專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
橡膠樹(HeveaBrasiliensis Mull. Arg)屬于大戟科(Euphorbiaceae)橡膠樹屬(Hevea)，是多年生異花授粉喬木，栽培于熱帶地區(qū)。由于橡膠樹生活周期長，從種子萌發(fā)到幼齡橡膠樹開割，需要6年以上的時間，因此常規(guī)育種周期較長，一般在30年左右。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對巴西橡膠樹進行遺傳改造，可為橡膠樹品種改良創(chuàng)造優(yōu)良條件，縮短育種周期。目前，已有不少國家投入大量的人力物カ進行廣泛的研究并取得了一定的進展(Leclercq J, Martin F, Lardet L, et al. benetic transformation and regeneration οι plantover-expressing Cu/inSOD geneto control oxidative stress in rubber tree. In Proceeding of InternationalRubber Conference,Siem Reap,Cambodia, 2007 ；ArokiarajP, Leelawathy R, Yeang H Y. The supervirulence plasmid pToK47 fromAgrobacteriumtumefaciens A281 improves transformation efficiency ofHevea brasiliensis [J].American Journal of Biochemistry andBiotechnology, 2009, 5 (3) : 137-141 ;黃天帶，李哲，孫愛花等.根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹花藥愈傷組織遺傳體系的建立.作物學(xué)報，2010，36(10) :1691-1697)。目前，巴西橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化中受體材料主要以致密的花藥胚性愈傷組織為主，其轉(zhuǎn)化過程中仍存在很多困難，其主要的是轉(zhuǎn)化效率較低，轉(zhuǎn)基因植株獲得率低，以及轉(zhuǎn)化受體材料受花期限制等，無法滿足試驗和生產(chǎn)需要。為此，人們希望通過建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，來滿足生產(chǎn)和實驗的需要。然而，由于多種因素的限制，建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系仍面臨諸多困難，如何解決這些困難，最終建立起穩(wěn)定、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系成為目前最迫切的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以巴西橡膠樹優(yōu)良品種的花藥愈傷組織誘導(dǎo)的胚性細胞懸浮系為受體材料，利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)體細胞胚發(fā)生途徑獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括如下步驟I)工程菌液的制備取_80°C保存的根瘤農(nóng)桿菌菌種在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB (發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基)固體培養(yǎng)基上劃線，28°C倒置培養(yǎng)48 72h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C條件下在220rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)的搖床上振蕩培養(yǎng)24 48h至根瘤農(nóng)桿菌處于對數(shù)生長期，然后取10 30ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫條件下4000rpm離心IOmin收集菌體，收集的菌體用100ml AAM培養(yǎng)基重懸，在相同條件下振蕩培養(yǎng)4 6h后用新鮮的AAM培養(yǎng)基稀釋至0D600 = O. I
O.6 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液；2)工程菌侵染懸浮細胞將橡膠樹胚性懸浮細胞去除培養(yǎng)基后放入20 30mlエ程菌液中浸泡I 5min，讓工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞；3)懸浮細胞與工程菌共培養(yǎng)將侵染后的橡膠樹胚性懸浮細胞去除菌液并用無菌濾紙吸干后，接種到共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20 25°C，培養(yǎng)2 8d ;4)懸浮細胞的脫菌培養(yǎng)經(jīng)共培養(yǎng)的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗3 5次，盡可能去除農(nóng)桿菌后，接種到脫農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上，25 28°C條件下暗培養(yǎng)15 30d，去除農(nóng)桿菌并誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織；
5)抗性胚性愈傷組織的篩選將誘導(dǎo)的胚性愈傷組織接到篩選培養(yǎng)基上，25 28°C暗培養(yǎng)，每15 30d轉(zhuǎn)接到新鮮的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)2 4次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續(xù)在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；6)抗性愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體將繼代培養(yǎng)后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25 28°C條件下暗培養(yǎng)，每25 30d轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上直至體細胞胚發(fā)育成熟。7)植株再生將成熟胚狀體接種到再生植株培養(yǎng)基，25 28°C條件下光照培養(yǎng)，光周期為16h/d，直至長出完整再生植株。所述的共培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基(七水硫酸鎂300 550mg/L，磷酸ニ氫鉀300 500mg/L,無水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸銅O. I O. 35mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝膠2 3g/L ；所述的脫農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激動素 O. I 3. Omg/L,肌醇 O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝膠2 3g/L ；所述的篩選培養(yǎng)基有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸O. I
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝膠2 3g/L ；所述的體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素I. O
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I O. 5mg/L, 6-節(jié)氨基腺嘌呤O. I 3. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,活性炭I 2g/L，肌醇O. I O. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝膠
2 3g/L ；所述的再生植株培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素O. 5 3. Omg/L, α -萘こ酸O. 01 I. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/し椰子水30 50ml/L，植物凝膠2 3g/L。本發(fā)明在巴西橡膠樹胚性細胞懸浮系再生植株體系基本建立的基礎(chǔ)上，建立了以巴西橡膠樹胚性細胞懸浮系為受體的高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可以獲得大量均一的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化材料，為進一歩建立巴西橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化育種提供重要基礎(chǔ)。為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化育種培育產(chǎn)量高、抗性強且生長快的優(yōu)良品種。本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)基因再生植株獲得率高，具有很大的應(yīng)用價值。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。預(yù)先按要求配制好各種培養(yǎng)基和工程菌液。取-80°C保存的根瘤農(nóng)桿菌EHA105 (含質(zhì)粒pCambia2301-AtCBFl)菌種在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C倒置培養(yǎng)60h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C條件下在220rpm振蕩培養(yǎng)30h至根瘤農(nóng)桿菌處于對數(shù)生長期，然后取20ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫4000rpm離心IOmin收集菌體，收集的菌體用100ml AAM培養(yǎng)基重懸，在相同條件下振蕩培養(yǎng)5h后，用新鮮的AAM培養(yǎng)基稀釋至0D600 = O. 4 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液。、用移液槍將巴西橡膠樹熱研8-79胚性懸浮細胞的培養(yǎng)液吸干后，加入25mlエ程菌液浸泡3min，浸泡結(jié)束后用移液槍去除菌液并用無菌濾紙吸干殘留菌液后，接種至共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度20°C，暗培養(yǎng)4d。共培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基(七水硫酸鎂500mg/L,磷酸ニ氫鉀400mg/L,無水氯化I丐250mg/L, 一水硫酸猛35mg/L,五水硫酸銅
O.2mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激動素I. 5mg/L,肌醇
0.lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，こ酰丁香酮75 μ Μ，植物凝膠2. 2g/L。把經(jīng)過共培養(yǎng)的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗5次，用無菌濾紙吸干后，接種到脫農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上進行脫菌培養(yǎng)，暗培養(yǎng)20d，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。脫菌培養(yǎng)基成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L，激動素
1.5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林400mg/L,植物凝膠2. 2g/L。將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上篩選4次，15d篩選一次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續(xù)在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激動素I. 5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林300mg/L,卡那霉素100mg/L,植物凝膠2. 2g/L。再將繼代培養(yǎng)后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每25d轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至體細胞胚發(fā)育成熟。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素2. 0mg/L, α -萘こ酸O. 2mg/L, 6-節(jié)氨基腺嘌呤L Omg/L,赤霉素2. Omg/L,活性炭I. Og/L，肌醇O. lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，植物凝膠2. 2g/L。然后將成熟胚狀體接種到再生植株培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，光照16h/d，以促其再生出完整植株，培養(yǎng)IOd后，子葉形胚開始抽芽，20d后，長成健壯的完整小植株。再生植株培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素I. 0mg/L, α -萘こ酸0. lmg/L,赤霉素2. 0mg/L，植物凝膠2. 2g/L，蔗糖70g/L，活性碳I. 5g/L，椰子水40ml/L。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于，包括如下步驟 .1)工程菌侵染懸浮細胞將橡膠樹胚性懸浮細胞去除培養(yǎng)基后放入20 30ml工程菌液中浸泡I 5min，讓工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞； .2)懸浮細胞與工程菌共培養(yǎng)將侵染后的橡膠樹胚性懸浮細胞去除菌液并用無菌濾紙吸干后，接種至共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20 25°C，培養(yǎng)2 8d ; 所述的共培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基(七水硫酸鎂300 550mg/L，磷酸ニ氫鉀300 500mg/L,無水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸銅O. I O. 35mg/L),添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝膠2 3g/L ； .3)懸浮細胞的脫菌培養(yǎng)經(jīng)共培養(yǎng)的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗3 5次后，接種到脫農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上，25 28°C條件下暗培養(yǎng)15 30d，去除農(nóng)桿菌并誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織； 所述的脫農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O.I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激動素 0. I 3. 0mg/L,肌醇 0. I 0. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝膠2 3g/L ； .4)抗性胚性愈傷組織的篩選將誘導(dǎo)的胚性愈傷組織接到篩選培養(yǎng)基上，25 28°C暗培養(yǎng)，每15 30d轉(zhuǎn)接到新鮮的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)2 4次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續(xù)在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)； 所述的篩選培養(yǎng)基有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸0. I .3.0mg/L, α -萘こ酸0. I 2. 0mg/L,激動素0. I 3. 0mg/L,肌醇0. I 0. 2g/L,椰子水.30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝膠2 3g/L ； .5)抗性愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體將繼代培養(yǎng)后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25 28°C條件下暗培養(yǎng)，每25 30d轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上直至體細胞胚發(fā)育成熟； 所述的體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素I. O 3. Omg/し<!-萘こ酸0.1 0· 5mg/L, 6-節(jié)氨基腺嘌呤0. I 3. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,活性炭I 2g/L，肌醇0. I 0. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝膠2 .3g/L ； .6)植株再生將成熟胚狀體接種到再生植株培養(yǎng)基，25 28°C條件下光照培養(yǎng)，光周期為16h/d，直至長出完整再生植株； 所述的再生植株培養(yǎng)基的有效成分為改良的MS培養(yǎng)基，添加激動素0. 5 3. 0mg/L,α -萘こ酸0. 01 I. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/L,椰子水30 50ml/L，植物凝膠2 3g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在干，工程菌液的制備是取_80°C保存的根瘤農(nóng)桿菌菌種在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C倒置培養(yǎng)48 72h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C條件下在220rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)24 48h至根瘤農(nóng)桿菌處于對數(shù)生長期，然后取10 30ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫條件下4000rpm離心IOmin收集菌體,收集的菌體用IOOmlAAM培養(yǎng)基重懸,在相同條件下振蕩培養(yǎng)4 6h后用新鮮的AAM培養(yǎng)基稀 釋至0D600 = O. I O. 6 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括工程菌液的制備，工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞，橡膠樹胚性懸浮細胞與工程菌共培養(yǎng)，橡膠樹胚性懸浮細胞去除農(nóng)桿菌并誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，抗性胚性愈傷組織的篩選及繼代培養(yǎng)，抗性愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體，將成熟胚狀體培養(yǎng)出再生植株。本發(fā)明可為橡膠樹培育產(chǎn)量高、抗性強且生長快的優(yōu)良品種，轉(zhuǎn)化效率高，再生轉(zhuǎn)基因植株獲得率高，具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK102676574SQ20121011924
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者周權(quán)男, 姜澤海, 戴雪梅, 李哲, 畢政鴻, 謝黎黎, 黃華孫, 黃天帶 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所