcaacaaagaaattgactttctgatataataactgtttagttgagtgtcgatatgag(序列表SEQ ID NO:2)。
[0009]上述馬鈴薯stu_miR9471的成熟序列如下:acuuucugauauaauaacu(序列表SEQ IDNO: 3)。8加-1^1?9471的成熟序列是前體序列自5'端32bp_52bp的一段RNA序列。
[0010]上述馬鈴薯stu_miR9471的前體序列在研究基因功能中的應(yīng)用，stu_miR9471特異性抑制靶基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(PGSC0003DMG401008955)的表達(dá)(降解靶基因mRNA)，所述谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因序列如序列表SEQ ID NO:4所示。
[0011]上述馬鈴薯stu-miR9471的前體序列在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物為馬鈴薯(Solanum tuberosum)0
[0013]優(yōu)選地，在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO:1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO:1所述miRNA的表達(dá)，培育出具有高抗旱能力的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。
[0014]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的技術(shù)效果在于:本發(fā)明提供了一種馬鈴薯Stu-miR9471及其應(yīng)用。RLMHACE測(cè)檢結(jié)果表明stu-miR9471調(diào)控谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(PGSC0003DMG401008955)，可用于研究該谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的功能，即通過(guò)過(guò)表達(dá)或缺失表達(dá)該谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶時(shí)研究植物的生理生化變化。熒光定量PCR測(cè)檢結(jié)果表明，stu-miR9471的表達(dá)受干旱脅迫調(diào)控，說(shuō)明其在馬鈴薯適應(yīng)干旱脅迫中起著重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，對(duì)提高馬鈴薯產(chǎn)量具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是本發(fā)明馬鈴薯stu-miR9471的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0016]圖2是本發(fā)明馬鈴薯靶基因降解電泳圖。
[0017]圖3是本發(fā)明馬鈴薯靶基因降解組測(cè)序圖。
[0018]圖4是本發(fā)明馬鈴薯stu-miR9471的熒光定量PCR圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的實(shí)施方式僅僅是示例性的，并且本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方式。
[0020]在此，還需要說(shuō)明的是，為了避免因不必要的細(xì)節(jié)而模糊了本發(fā)明，以下實(shí)施例僅僅示出了與根據(jù)本發(fā)明的方案密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)和/或處理步驟，而省略了關(guān)系不大的其他細(xì)節(jié)。并且，本發(fā)明所使用的各種原料以及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)直接獲得;所有定量試驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0021]實(shí)施例一:stu-miR9471和靶基因序列的確認(rèn)
馬鈴薯stu-miR9471的前體序列如下:uggucacucaacuauuauuaucuuagaaagucgucuuucuucuugauuc
agauuuuuucaacaaagaaauugacuuucugauauaauaacuguuuaguugagugucgauaugag (序列表SEQ ID NO:1)。
[0022]如附圖1所示，馬鈴薯stu-miR9471的前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)式為:自5'端7bp_9bp和67bp_69bp形成環(huán)狀，自 5'端 19bp_22bp和55bp_57bp形成環(huán)狀，自 5'端27bp_29bp和47bp-50bp形成環(huán)狀，自5'端32bp-44bp形成環(huán)狀;其他堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0023]編碼上述馬鈴薯stuiiR9471的前體序列的DNA序列為:tggtcactcaactattattatcttagaaagtcgtctttcttcttgattcagattttttcaacaaagaaattgactttctgatataataactgtttagttgagtgtcgatatgag(序列表SEQ ID NO:2)。
[0024]上述馬鈴薯stu_miR9471的成熟序列如下:acuuucugauauaauaacu(序列表SEQ IDNO: 3)。8加-1^1?9471的成熟序列是前體序列自5'端32bp_52bp的一段RNA序列。
[0025]上述馬鈴薯stu-miR9471的前體序列在研究基因功能中的應(yīng)用，stu-miR9471抑制靶基因谷胱