一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克隆橡膠樹乳管特異性強啟動子PHEV2.1，與天然橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶HbHMGR1基因連接構(gòu)建植物表達載體，轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明從橡膠樹優(yōu)良品種材料中克隆PHEV2.1和HbHMGR1基因，構(gòu)建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301?PHEV2.1?HbHMGR1，轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，得到了橡膠樹轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株，用GUS染色、PCR和反向PCR證明得到了轉(zhuǎn)基因植株，用熒光定量PCR技術(shù)檢測證明HbHMGR1基因在橡膠樹轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株中表達量顯著提高，為用基因工程方法提高橡膠產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用乳管特異性啟動子獲 得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹是重要的熱帶經(jīng)濟作物，其產(chǎn)生的天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資。近年來，隨 著國民經(jīng)濟和國防事業(yè)的快速發(fā)展，我國天然橡膠的自給率逐年下降，進口依賴度不斷攀 升(王少明等，2011)。然而橡膠樹適種區(qū)域有限，擴大種植面積增加橡膠產(chǎn)量的潛力極小， 所以開展橡膠樹品種改良、提高橡膠單產(chǎn)的研究更為迫切。天然橡膠生物合成是影響橡膠 樹膠乳產(chǎn)量的重要因素(吳春太等，2009)，改進其調(diào)控機理有可能對提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量 產(chǎn)生積極作用。
[0003] 橡膠蛋白（hevein)是膠乳的主要成分，它在乳管中高表達，占可溶性蛋白質(zhì)的 50%~70 % (Pari js等，1991 ;Montoro等，2008)。橡膠蛋白早在上世紀60年代便已被認識 (Acher等，1960)，然而在隨后的40年間，除Broekaert等（1990)克隆過一個編碼橡膠蛋白的 cDNA序列(GenBank M36986)外，有關(guān)編碼橡膠蛋白的基因及啟動子的研究鮮有報道。2005 年，Pujade-Renaud等利用文庫篩選法，從橡膠樹基因組DNA中分離得到5個編碼橡膠蛋白 (hevein)的基因，首次證明橡膠蛋白是由一個小基因家族編碼的。Pujade-Renaud等還克隆 了HEV1.1啟動子(PHevl. 1)和HEV2.1啟動子(PHEV2.1)，并融合報告基因 uidA轉(zhuǎn)化水稻，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，兩個啟動子在轉(zhuǎn)基因水稻中均能驅(qū)動uidA基因的表達，而序列最長的PHEV2.1功能 最強，它驅(qū)動uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平地表達，并且機械損傷和真菌感 染能誘導(dǎo)其驅(qū)動uidA基因的上調(diào)表達。2008年，Motoro等利用PHEV2.1融合報告基因 uidA， 轉(zhuǎn)化橡膠樹并分析其表達特性，結(jié)果表明，PHEV2.1驅(qū)動ui dA基因在根、莖、葉的乳管中特異 性強表達，印證了Archer等（1969)關(guān)于橡膠蛋白在乳管細胞中是特異性表達的報道;他們 還發(fā)現(xiàn)，PHEV2.1可以受光誘導(dǎo)，驅(qū)動uidA在葉片所有細胞類型中表達。
[0004] 天然橡膠生物合成是一種典型的類異戊二烯途徑的次生代謝(段翠芳等，2004)。 HbHMGRl是橡膠樹特有的，在非產(chǎn)膠植物中沒有相應(yīng)基因成員，它在乳管中特異性表達，它 的酶是類異戊二稀生物合成的關(guān)鍵酶(Chye等，1992;Venkatachalam等，2009)。橡膠樹3-輕 基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HbHMGR)是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性遠 遠低于其它參與該途徑的酶，約為其它酶活性的1/1000(1^1^11，1969)。〇^6等（1991，1992) 發(fā)現(xiàn)在橡膠中，存在HMGR的小的基因家族，它包含3個基因 hmgl、hmg2和hmgSAmgl (即 HbHMGRl)是橡膠樹特有的，在非產(chǎn)膠植物中沒有相應(yīng)基因成員，它主要在乳管中特異性表 達，并由乙烯誘導(dǎo)，其編碼的酶被認為參與橡膠生物合成。hmg3的表達不受乙烯影響，它作 為"看家基因"在組織中呈組成型表達，無細胞類型特異性。hmg2和hmg3不參與橡膠生物合 成，它們編碼的酶參與看家性質(zhì)的類異戊二烯的生物合成（如激素、光合色素、線粒體電子 傳遞鏈組分、多萜醇等）。Schaller等（1995)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)橡膠樹HbHMGRl基因煙草的留醇含量比 對照提高了 6倍。Dong等(2013)也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)構(gòu)巢曲霉HMGR的部分銀膠菊表現(xiàn)出膠乳產(chǎn)量的增 加，有力地證明了 HMGR是類異戊二烯合成途徑的關(guān)鍵限速酶。
[0005] 盡管有關(guān)啟動子PHEV2.1和HbHMGRl基因的研究分別已有報道，但尚未見到有利用 PHEV2.1構(gòu)建HbHMGRl的乳管特異性表達載體轉(zhuǎn)化橡膠樹的研究。本發(fā)明方法利用PHEV2.1 構(gòu)建HbHMGRl的乳管特異性表達載體，并轉(zhuǎn)化橡膠樹，得到轉(zhuǎn)基因植株，用熒光定量PCR技術(shù) 檢測驗證HbHMGRl基因在轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株中的表達，這對于用基因工程方法進 行橡膠樹遺傳改良、提高橡膠產(chǎn)量有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，為 用基因工程方法進行橡膠樹遺傳改良、提高橡膠產(chǎn)量提供了新的途徑。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株 的方法包括如下八個步驟：
[0008] 步驟1.天然橡膠生物合成關(guān)鍵限速酶基因 HbHMGRl克隆
[0009] 1.1橡膠樹總RNA提取和cDNA第一條鏈合成
[0010] 橡膠樹膠乳總RNA提取用Trizol法，按照Revert Aid TM cDNA第一鏈合成試劑盒 說明書合成cDNA第一條鏈，-20°C保存待用。
[0011] 1.2HbHMGRl 基因 cDNA 鏈合成
[0012] 依據(jù)NCBI登錄號X54659.1的HbHMGRl基因，利用Primer 5.0設(shè)計1對特異引物用以 擴增HbHMGRl基因 cNDA全長（1728bp):
[0013] 上游引物 H1F: 5 ' -GCTCTAGAATGGACACCACCGGCC-3 ；
[0014] 下游引物 H1R: 5，-CCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3
[0015]其中，在上游引物5'端加上Xba頂每切位點(TCTAGA)，下游引物5'端加上Xmal酶切 位點(CCCGGG)。以橡膠樹膠乳cDNA為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)過電泳、膠回收、純化之后 利用TA克隆連接到pMD 19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過菌落PCR檢測后，挑選陽性克隆的 菌洛進彳丁基因測序。
[0016] 1.3HbHMGRl 基因點突變
[0017] 根據(jù)HbHMGRl基因序列(NCBI登錄號X54659.1)設(shè)計特異引物，用橡膠樹膠乳作材 料，通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆HbHMGRl基因，目的片段長1728bp，把X54659.1的1031位堿基由G點 突變?yōu)锳，使得該Pst I酶切位點消失。
[0018] 步驟2.橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1克隆
[0019] 2.1橡膠樹葉片基因組DNA的提取
[0020] 用改良的CTAB法從橡膠樹葉片小量提取基因組DNA，具體步驟如下：
[0021] ⑴稱取0.2g橡膠樹的新鮮葉片于液氮預(yù)冷的研缽中，迅速將其研磨成粉末，轉(zhuǎn)入 2ml冰上預(yù)冷的離心管中。
[0022]⑵在盛有樣品的離心管中加入1ml的6 5 °C預(yù)熱的2 X CTAB裂解液(裂解液用前加入 3 %的β-巰基乙醇），渦旋混勻。
[0023] ⑶轉(zhuǎn)移離心管至65°C水浴鍋中恒溫水浴30min，期間每隔5~6min輕輕顛倒混勻10 次，使CTAB充分裂解細胞。
[0024] ⑷取出離心管，于高速離心機中25°C、12000rpm、離心5min。
[0025] (5)輕輕取出離心管，小心轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml離心管。加入等體積的氯仿：異戊 醇(24:1)，輕輕顛倒混勾數(shù)次，4°C、12000rpm離心5min。
[0026] (6)輕輕取出離心管，轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml離心管，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1)，輕輕顛倒混勾數(shù)次，4°C、12000rpm離心5min。
[0027] (7)取上清液，再加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，條件同（5)。
[0028] (8)取上清液至新的2ml離心管，加入1/10體積3M預(yù)冷的NaAc，輕輕混勻，然后加入 等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，置于_20°C冰箱中充分沉淀30min。
[0029] (9)取出離心管，4°C、12000rpm離心10min，棄上清液，用70 %的乙醇洗滌沉淀物兩 次并轉(zhuǎn)入1.5ml小管，盡可能地吸干管里的酒精。
[0030] (10)將沉淀物置于超凈工作臺上靜置lOmin，然后用?οομL的無菌雙蒸水溶解沉淀 物。
[0031] (11)于上面提取的DNA中加入2.5以1(1〇11^/1111)的1?^86六，在37°(：水浴鍋中水浴酶解1 ~2h〇
[0032] (12)酶解期間，每30min取5μ1進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA是否徹底消化。
[0033] (13)加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1)，輕輕顛倒翻轉(zhuǎn)50次后，在4°C、12000rpm離心 10min〇
[0034] (14)取上清液，加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)，混勻，加入2倍體積的無水乙醇，上 下翻轉(zhuǎn)混勾5min后，在_20°C沉淀lh。
[0035] (15)在4°C、12000rpm離心10min。
[0036] (16)用70 %的酒精洗滌沉淀物2次。
[0037] (17)將沉淀物置于超凈工作臺上靜置10min，用50μ1的無菌雙蒸水溶解沉淀物。
[0038] (18)取2μ1的DNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度。
[0039] 2.2橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1克隆
[0040] 根據(jù)HEV2.1序列(NCBI登錄號:ΑΥ247789.1)，截取起始密碼子前的1830bp堿基序 列，用Primer5 . 0設(shè)計一對特異性引物PHF1和PHR1，上游引物為？狀1:5'_ CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3 '，下游引物為PHR1 : 5 ' -TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3 '，下劃線部分為在引物兩端引入的酶切 位點Hi nd III和Ps 11酶切位點。以2.1中提取的基因組DNA為模板，以PHF1和PHR1為引物進行 PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾"A"后，克隆到pMD19-T vecor上，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌Trans5a，經(jīng)12~16h的培養(yǎng)后，挑取單菌落進行菌液PCR，選取PCR檢測為陽性的菌落 送往測序公司進行測序。測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTN工具進行序列同源性分析。
[0041 ] 步驟3.構(gòu)建HbHMGRl基因的乳管特異性植物表達載體PCAMBIA2301-PHEV2.1- HbHMGRl
[0042]先利用Xbal和Xma I分別對pCAMBIA3301 和pCAMBIA2301-HbHMGRl進行雙酶切，酶 切產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠回收PCAMBIA3301的大片段和PCAMBIA2301-HbHMGRl的小片段(HbHMGRl基因），將兩片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a， 過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌落PCR檢測，提取陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGRl;再用 Hindlll和PstI分別對pCAMBIA3301-HbHMGRl和pMD19-T-PHEV2.1 進行雙酶切，電泳結(jié)束后， 分別對pCAMBI A3301 -HbHMGR 1的大片段和pMD 19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)進行切膠回 收，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌液 PCR，提取陽性重組質(zhì)粒，并用HindΙΠ、Pst I和Xma I對其進行酶切鑒定，確認得到的陽性重 組質(zhì)粒為？04冊143301-?冊￥2.1-肋腿61?1;最后用!^11(1111和乂1^1將？冊￥2.1-肋腿61?1重組 片段從pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hindm和 父111 &1間，得到植物表達載體口0崖8142301-?冊￥2.1-池腿61?1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進 行菌落PCR，提取陽性重組質(zhì)粒，用Hindm和Xma I進行酶切鑒定，確認HbHMGRl乳管特異性 植物表達載體構(gòu)建成功。
[0043]步驟4.橡膠樹易碎胚性愈傷組織的培養(yǎng)
[0044]取橡膠樹單核靠邊期花蕾，先用流水沖洗后，在超凈臺上再用75%乙醇表面消毒 lmin，再以0.1 % (w/v)HgCh溶液浸泡消毒lOmin，最后用無菌水沖洗3次，每次3min。剝出花 蕾中的花藥，接種到花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ml)[改良的MS培養(yǎng)基并添加2. Omg/L 2,4-D、1.0mg/L NAA、1.0mg/L KT、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5%(￥八)(^、2.(^/1植物凝膠 (phytagel，Sigma)]，培養(yǎng)50d，誘導(dǎo)出初生愈傷組織后，再將生長狀態(tài)良好的初生愈傷組織 轉(zhuǎn)入到新鮮的Ml上繼代培養(yǎng)，每10天繼代一次。生長良好的花藥初生愈傷組織經(jīng)多次選擇 繼代，直至誘導(dǎo)出顏色鮮黃、結(jié)構(gòu)疏松、顆粒狀的易碎胚性愈傷組織。以這些易碎胚性愈傷 組織為轉(zhuǎn)化受體材料。易碎胚性愈傷組織置于高鈣離子濃度（11.Omm 〇l/L)的繼代培養(yǎng)基中 繼代培養(yǎng)，每隔20d繼代1次，經(jīng)過5次以上的繼代后，篩選出適合長期繼代培養(yǎng)的易碎胚性 愈傷組織。橡膠樹胚性愈傷組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基及成分見表1。
[0045]步驟5.橡膠樹繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化
[0046] 根據(jù)β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase，⑶S)基因（uidA)瞬時表達率的多少和細胞 存活率的高低，結(jié)合影響根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，相關(guān)因素包括預(yù)培養(yǎng)時間、菌液 濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度，設(shè)計實驗，確定橡膠樹連續(xù) 繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件；
[0047]以橡膠樹易碎胚性愈傷組織在含有Kan濃度梯度的繼代增殖培養(yǎng)基中的生長速率 為指標，測定易碎胚性愈傷組織對卡那霉素(Kan)敏感濃度為75~100mg/L，用于抗性愈傷 組織的篩選。
[0048] 5.1根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備方法
[0049] (1)從-80 °C冰箱中取1管保存的EHA105菌種于冰上溶解。
[0050] (2)用接種環(huán)蘸取一點菌液，然后于含有75mg/L利福平和75mg/L鏈霉素的LB固體 培養(yǎng)基上劃平板，培養(yǎng)36~48h。
[00511 (3)挑取一個單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基(含有75mg/L利福平和75mg/L鏈霉 素），28°C、200rpm 培養(yǎng)16~24h。
[0052] (4)將(3)中的2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到100ml LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)至菌液 濃度為0D600約為0.5左右。
[0053] (5)將培養(yǎng)物分裝到兩個50ml的離心管中，置于冰上冰浴30min，4 °C、5000rpm離心 10min〇
[0054] (6)棄上清液，收集菌體，用10ml預(yù)冷的0.15mol/L NaCl懸浮，4°C、5000rpm離心 5min，收集菌體。
[0055] (7)再懸浮菌體于10ml預(yù)冷的20mmol/L CaCl2溶液中，再次同上離心并收集菌體。
[0056] (8)用lml預(yù)冷的含有10%甘油的20mmol/L CaCl2溶液懸浮菌體，然后按照50μ1/ 管分裝，液氮速凍后置于-80 °C超低溫冰箱中備用。
[0057] 5.2植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0058]根癌農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化方法采用凍融法。取1管農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞置于 冰上溶解，在菌液中加入〇. 5yg重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl，輕輕震蕩混勻，冰 浴30min;液氮中速凍lmin，再于37°C溫育5min;取出樣品，迅速置于冰上冷卻5min;加入lml 無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于搖床中28°C溫和振蕩（lOOrpm)培養(yǎng)4h; 5000rpm離心5min，收 集菌體，懸浮于300μ1 LB液體培養(yǎng)基中；將轉(zhuǎn)化細胞在含有50mg/L利福平(Rif)、50mg/L鏈 霉素（Str)和50mg/L卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基上涂平板，28 °C培養(yǎng)2~3d;菌落長出 后，用特異引物PHF1和H1R對單菌落進行菌落PCR擴增，選取PCR檢測為陽性的菌株制備工程 菌，以作后續(xù)侵染。
[0059] 5.3花藥易碎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化及GUS組織化學(xué)染色
[0060] 易碎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化，對愈傷組織進行侵染、共培養(yǎng)、抑菌和篩選。將篩選得 至|J的抗性愈傷組織進行GUS組織化學(xué)染色，選取⑶S染色陽性的抗性愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng) 增殖，形成愈傷組織系，以便用于后續(xù)的分子檢測和體細胞胚發(fā)生。
[0061] 步驟6.獲得胚狀體和再生植株
[0062]共培養(yǎng)結(jié)束后，將橡膠樹易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中進行抑菌處理，18 天后，轉(zhuǎn)移到卡那霉素為75~100mg/L的篩選培養(yǎng)基中，經(jīng)過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗 性愈傷組織，把經(jīng)過⑶S染色為陽性的愈傷組織增殖1~2個月后誘導(dǎo)胚狀體和植株再生，獲 得抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織誘導(dǎo)出胚狀體和轉(zhuǎn)化植株。
[0063] 橡膠樹組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分見表1。
[0064] 表1:橡膠樹組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分
[0065]
[0066] 橡膠樹愈傷組織培養(yǎng)培養(yǎng)基為經(jīng)改良的MS培養(yǎng)基（改良成份為MgS〇4 · 7H2〇 500mg/L，KH2P〇4 400mg/L，CaCl2 250mg/L，MnS〇4.H20 35mg/L，CuS〇4.5H20 0.2mg/L)，再 添加不同的其他培養(yǎng)基成分，pH值為5.8，在0.2MPa壓力、121°C條件下高溫高壓滅菌20min。 易碎胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)、胚狀體誘導(dǎo)均采用暗培養(yǎng)，植株再生在光照條件下進行， 培養(yǎng)溫度均為25~27 °C。
[0067] 步驟7 .組織化學(xué)檢測和分子檢測
[0068] 取橡膠樹抗性轉(zhuǎn)化胚狀體、抗性轉(zhuǎn)化植株葉片進行GUS染色，結(jié)果呈藍色陽性。取 抗性轉(zhuǎn)化材料和對照材料一起進行分子檢測，包括(PCR和反向PCR)，證明得到了轉(zhuǎn)基因植 株。
[0069] 7.1抗性愈傷組織的PCR檢測
[0070] 以非轉(zhuǎn)化愈傷組織(對照）和篩選6個月以上的抗性愈傷組織為材料，分別提取基 因組DNA;根據(jù)T-DNA上的uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGRl的序列，用Primer5.0分別設(shè)計一 對特異引物，引物分別命為：
[0071] UF:5 '-GCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTG-3 '，
[0072] UR:5 '-ACGATGCCATGTTCATCTGCCCAG-3 '；
[0073] NPT-F:5 '-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3 '，
[0074] NPT-R:5，-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3，；
[0075] PHHF:5 '-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3 '；
[0076] PHHR:5 '-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3 '，
[0077] 三對引物擴增的PCR產(chǎn)物長度分別為829bp、797bp、3592bp。
[0078] 7.2反向PCR擴增抗性愈傷組織外源基因插入位點的左旁側(cè)序列
[0079] 根據(jù)植物表達載體的T-DNA序列，在T-DNA內(nèi)部的EcoR I至左邊界(TL)的序列上設(shè) 計一對反向引物：
[0080] Eco-F:5 '-CTGCTCTAGCCAATACGCAAACC-3 '，
[0081 ]和TL-R:5，-GTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAAT-3，；
[0082] 將抗性愈傷組織的基因組DNA經(jīng)過一系列的酶切、純化和T4DNA連接酶環(huán)化后，以 環(huán)化產(chǎn)物為模板，以Eco-F和TL-R為引物進行反向擴增，每個系做3個重復(fù);擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳，回收陽性條帶測序，進行同源性分析，驗證其是否為橡膠樹基因組上的片段。 [0083]步驟8.轉(zhuǎn)基因材料的熒光定量PCR檢測
[0084] 用熒光定量PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因愈傷組織、轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株中外源基 因 HbHMGRl的表達情況，以橡膠樹18S rRNA基因為內(nèi)參基因。
[0085] 8.1引物序列設(shè)計
[0086] 用Primer Premier 5.0軟件。
[0087] 18S-F:5 '-GCTCGAAGACGATCAGATAC-3 '
[0088] 18S-R:5 '-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3，146bp
[0089] HbHMGRl-F:5 'GTCGGAGGTGGAACTCAACTT3，58·1
[0090] HbHMGRl-R:5，GCTCACCAGCCAAAACTGAA3,58.6 139bp
[0091] 8.2RNA 抽提
[0092] 操作步驟詳見生工生物工程(上海)股份有限公司柱式植物總RNA抽提純化試劑盒 (SK8661)。
[0093] 電泳檢測-RNA電泳結(jié)果（1.5%瓊脂糖，1 X TAE電泳緩沖液，紫外透射光下觀察并 拍照）。
[0094] 8.3反轉(zhuǎn)錄
[0095] 8.3.1實驗試劑
[0096] 第一鏈cDNA合成試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit) (SK2445)。
[0097] 8 · 3 · 2cDNA 第一鏈合成
[0098] (1)在0.2ml PCR管中加入以下試劑：
[0099] 5μ1 total RNA
[0100] ΙμL Random Primer ρ(?Ν)θ(0.2yg/yl)
[0101] 5μ1 Rnase-free ddH2〇
[0102] (2)7(TC 溫浴 5min。
[0103] (3)冰浴lOsec，離心加入下列試劑：
[0104] 4.0μ1 5*Reaction Buffer
[0105] 2.0μ1 dNTP Mix(10mmol/L)
[0106] Ι.ΟμΙ Rnase inhibitor(20U/yl)
[0107] 2.0μ1 AMV Reverse Transcriptase(10U/yl)
[0108] (4)37°C 溫浴 5min。
[0109] (5)42°C 溫浴 60min。
[0110] (6)70°C 溫浴 lOmin。終止反應(yīng)。
[0111] (7)將上述溶液-20°C保存。
[0112] 8.4標準品制備
[0113] 8.4.1PCR 反應(yīng)體系
[0114] 25μ1體系的配制
[0116] 8.4.2PCR 反應(yīng)條件
[0118] 8.4.3PCR 電泳
[0119] 2 % 瓊脂糖凝膠，1 X TAE，150V，100mA，20min 電泳觀察。
[0120] 8.4.4PCR 回收
[0121] 目的條帶用手術(shù)刀切下，按試劑盒回收(見試劑盒SK8131)。
[0122] 8.4.5克隆測序
[0123] A.連接反應(yīng)
[0124] 5μ1 Solution
[0125] lOngpMD⑧ 18-T Vector
[0126] 5μ1 PCR Product
[0127] Final Volume 10μ1
[0128] 4°C過夜連接。
[0129] B.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
[0130] 使用生工一步法快速感受態(tài)細胞制備試劑盒(產(chǎn)品編號SK9307)，轉(zhuǎn)化步驟如下：
[0131] a. 100μ1感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
[0132] b.加入10μ1連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
[0133] c. 42 °C水浴熱激45秒。冰上放置15~20分鐘。
[0134] d.加600μ1 S0C培養(yǎng)基，37°C200~250rpm振蕩培養(yǎng)1小時。
[0135] e.室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μ1上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸 浮。
[0136] f.將細菌涂布在預(yù)先用20μ1 100mM IPTG和100μ1 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青 霉素平板上。
[0137] g.平板在37°C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。
[0138] C.質(zhì)粒提取
[0139] 使用生工質(zhì)粒提取試劑盒SK8191 SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒 DNA〇
[0140] 8.4.6定量質(zhì)粒信息
[0141] 質(zhì)粒 Ml 3+/_ 測序。
[0142] 構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質(zhì)粒0D26Q的值，通過公式 換算成拷貝數(shù)(copies/μL)。
[0144] A. (1):質(zhì)粒濃度換算公式(copies/μL) = (mol數(shù)/μL) X6.02X 1023 =[質(zhì)量(g)/分 子量]/μL X 6 · 02 X 1023=[質(zhì)量(ng) X 10-9/分子量]/μL X 6 · 02 X 1023 =濃度(ng/μL) X 6 · 02 X 1014/分子量
[0145] (2):分子量=(載體片段堿基對+PCR產(chǎn)物堿基對）Χ650
[0146] (3):雙鏈DNA分子的分子量(道爾頓）=堿基對數(shù)目Χ650
[0147] (4): 一個DNA堿基對(鈉鹽)的平均分子量= 650道爾頓 [0148] Β.標準曲線樣品的制備
[0149] 10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒，90μ1稀釋液+10μ1質(zhì)粒，一般做4-6個點，通過預(yù)實 驗選取合適標準品用于制備標準曲線。
[0150] 8.5熒光定量?0?檢測
[0151] 8.5.1實驗樣本樣品提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成的cDNA，稀釋10倍上機。
[0152] 8.5.2PCR 反應(yīng)步驟
[0153] A.配制主混液
[0155] 注:每20μ1體系加2μ1 cDNA模板。
[0156] B.PCR循環(huán)條件
[0157]
[0158] C.儀器的操作
[0159] 完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler 480 Software Setup(Roche羅氏）中進行反應(yīng)。
[0160] 本發(fā)明一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法是用橡膠樹乳管 特異性強啟動子與天然橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶基因連接，構(gòu)建植物表達載體，轉(zhuǎn) 化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株，用熒光定量PCR技術(shù)證明轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn) 基因植株中目的基因的表達量顯著提高。它為用基因工程方法進行橡膠樹遺傳改良、提高 橡膠產(chǎn)量提供了新的途徑，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化和用基因工程方法提高橡膠產(chǎn)量奠定了基 礎(chǔ)。
[0161] 關(guān)于HbHMGRl基因點突變，目前，NCBI網(wǎng)上關(guān)于天然橡膠生物合成關(guān)鍵限速酶基因 HbHMGRl有3條序列：GenBank AY706757.1、X54659.1、AB294692.1，都克隆自國際上橡膠樹 優(yōu)良品種（X54659.1來源于品種RR頂600、AY706757.1來源于品種RRII105、AB294692.1來源 于品種RRIM600)，相互間只有1~2個堿基的差異。X54659.1和AB294692.1的第1031位堿基 都為G，為Pst I酶切位點[ctgcag(1029. .1034)]，AY706757.1 的 1031 位堿基為A，非Pst I酶 切位點[ctacag( 1029. .1034)] 354659.1和AY706757.1只有這1個堿基的差異，DNA序列相 似率為99.9%。相應(yīng)地454659.1和4￥706757.1的蛋白質(zhì)序列第344位氨基酸殘基分別為〇 (半胱氨酸，Cys)、Y(酪氨酸，Tyr)。其它的氨基酸殘基相同。蛋白質(zhì)序列相似率為99.8%。
[0162] 本實驗室根據(jù)已經(jīng)報道的HbHMGRl基因序列（NCBI登錄號X54659.1)設(shè)計特異引 物，以中國橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97膠乳為材料，通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆HbHMGRl基因，深 圳華大基因公司測序結(jié)果表明，目的片段長1728bp，與NCBI GenBank Accession:X54659.1 的HbHMGRl基因核苷酸序列相比，完全一致，同源性100%。委托生工生物工程(上海)股份有 限公司把X54659.1的1031位堿基由G點突變?yōu)锳。使得該Pst I酶切位點消失，以利于后續(xù)的 植物表達載體構(gòu)建的工作。
[0163] 吳春太等（2009)以NCBI GenBank AB294692.1對HbHMGRl蛋白質(zhì)進行了生物信息 學(xué)分析和同源模建。HbHMGRl蛋白質(zhì)在空間分成3個域，這3個域之間形成一個口袋，通過對 SIM(辛伐他汀）、ADP以及底物HMG-CoA的定位，此口袋為HMGR的活性中心（Wang et al. 1990)。與S頂發(fā)生作用形成氫鍵的殘基E254、K430和與ADP作用的殘基N262保守性較高， 對HMGR的活性有重要影響。即HbHMGRl基因的第1031位堿基和相應(yīng)氨基酸殘基不處于活性 中心的重要位置。因為國際上橡膠樹不同優(yōu)良品種RRII 105、RRIM 600HbHMGRl基因的第 1031位堿基有差異，把其中1個優(yōu)良品種的該堿基突變?yōu)榱?個優(yōu)良品種的相應(yīng)堿基對產(chǎn)量 無負面影響。
[0164] 原始的植物表達載體pCAMBIA2301只有唯一的1個Pst I限制性酶切位點，在核苷 酸序列10864位置。一些實際應(yīng)用中的pCAMBIA2301載體分子上有2個突變增加的Pst I酶切 位點，其中1個約在1178位置，在UidA基因（2053bp)上，此點突變不影響UidA基因的功能；另 1個在約5408位置(非T-DNA功能區(qū)）。這2個突變增加的Pst I酶切位點給載體構(gòu)建帶來了障 礙，使該載體上有3個Pst I酶切位點，難以用該酶酶切。載體pCAMBIA3301上有唯一的1個 Pst I酶切位點（在10550位置）。本發(fā)明把PHEV2.1、HbHMGRl先構(gòu)建到pCAMBIA3301上，再用 酶一起切下來克隆到PCAMBIA2301上，克服了pCAMBIA2301上出現(xiàn)Pst I突變、阻礙載體構(gòu)建 的難題。
[0165] 中間植物表達載體的構(gòu)建過程見說明書附圖1，植物表達載體的構(gòu)建過程見附圖 2〇
【附圖說明】：
[0166] 圖1:中間植物表達載體的構(gòu)建過程
[0167] 圖2:植物表達載體的構(gòu)建過程
[0168] 圖3:改良CTAB法提取的橡膠樹品種熱研7-33-97葉片基因組DNA
[0169] 圖4:HEV2.1啟動子的PCR擴增
[0170] 圖5:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl 酶切鑒定
[0171] 圖中：Ml :1Kb DNA Ladder Marker;M2:DL5000 DNA Marker; l:pCAMBIA3301 載體； 2: pCAMBIA3301-PHEV2 · 1-HbHMGRl載體；3: pCAMBIA3301-PHEV2 · 1-HbHMGRl經(jīng)Hindm、Pst I 和Xma I三酶切的結(jié)果；4:pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl經(jīng)Hindm和Xma I雙酶切的結(jié)果。
[0172] 圖 6:PHEV2.1-HbHMGRl 的 PCR 擴增產(chǎn)物
[0173] 圖中：Μ: DL5000DNAMarker; 1，2，3: PHEV2 · 1-HbHMGRl擴增產(chǎn)物。
[0174] 圖 7 :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl 的酶切鑒定
[0175] 圖中：Ml :1Kb DNA Ladder Marker ;M2:DL 5000 DNA Marker ;-:pCAMBIA2301-MCS 雙酶切鑒定（Hindm,Xma I) ; + :pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl雙酶切（Hind ΙΠ，Xma I); 1 :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl雙酶切（Hindm，XmaI)。
[0176] 圖8:乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl的T-DNA結(jié)構(gòu)
[0177] 圖9$〇艦81厶2301-卩冊￥2.1-扭3腿61?1的？〇?檢測
[0178] 圖10 :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織的⑶S染色鑒定結(jié)果
[0179] 圖中:A:陰性對照;B:篩選的卡那霉素抗性愈傷組織。
[0180]圖11:抗性胚狀體的⑶S染色
[0181] 圖中:A:非轉(zhuǎn)化胚狀體(對照）;B:抗性胚狀體。
[0182] 圖12:轉(zhuǎn)基因植株及其葉片GUS染色
[0183] 圖中:A.轉(zhuǎn)基因植株;B.轉(zhuǎn)基因植株葉片⑶S染色;CK.非轉(zhuǎn)化植株葉片GUS染色(對 照)。
[0184] 圖13:抗性愈傷組織系uidA基因的PCR鑒定結(jié)果
[0185] 圖中：M:DL2000 DNA Marker;-:陰性對照；+ :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl載體 uidA產(chǎn)物；1、2:2號抗性愈傷組織系uidA特異PCR產(chǎn)物;3、4:11號抗性愈傷組織系uidA特異 PCR產(chǎn)物。
[0186] 圖14:抗性愈傷組織系NPTII基因 PCR鑒定結(jié)果
[0187] 圖中：M:DL2000 DNA Marker;-:陰性對照；+ :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl載體 NPTII產(chǎn)物；1、2:2號抗性愈傷組織系NPTII PCR產(chǎn)物;3、4:11號抗性愈傷組織系NPTII PCR 產(chǎn)物。
[0188] 圖15:抗性愈傷組織系PHEV2.1-HbHMGRl的PCR檢測
[0189] 圖中：M:DL2000 DNA Marker;-:陰性對照；+ :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl載體 PHEV2· 1-HbHMGRl PCR產(chǎn)物；1、2:2號抗性愈傷組織系的PHEV2· 1-HbHMGRl PCR產(chǎn)物;3、4:11 號抗性愈傷組織系的PHEV2.1-HbHMGRl PCR產(chǎn)物。
[0190] 圖16 :pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織的反向PCR鑒定
[0191] 圖中：一：陰性對照；1、2、3:2號抗性愈傷組織系IPCR鑒定;4、5、6:11號抗性愈傷組 織系IPCR鑒定。
[0192] 圖17: IPCR擴增片段測序結(jié)果分析
[0193] 圖中：黑色加粗序列：反向引物序列；底紋加粗序列:EcoRI識別序列；水平下劃線 序列：與載體T-DNA完全比對上的序列;波浪下劃線序列:缺失的T-DNA左邊界及左邊界附近 的序列；中間序列：IPCR擴增的未知DNA序列。
[0194] 圖18:未知DNA序列在橡膠樹品種熱研7-33-97基因組數(shù)據(jù)庫的同源性搜索結(jié)果
[0195] 圖19:愈傷組織、轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株樣品RNA電泳
[0196] 圖 20:HbHMGRl、Hbl8SrRNA 基因擴增結(jié)果
[0197] 圖21:內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA梯度稀釋樣品擴增曲線
[0198] 圖22:內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA恪解曲線
[0199] 圖23:內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA標準曲線結(jié)果
[0200]圖中：縱坐標是CT值;橫坐標LogCO，LogCO是指Log濃度即取濃度的對數(shù)。Slope =- 3.358;擴增效率：E = 10 -"斜率-1 = 10 -^3.358-1 = 98.5% ;相關(guān)系數(shù)：R2 = 0.9959; YIntercept:39.90；Error:0.128 〇
[0201]圖24:目的基因 HbHMGRl梯度稀釋樣品擴增曲線
[0202] 圖25:目的基因 HbHMGRl溶解曲線結(jié)果
[0203] 圖26:目的基因 HbHMGRl標準曲線結(jié)果
[0204]圖中：縱坐標是CT值;橫坐標LogCO，LogCO是指Log濃度即取濃度的對數(shù)。Slope =-3 · 225 ;擴增效率：E = 10 -1/iW-l = 10 -"―3·225-1 = 104 · 2 % ;相關(guān)系數(shù)：R2 = 0 · 9977 ; YIntercept:38·00;Error:0·0823 〇
[0205] 圖27:內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA擴增曲線
[0206] 圖28:內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA溶解曲線
[0207] 圖29:目的基因 HbHMGRl擴增曲線
[0208] 圖30:目的基因 HbHMGRl溶解曲線
【具體實施方式】
[0209]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下面結(jié)合附圖及具體 實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0210]本發(fā)明一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，具體步驟如下：
[0211] 步驟1.天然橡膠生物合成關(guān)鍵限速酶基因 HbHMGRl克隆
[0212] 1.1橡膠樹總RNA提取和cDNA第一條鏈合成
[0213] 橡膠樹膠乳總RNA提取用Trizol法（薩姆布魯克等，1996)。按照Revert Aid TM cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一條鏈，-20 °C保存待用。
[0214] 1.2HbHMGRl 基因 cDNA 鏈合成
[0215] 依據(jù)NCBI登錄號X54659.1的HbHMGRl基因，利用Primer5.0設(shè)計1對特異引物用以 擴增HbHMGRl基因 cNDA全長（1728bp):
[0216] 上游引物 H1F: 5，-GCTCTAGAATGGACACCACCGGCC-3 ；
[0217] 下游引物 H1R: 5，-CCCCCCGGGCTAAGATGCAGCTTTAGAC-3
[0218] 其中，在上游引物5'端加上Xba頂每切位點(TCTAGA)，下游引物5'端加上Xmal酶切 位點(CCCGGG)。以橡膠樹膠乳cDNA為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)過電泳、膠回收、純化之后 利用TA克隆連接到pMD 19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過菌落PCR檢測后，挑選陽性克隆的 菌落送到測序公司（例如深圳華大基因公司）進行基因測序。
[0219] 1.3HbHMGRl 基因點突變
[0220] 根據(jù)已經(jīng)報道的HbHMGRl基因序列(NCBI登錄號X54659.1)設(shè)計特異引物，以中國 橡膠樹品種熱研7-33-97膠乳為材料，通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆HbHMGRl基因，目的片段長 1728bp，把X54659.1的1031位堿基由G點突變?yōu)锳，使得該Pst I酶切位點消失，以利于后續(xù) 的植物表達載體構(gòu)建的工作。
[0221 ]步驟2.從橡膠樹優(yōu)良品種材料中克隆乳管特異性強啟動子PHEV2.1
[0222] 2.1橡膠樹葉片基因組DNA的提取
[0223] 用改良的CTAB法從橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97葉片小量提取基因組DNA，具體步 驟如下：
[0224] ⑴稱取0.2g橡膠樹熱研7-33-97的新鮮葉片于液氮預(yù)冷的研缽中，迅速將其研磨 成粉末，轉(zhuǎn)入2ml冰上預(yù)冷的離心管中。
[0225] ⑵在盛有樣品的離心管中加入1ml的6 5 °C預(yù)熱的2 X CTAB裂解液(裂解液用前加入 3 %的β-巰基乙醇），渦旋混勻。
[0226] ⑶轉(zhuǎn)移離心管至65°C水浴鍋中恒溫水浴30min(可以適當延長），期間每隔5~6min 輕輕顛倒混勻10次，使CTAB充分裂解細胞。
[0227] ⑷取出離心管，于高速離心機中25°C、12000rpm、離心5min。
[0228] (5)輕輕取出離心管，小心轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml離心管。加入等體積的氯仿：異戊 醇(24:1)，輕輕顛倒混勾數(shù)次，4°C、12000rpm離心5min。
[0229] (6)輕輕取出離心管，轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml離心管，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1)，輕輕顛倒混勾數(shù)次后，在4°C、12000rpm離心5min。
[0230] (7)取上清液，再加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，條件同（5)。
[0231] (8)取上清液至新的2ml離心管，加入1/10體積3M預(yù)冷的NaAc，輕輕混勻，然后加入 等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，置于_20°C冰箱中充分沉淀30min(可以適當延長）。
[0232] (9)在4°C、12000rpm離心10min，棄上清液，用70%的乙醇洗滌沉淀物兩次并轉(zhuǎn)入 1.5ml小管，盡可能地吸干管里的酒精。
[0233] (10)將沉淀物置于超凈工作臺上靜置lOmin，然后用100μΙ的無菌雙蒸水溶解沉淀 物。
[0234] (11)于上面提取的DNA中加入2.5yl(10mg/ml)的RNaseA，在37°C水浴鍋中水浴酶解1 ~2h〇
[0235] (12)酶解期間，每30min取5μ1進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA是否徹底消化。
[0236] (13)加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1)，輕輕顛倒翻轉(zhuǎn)50次后，在4°C、12000rpm離心 10min〇
[0237] (14)取上清液，加入1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，混勻，加入2倍體積的無水乙醇，上 下翻轉(zhuǎn)混勾5min，-20 °C沉淀lh。
[0238] (15)在4°C、12000rpm離心10min。
[0239] (16)用70 %的酒精洗滌沉淀物2次。
[0240] (17)沉淀物置于超凈工作臺上靜置lOmin，用50μ1的無菌雙蒸水溶解沉淀物。
[0241] (18)取2μ1的DNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度。
[0242] 2.2橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1的克隆
[0243] 根據(jù)法國農(nóng)業(yè)研究國際合作中心（CIRAD)的Pujade-Renaud等（2005)報道的 HEV2. 1序列（NCBI登錄號：AY247789.1)，截取起始密碼子前的1830bp堿基序列，用 P r i m e r 5 . 0設(shè)計一對特異性引物P H F 1和P H R 1，上游引物為卩!^1:5'-CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3 '，下游引物為PHR1 : 5 ' -TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3 '，下劃線部分為在引物兩端引入的酶切 位點Hindlll和Pst頂每切位點。以從中國橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97葉片提取的基因組 DNA為模板，以PHF1和PHR1為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾"A" 后，克隆到pMD19_Tvecor上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，經(jīng)12~16h的培養(yǎng)后，挑取單菌落進行 菌液PCR，選取PCR檢測為陽性的菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測 序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTN工具進行序列同源性分析。
[0244] 從橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97葉片提取的基因組DNA，取2μ1稀釋5倍后進行瓊脂 糖凝膠電泳，檢測其純度，結(jié)果見圖3。從圖3可見，提取得到的橡膠樹葉片基因組DNA條帶整 齊、清晰、完整性好、無明顯的雜質(zhì)和降解現(xiàn)象。利用微型紫外分光光度計測其濃度，濃度大 約為lOOng/μΙ左右。
[0245] 以橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板，用特異性引物PHF1和 PHR1進行PCR擴增，得到一條近2000bp左右的條帶（圖4)。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限 公司測序結(jié)果證明，從熱研7-33-97基因組中擴增得到的PHEV2.1為1852bp。將所得序列錄 入 NCBI 的 BLASTN 數(shù)據(jù)庫中與 Pujade-Renaud 等（2005)報道的 PHEV2 · 1序列（GenBank: AY247789.1)進行同源性比較分析，結(jié)果顯示，所克隆的PHEV2.1啟動子序列與AY247789.1 的啟動子序列的同源性為98.6 %。
[0246] 步驟3.構(gòu)建HbHMGRl基因的乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl
[0247] HbHMGRl乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2. Ι-HbHMGRl的構(gòu)建及酶切 鑒定:先利用Xbal和Xma I分別對pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGRl進行雙酶切，酶切產(chǎn) 物經(jīng)1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠回收p CAMBIA 3 3 01的大片段和p CAMBIA 2 3 01 -HbHMGRl的小片段(HbHMGRl基因），將兩片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，過 夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌落PCR檢測，提取陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGRl;再用 Hindlll和PstI分別對pCAMBIA3301-HbHMGRl和pMD19-T-PHEV2.1 進行雙酶切，電泳結(jié)束后， 分別對pCAMBI A3301 -HbHMGR 1的大片段和pMD 19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)進行切膠回 收，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌液 PCR，提取陽性重組質(zhì)粒，用Hindm、Pst I、Xma I和Hindm、Xma I分別對其進行三酶切和雙 酶切，三酶切得到一條與雙酶切等大的大片段和一條近2000bp的條帶，近2000bp的條帶為 大小相近的PHEV2.1片段和HbHMGRl片段，前者為1852bp，后者為1728bp，兩者由于大小相近 而顯示為一條帶，另外，雙酶切得到的小片段間于3000bp至5000bp之間，與3592bp的 PHEV2. Ι-HbHMGRl重組片段的大小一致（圖5);再用PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGRl的下 游引物PHHR對pCAMBIA3301-PHEV2. Ι-HbHMGRl進行PCR擴增，也得到一條間于3000bp至 5000bp之間的條帶，與雙酶切得到的小片段大小相符（圖6)，證明中間表達載體 pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl 已經(jīng)構(gòu)建成功。
[0248] 最后用!^11(1111和乂11^1將？冊￥2.1-肋腿61?1重組片段從口041?143301-?冊￥2.1-HbHMGRl上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hindm和Xma I間，得到植物表達載體 PCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進行菌落PCR，提取陽性重組質(zhì) 粒口〇厶1?1厶2301-卩冊￥2.1-肋腿61?1，以口〇厶1?1厶2301-]\?^為陰性對照邛〇厶1?1厶330卜 PHE V2 · 1 -HbHMGR1為陽性對照，用H i nd ΙΠ 和Xma I分別對其進行雙酶切，p CAMBIA 2 3 01 -PHEV2.1-HbHMGRl的酶切結(jié)果為得到一條與陽性對照小片段等大且間于3000bp至5000bp的 小片段和一條l〇〇〇〇bp以上的大片段（圖7)，小片段與PHEV2.1-HbHMGRl的預(yù)期大小3592bp 相符，證明乳管特異性植物表達載體PCAMBIA2301-PHEV2. Ι-HbHMGRl已經(jīng)構(gòu)建成功，其T-DNA結(jié)構(gòu)見圖8。
[0249] 步驟4.橡膠樹易碎胚性愈傷組織的培養(yǎng)
[0250] 橡膠樹優(yōu)良品種易碎胚性愈傷組織的培養(yǎng):先取中國橡膠樹優(yōu)良高產(chǎn)品種熱研8-79單核靠邊期花蕾，用流水沖洗后，在超凈臺上再用75%乙醇表面消毒lmin，再以0.1% (w/ v)HgCl2浸泡消毒lOmin，然后用無菌水沖洗3次，每次3min。剝出花蕾中的花藥，接種到花藥 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Ml)[改良的MS培養(yǎng)基并添加2.0mg/L2，4-D、1.0mg/L NAA、 1 .Omg/L ΚΤ、0· lg/L肌醇、70g/L鹿糖、5% (v/v)CW、2.0g/L植物凝膠(phytagel，Sigma)]，培 養(yǎng)50d，誘導(dǎo)出初生愈傷組織后，再將生長狀態(tài)良好的初生愈傷組織轉(zhuǎn)入到新鮮的Ml上繼代 培養(yǎng)，每10天繼代一次。生長良好的花藥初生愈傷組織經(jīng)多次選擇繼代，直至誘導(dǎo)出顏色鮮 黃、結(jié)構(gòu)疏松、顆粒狀的花藥胚性愈傷組織。它們可以誘導(dǎo)出胚狀體和再生植株。以這些易 碎胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體材料。易碎胚性愈傷組織置于高鈣離子濃度（11.0mm 〇l/L)的繼 代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每隔20d繼代1次，經(jīng)過5次以上的繼代后，篩選出適合長期繼代培養(yǎng) 的易碎胚性愈傷組織。
[0251 ]步驟5.橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化
[0252] 5.1根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備方法
[0253] (1)從-80 °C冰箱中取一管保存的EHA105菌種于冰上溶解。
[0254] (2)用接種環(huán)蘸取一點菌液，然后于含有75mg/L利福平和75mg/L鏈霉素的LB固體 培養(yǎng)基上劃平板，培養(yǎng)36~48h。
[0255] (3)挑取一個單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基(含有75mg/L利福平和75mg/L鏈霉 素），在28°C、200rpm培養(yǎng) 16~24h。
[0256] (4)將(3)中的2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到100ml LB液體培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm培養(yǎng)至菌 液濃度為0D600約為0.5左右。
[0257] (5)將培養(yǎng)物分裝到兩個50ml的離心管中，置于冰上冰浴30min，在4°C、5000rpm離 心10min〇
[0258] (6)棄上清液，收集菌體，用10ml預(yù)冷的0.15mol/L NaCl懸浮，在4°C、5000rpm離心 5min，收集菌體。
[0259] (7)再懸浮菌體于10ml預(yù)冷的20mmol/L CaCl2溶液中，再次同上離心并收集菌體。
[0260] (8)用lml預(yù)冷的含有10%甘油的20mmol/L CaCl2溶液懸浮菌體，然后按照50μ1/ 管分裝，液氮速凍后置于-80 °C超低溫冰箱中備用。
[0261] 5.2植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0262] 根癌農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化方法采用凍融法。取一管農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞置于 冰上溶解，在菌液中加入〇. 5yg重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl，輕輕震蕩混勻，冰 浴30min;液氮中速凍lmin，再于37°C溫育5min;取出樣品，迅速置于冰上冷卻5min;加入lml 無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于搖床中28°C溫和振蕩（lOOrpm)培養(yǎng)4h; 5000rpm離心5min，收 集菌體，懸浮于300μ1 LB液體培養(yǎng)基中；將轉(zhuǎn)化細胞在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平 和50mg/L鏈霉素的LB培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)36~48h后，挑取5個單菌落，用特異引物PHF1、PHR1 和H1F、H1R對單菌落進行菌落PCR，檢測結(jié)果均為陽性(圖9)，證明植物表達載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn) 化到根癌農(nóng)桿菌中。選取PCR檢測為陽性的菌株制備工程菌，以作后續(xù)侵染。
[0263] 5.3花藥易碎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化及GUS組織化學(xué)染色
[0264] 易碎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化，對愈傷組織進行侵染、共培養(yǎng)、抑菌和篩選。將篩選得 到的抗性愈傷組織進行⑶S組織化學(xué)染色。以含有載體質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl 的根癌農(nóng)桿菌侵染橡膠樹品種熱研8-79的花藥易碎胚性愈傷組織，經(jīng)過4~6個月的篩選， 得到GUS組織化學(xué)染色陽性的卡那霉素抗性愈傷組織系。圖10為一個抗性愈傷組織系的GUS 染色結(jié)果，說明植物表達載體PCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl的T-DNA已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入易碎愈 傷組織細胞中。
[0265] 選取⑶S染色陽性的抗性愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)增殖，以便用于后續(xù)的分子檢測 和體細胞胚發(fā)生。
[0266] 步驟6.獲得胚狀體和再生植株
[0267] 共培養(yǎng)結(jié)束后，將橡膠樹品種熱研8-79易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中進行 抑菌處理，18天后，轉(zhuǎn)移到卡那霉素為75~100mg/L的篩選培養(yǎng)基中，經(jīng)過4個月的篩選，長 出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經(jīng)過GUS染色為陽性的愈傷組織增殖1~2個月后誘導(dǎo)胚狀體 和植株再生，獲得了抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織誘導(dǎo)出胚狀體和轉(zhuǎn)化植株。
[0268] 橡膠樹組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分見表2。
[0269] 表2:橡膠樹組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分
[0270]
[0271] 橡膠樹愈傷組織培養(yǎng)培養(yǎng)基為經(jīng)改良的MS培養(yǎng)基（改良成份為MgS〇4 · 7H20 500mg/L，KH2P〇4 400mg/L，CaCl2 250mg/L，MnS〇4.H20 35mg/L，CuS〇4.5H20 0.2mg/L)，再 添加不同的其他培養(yǎng)基成分，pH值為5.8，在0.2MPa壓力、121°C條件下高溫高壓滅菌20min。 易碎胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)、胚狀體誘導(dǎo)均采用暗培養(yǎng)，植株再生在光照條件下進行， 培養(yǎng)溫度均為25~27°C。非轉(zhuǎn)化胚狀體(對照）、轉(zhuǎn)化抗性胚狀體及組織化學(xué)⑶S染色情況舉 例見圖11。轉(zhuǎn)基因植株及其葉片GUS染色檢測情況見圖12。
[0272] 步驟7.組織化學(xué)檢測和分子檢測
[0273] 取橡膠樹抗性轉(zhuǎn)化胚狀體、抗性轉(zhuǎn)化植株葉片進行GUS染色，結(jié)果呈藍色陽性。取 抗性轉(zhuǎn)化材料和對照材料一起進行分子檢測，包括(PCR和反向PCR)，證明得到了轉(zhuǎn)基因植 株。
[0274] 7.1抗性愈傷組織的PCR檢測
[0275] 以非轉(zhuǎn)化愈傷組織(對照）和篩選6個月以上的抗性愈傷組織為材料，分別提取基 因組DNA;根據(jù)T-DNA上的uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGRl的序列，用Primer5.0分別設(shè)計一 對特異引物，引物分別命為：
[0282] 三對引物擴增的PCR產(chǎn)物長度分別為829bp、797bp、3592bp。
[0283] 從篩選得到的2號、11號抗性愈傷組織系分別提取基因組DNA，以非轉(zhuǎn)化愈傷組織 系基因組DNA為陰性對照，以植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl為陽性對照，用 uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGRl的特異引物進行PCR擴增，每個系做兩個重復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個 抗性愈傷組織系均能擴增出與陽性對照相同的特異片段，其目的片段大小分別為829bp(圖 13)、797bp(圖 14)和 3592bp(圖 15)。
[0284] 7.2反向PCR擴增抗性愈傷組織外源基因插入位點的左旁側(cè)序列
[0285] 根據(jù)植物表達載體的T-DNA序列，在T-DNA內(nèi)部的EcoR I至左邊界(TL)的序列上設(shè) 計一對反向引物：
[0286] Eco-F:5 '-CTGCTCTAGCCAATACGCAAACC-3 '，
[0287] 和TL-R: 5 ' -GTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAAT-3 ' ；將抗性愈傷組織的基因組DNA經(jīng)過 一系列的酶切、純化和T4DNA連接酶環(huán)化后，以環(huán)化產(chǎn)物為模板，以Eco-F和TL-R為引物進行 反向擴增，每個系做3個重復(fù);擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收陽性條帶送往測序公司測 序[例如生工生物工程(上海)股份有限公司];測序所得未知序列利用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所和中科院北京基因組研究所合作測序建立的橡膠樹品種熱研7-33-97的基因組 數(shù)據(jù)庫，進行同源性分析，驗證其是否為橡膠樹基因組上的片段。
[0288] 經(jīng)反向PCR(IPCR)鑒定，11號抗性愈傷組織系擴增出一條近2000bp的條帶，而2號 抗性愈傷組織系未能擴增出陽性條帶（圖16)。對11號系IPCR擴增所得片段進行測序鑒定， 結(jié)果顯示該片段大小為1803bp，其中包含反向引物能擴增到的T-DNA序列和一段未知的DNA 序列（圖17)。未知序列經(jīng)方永軍博士在橡膠樹品種熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫進行同源 性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其基因組中存在一段與未知序列98.7%相同的序列（圖18)，證明所得 未知片段為橡膠樹基因組的一部分，植物表達載體的T-DNA已經(jīng)成功整合到橡膠樹品種熱 研8-79的染色體上，所得到的11號抗性愈傷組織系為轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。
[0289] 步驟8.轉(zhuǎn)基因材料的熒光定量PCR檢測
[0290] 用熒光定量PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因愈傷組織、轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株中外源基 因 HbHMGRl的表達情況，以橡膠樹18SrRNA基因為內(nèi)參基因。
[0291] 研究樣品信息見表3。
[0292] 表3轉(zhuǎn)基因愈傷組織、轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株樣品信息
[0293]
[0294] 8.1引物序列設(shè)計
[0295] 用Primer Premier5.0軟件。
[0300] 8.2RNA 抽提
[0301] 操作步驟詳見生工生物工程(上海)股份有限公司柱式植物總RNA抽提純化試劑盒 (SK8661)。
[0302]電泳檢測-RNA電泳結(jié)果（1.5%瓊脂糖，1 X TAE電泳緩沖液，紫外透射光下觀察并 拍照)見圖19。
[0303] 8.3反轉(zhuǎn)錄
[0304] 8.3.1實驗試劑
[0305] 第一鏈cDNA合成試劑盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit) (SK2445)。
[0306] 8 · 3 · 2cDNA 第一鏈合成
[0307] (1)在0.2ml PCR管中加入以下試劑：
[0308] 5μ1 total RNA
[0309] ΙμL Random Primer ρ(?Ν)θ(〇.2yg/yl)
[0310] 5μ1 Rnase-free ddH2〇
[0311] (2)7(TC 溫浴 5min。
[0312] (3)冰浴lOsec，離心加入下列試劑：
[0314] (4)37°C 溫浴 5min。
[0315] (5)42°C 溫浴 60min。
[0316] (6)70°C 溫浴 lOmin。終止反應(yīng)。
[0317] (7)將上述溶液-20°C保存。
[0318] 8.4標準品制備
[0319] 8.4.1PCR 反應(yīng)體系
[0320] 25μ1體系的配制
[0322] 8.4.2PCR 反應(yīng)條件
[0324] 8.4.3PCR 電泳
[0325] 2 % 瓊脂糖凝膠，1 X ΤΑΕ，150V，100mA，20min電泳觀察(見圖 20)。
[0326] 8.4.4PCR 回收
[0327] 目的條帶用手術(shù)刀切下，按試劑盒回收(見試劑盒SK8131)。
[0328] 8.4.5克隆測序：
[0329] A ·連接反應(yīng)
[0331] B.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
[0332] 使用生工一步法快速感受態(tài)細胞制備試劑盒(產(chǎn)品編號SK9307)，轉(zhuǎn)化步驟如下：
[0333] a. 100μΙ感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
[0334] b.加入10μ1連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
[0335] c. 42 °C水浴熱激45秒。冰上放置15~20分鐘。
[0336] d ·加600ylS0C培養(yǎng)基，37 °C 200~250rpm振蕩培養(yǎng)1小時。
[0337] e.室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μ1上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸 浮。
[0338] f.將細菌涂布在預(yù)先用20μ1 100mM IPTG和100μΙ 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青 霉素平板上。
[0339] g.平板在37°C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。
[0340] C.質(zhì)粒提取
[0341] 使用生工質(zhì)粒提取試劑盒SK8191 SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒 DNA〇
[0342] 8.4.6定量質(zhì)粒信息
[0343] 質(zhì)粒 M13+/-測序。
[0344] 構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質(zhì)粒0D26Q的值，通過公式 換算成拷貝數(shù)(copies/μL)。
[0345]
[0346] A. (1):質(zhì)粒濃度換算公式(copies/μL) = (mol數(shù)/μL) X6.02X 1023 =[質(zhì)量(g)/分 子量]/μL X 6 · 02 X 1023=[質(zhì)量(ng) X 10-9/分子量]/μL X 6 · 02 X 1023 =濃度(ng/μL) X 6 · 02 X 1014/分子量
[0347] (2):分子量=(載體片段堿基對+PCR產(chǎn)物堿基對）Χ650
[0348] (3):雙鏈DNA分子的分子量(道爾頓）=堿基對數(shù)目X650
[0349] (4): 一個DNA堿基對(鈉鹽)的平均分子量= 650道爾頓
[0350] B.標準曲線樣品的制備
[0351] 10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒，90μ1稀釋液+10μ1質(zhì)粒，一般做4-6個點，通過預(yù)實 驗選取合適標準品用于制備標準曲線。
[0352] 8.5熒光定量?0?檢測
[0353] 8.5.1實驗樣本樣品提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成的cDNA，稀釋10倍上機。
[0354] 8.5.2PCR 反應(yīng)步驟
[0355] A ·配制主混液
[0357] 注:每20μ1體系加2ylcDNA模板。
[0358] B.PCR循環(huán)條件
[0359]
[0360] C.儀器的操作
[0361 ] 完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480Software Setup (Roche羅氏）中進行反應(yīng)。
[0362] 8.6熒光定量PCR研究結(jié)果
[0363] 8.6.1絕對定量標準曲線結(jié)果
[0364] (1)內(nèi)參基因 HblSS rRNA:
[0365] 梯度稀釋樣品擴增曲線見圖21;熔解曲線結(jié)果見圖22;標準曲線結(jié)果見圖23。
[0366] (2)目的基因 HbHMGRl:
[0367] 梯度稀釋樣品擴增曲線見圖24;溶解曲線結(jié)果見圖25;標準曲線結(jié)果見圖26。
[0368] 8.6.2基因擴增
[0369] (1)內(nèi)參基因 Hbl8S rRNA擴增曲線見圖27;溶解曲線結(jié)果見圖28。
[0370] (2)目的基因 HbHMGRl擴增曲線見圖29;溶解曲線結(jié)果見圖30。
[0371] 8.6.3相對定量結(jié)果
[0372] (1)平均拷貝數(shù)
[0373]
[0374] (2)Ct值
[0375]
[0376] 8.6.4結(jié)果分析
[0377] 用熒光定量PCR方法特異性地擴增了樣品中表達的目的基因 HbHMGRl，這從 HbHMGR 1的擴增溶解曲線也反映出來。經(jīng)過熒光定量PCR檢測，以橡膠樹品種熱研8-79非轉(zhuǎn) 化易碎胚性愈傷組織(對照)HbHMGRl的表達量為1，光照綠色胚狀體(對照)該基因的表達量 相對值為3.115259，轉(zhuǎn)入乳管特異性啟動子PHEV2.1驅(qū)動的HbHMGRl的轉(zhuǎn)基因系H6系、H9系、 H11系光照綠色轉(zhuǎn)基因胚狀體該基因的表達量相對值分別為3.964885、45.41104、 102.2583，表達量相對于非轉(zhuǎn)化對照愈傷組織和非轉(zhuǎn)化對照胚狀體中有顯著提高。在橡膠 樹胚狀體中已有乳管分化（史敏晶等2012)。轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達量相對值為 10.18455，相對于非轉(zhuǎn)化對照愈傷組織和非轉(zhuǎn)化對照植株(4.294341)亦有顯著提高。表明 本實驗室以橡膠樹乳管特異性強啟動子PHEV2.1與天然橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶基 因 HbHMGRl連接構(gòu)建植物表達載體，轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法 是成功、有效的，轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達量都有顯著提高。這為用基因 工程方法對橡膠樹進行遺傳改良、提高產(chǎn)量打下了良好基礎(chǔ)。
[0378] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用乳管特異性啟動子獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于包括天然橡膠 生物合成關(guān)鍵限速酶基因 HbHMGRl克隆，橡膠樹乳管特異性強啟動子PHEV2.1的克隆，構(gòu)建 HbHMGRl基因的乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl，橡膠樹易碎胚性 愈傷組織的培養(yǎng)，橡膠樹繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化，獲得胚狀體和再生植株，組織化 學(xué)檢測和分子檢測，轉(zhuǎn)基因胚狀體、轉(zhuǎn)基因植株和對照材料的熒光定量PCR檢測； 所述的橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1的克隆是根據(jù)HEV2.1基因序列(NCBI登錄號： AY247789.1)，截取起始密碼子前的1830bp堿基序列，用Primer5.0設(shè)計一對特異性引物 PHFl和PHRl，上游引物為PHFl:5'-CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC-3'，下游 引物為PHRl: 5 ' -TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC-3 '，下劃線部分為在引物 兩端引入的酶切位點HindIII和Pst頂每切位點；提取橡膠樹優(yōu)良品種葉片基因組DNA為模 板，以PHFl和PHRl為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾"A"后，克隆 到pMD19_T vecor上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，經(jīng)12~16h的培養(yǎng)后，挑取單菌落進行菌液 PCR，選取PCR檢測為陽性的菌落送往測序公司進行測序;測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)上的BLASTN工 具進行序列同源性分析； 所述的構(gòu)建HbHMGRl基因的乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl 是先利用XbaI和XmaI分別對pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGRl進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠回收口041?143301的大片段和?041?142301-肋!^61?1 的小片段(HbHMGRl基因），將兩片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，過夜培養(yǎng) 后挑取單菌落進行菌落PCR檢測，提取陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-HbHMGRl;再用HindIII和 PstI分別對pCAMBIA3301-HbHMGRl和pMD19-T-PHEV2.1進行雙酶切，電泳結(jié)束后，分別對 pCAMBIA3301-HbHMGRl的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)進行切膠回收，回 收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌液PCR，提取 陽性重組質(zhì)粒，并用Hindm、PstI和XmaI對其進行酶切鑒定，確認得到的陽性重組質(zhì)粒為 PCAMBIA3301-PHEV2 · I-HbHMGRl;最后用Hindm和XmaI將PHEV2 · I-HbHMGRl重組片段從 PCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGRl上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hindm和XmaI 間， 得到植物表達載體PCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGRl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進行菌落 PCR，提取陽性重組質(zhì)粒，用Hindm和XmaI進行酶切鑒定，確認HbHMGRl乳管特異性植物表達 載體構(gòu)建成功。
【文檔編號】C12N15/66GK105886528SQ201610058236
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年1月28日
【發(fā)明人】李哲, 賀永國, 黃綿佳, 馬曉曉, 曾憲海, 林位夫, 周建南, 劉潔瓊
【申請人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所