一種水稻花粉強特異表達啟動子OsPoll3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術和作物基因工程技術領域。具體而言，本發(fā)明設及一種水稻 花粉強特異表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在作物基因工程中驅動目標基因在花粉中 特異表達，從而創(chuàng)造雄性不育材料，或者進行基因剔除，防止外源基因通過花粉污染其他非 轉基因（作物)植物，提高轉基因作物的生物安全性。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國乃至全世界最主要的食品來源之一，我國目前有一半W上的人口 W稻 米為主食，人均攝入熱量的30%、蛋白質的19%均來源于稻米。隨著人民生活水平的提高， 稻米在糧食作物中的比重將持續(xù)增長。水稻在保障我國糧食安全中擔當重要角色，雜交育 種對于提高水稻產量非常重要。水稻雜交育種常用=系法及兩系法，運些方法利用的是花 粉特異性發(fā)育性狀。
[0003] 目前水稻S系法制種主要利用核一質互作雄性不育系、保持系和恢復系實現(xiàn)S系 配套實現(xiàn)雜交育種，運種方法不僅種子生產程序比較復雜，選育新組合的周期長，制種成本 高，而且種質資源利用有限，在一定程度上限制了雜交水稻產量的進一步提高。而現(xiàn)在廣泛 使用的兩系法制種體系即光溫敏不育系實現(xiàn)了一系兩用，簡化了繁殖不育系的技術環(huán)節(jié)。 但光溫敏核不育系容易受光周期和溫度變化的影響，育性不穩(wěn)定，影響制種純度，具有一定 的制種風險，特別是當前全球氣候異常影響了水稻光溫敏不育系的推廣和利用。因此，培育 不受環(huán)境影響且可W自主繁殖的穩(wěn)定不育系已成為兩系雜交技術廣泛應用的技術瓶頸。
[0004] 水稻中廣泛存在的核雄性不育材料，不育性遺傳性狀穩(wěn)定，受外界環(huán)境條件影響 小，在雜交育種和農業(yè)生產上都具有十分重要的意義?；ǚ厶禺悊幼颖粡V泛用于創(chuàng)造核 雄性不育植物。而具有強特異性的啟動子往往是可遇而不可求的，目前還沒有任何一種方 式能夠根據需求來構建或直接篩選出相應啟動子序列。目前發(fā)現(xiàn)的花粉特異啟動子有煙草 花特異啟動子TA29，番茄花粉特異啟動子Ia巧2，水稻花粉特異RASgene啟動子、玉米ZmC5基 因啟動子、ZM13啟動子等等，花粉特異啟動子-barnase (RNase)載體已經用來轉化煙草、油 菜、水稻、玉米等，通過基因工程獲得雄性不育系。
[0005] 但是，僅僅上面幾種可用的花粉啟動子在生產和研究過程中是遠遠不夠的。因此， 本發(fā)明希望能夠再找到一種在花粉中具有強特異性表達性狀的啟動子。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種驅動外源基因在水稻花粉強特異表達的啟動子、獲得含 有該啟動子序列的轉化子W及該啟動子的應用。其中，本文中所設及的"作物"是指禾本科 作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻花粉特異表達啟動子，所述水稻 花粉特異表達啟動子包含：
[000引（a)序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列;或者
[0009] (b)序列表中SEQ ID NO:2中所示的核巧酸序列;或者
[0010] (C)在序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列中添加、取代或缺失一個或多個 核巧酸后所獲得的核巧酸序列;或者
[0011] (d)在序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列中添加、取代或缺失一個或多個 核巧酸后所獲得的核巧酸序列;或者
[0012] (e)與序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列互補的核巧酸序列;或者
[0013] (f)與序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列互補的核巧酸序列;或者
[0014] (g)與序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸 序列;或者
[001引化)與序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸 序列。
[0016]本領域技術人員可W預期，上述(C)-化）中的水稻花粉強特異表達啟動子序列與 序列表中SEQ ID No: 1或2所示序列具有相同功能，即驅動目標基因在作物花粉中特異表達 功能的序列，因此，其也包含在本發(fā)明的范圍內。序列表中SEQ ID No:l或2所示的DNA序列 為來源于日本晴水稻（Oirza sativa L CV.Ni卵onbare)的序列，本文中稱為Os化113或啟 動子Os化113。具體而言，本申請的發(fā)明人從日本晴水稻（Oryza sativa L CV.化卵onbare) 中分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1和2中所示的DNA序列，并且發(fā)現(xiàn)該DNA序列具有驅 動目標基因在水稻花粉強特異表達的作用。
[0017] 需要說明的是，在序列表中，SEQ ID No: 1中所示的DNA序列與SEQ ID No:2所示的 啟動子的區(qū)別主要在于SEQ ID No: 1中所示的DNA序列在開頭部分多了 "Ctgatgtggt c1:aaccccga gt"共計22bp，在結尾部分多了 "gtgaagac cctgacgggg aaga"共計22bp，運兩 部分為獲得啟動子過程中使用的引物的留存序列或其互補序列。而SEQ ID No:2所示的DNA 序列為純獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到的啟動子既可W指 SEQ ID No:l，也可W指SEQ ID No:2,二者可W發(fā)揮相同的作用。即便本領域技術人員在本 發(fā)明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā)明的保護范圍之內。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的水稻花粉強特異表達啟動子的DNA序列由序列表中SEQ ID No: 1或2所示的序列，即OsPo 113或啟動子Os化113構成。
[0019] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻花粉強特異表達啟動子的表達盒。
[0020] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的水稻 花粉強特異表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述水稻花粉強特異表達啟動子連接于 待表達的基因序列的上游；優(yōu)選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為 pCAMBIA1391-〇sPoll3,該重組表達載體為將沈Q ID No:l所示的序列即Os化113或啟動子 0sPoll3構建于PCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1391-〇sPoll3。
[0021] 或者待表達基因可W為任何對作物的花粉性狀具有改善能力的基因。通過本發(fā)明 的啟動子驅動該基因在花粉中強特異性地集中表達，從而實現(xiàn)改善水稻花粉相應性狀的功 能。
[0022] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻花粉強特異表達啟動子在培育轉基因作物中的應 用。所述應用包括將本發(fā)明提供的上述水稻花粉特異表達啟動子連接于載體的待表達的基 因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標基因之前），從而構建重組表達載體， 將所述重組表達載體轉化到作物細胞、組織或器官中進行培育。
[0023] 并且優(yōu)選地，所述應用可W用于改良作物生長特性，所述作物為禾本科作物，例如 水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0024] 更優(yōu)選地，所述應用包括：
[0025] 利用序列表SEQ ID No.3和4中的引物，W水稻品種日本晴DNA為模板，擴增所述的 水稻花粉強特異表達啟動子Os化113;
[0026] 回收目的片段，將其連接到預定載體上，按照熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞后， 使感受態(tài)細胞激活，進而將目的片段轉入到激活的感受態(tài)細胞中，然后，經菌落PCR篩選獲 得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用SaU和EcoRI進行雙酶切驗證，驗證正確的克隆 即為所要獲得的水稻花粉強特異表達啟動子Os化113;
[0027] 從上面獲得的陽性克隆中提取質粒，用Sail和Eco