一種快速高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥莖尖遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域和植物基因工程領(lǐng)域，具體是一種快速高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥作為世界上重要的糧食作物之一，是人類獲取蛋白質(zhì)與熱量的主要來(lái)源之一。根據(jù)國(guó)際糧食政策研究所預(yù)測(cè)，世界小麥需求量將以每年1.6%的速度增長(zhǎng)，但近十多年來(lái)，由于耕地面積的不斷減少和人口數(shù)量的持續(xù)增長(zhǎng)，培育出優(yōu)質(zhì)，高產(chǎn)的小麥?zhǔn)且粋€(gè)急需解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)的小麥雜交育種過(guò)程緩慢，存在基因連鎖和生殖隔離的缺點(diǎn)，很難產(chǎn)生新品質(zhì)的小麥。借助于一些理化條件的誘變育種，需要大量材料，并且難以控制誘變的方向，有益突變率較低，難于進(jìn)行篩選。以細(xì)胞融合的方式獲得雜種細(xì)胞，培養(yǎng)并發(fā)育成植株的細(xì)胞工程育種，技術(shù)復(fù)雜，難度較大，會(huì)導(dǎo)致生物品系減少，個(gè)體生存能力下降。目前，采用基因工程的技術(shù)獲得小麥新品種是最高效的育種方式之一。
[0003]1992年，世界上才成功獲得第一例轉(zhuǎn)基因小麥，作為最后一個(gè)轉(zhuǎn)化成功的重要和谷類糧食作物，其轉(zhuǎn)化效率較低，重復(fù)性較差，轉(zhuǎn)化規(guī)模較小，主要是因?yàn)閮煞矫?一方面小麥屬于六倍體作物，且遺傳背景復(fù)雜，其基因組較大(16000Mb)，是玉米基因組的7倍，水稻基因組的35倍。且重復(fù)序列較多。另一方面小麥的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中DNA導(dǎo)入頻率低，并且轉(zhuǎn)化后小麥愈傷組織的再生能力不強(qiáng)，有較強(qiáng)的基因型依賴性。所以導(dǎo)致小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，進(jìn)展緩慢。轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他植物如玉米水稻等。目前為止小麥轉(zhuǎn)化的方法有:花粉管通道法，顯微鏡注射法等，基因槍法，電擊穿孔法，PEG法等，目前小麥轉(zhuǎn)化普通采用的兩種方法是基因槍法與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。但是，基因槍法經(jīng)濟(jì)成本較高，容易造成外援基因丟失，導(dǎo)致基因沉默。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)單，成本低，插入拷貝數(shù)較少，并能轉(zhuǎn)化一些相對(duì)較大的DNA片段等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染小麥愈傷組織的方法已經(jīng)廣泛的用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。但是該方法受到都須通過(guò)組織培養(yǎng)和植株再生途徑，操作過(guò)程中要求嚴(yán)格，消耗時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，容易出現(xiàn)玻璃化，褐化，細(xì)胞突變等問(wèn)題。且小麥本身具有較強(qiáng)的基因特異性，其基因組相對(duì)于其他作物較大，也增加了轉(zhuǎn)化的難度。因此，能夠創(chuàng)制出不依賴組織培養(yǎng)技術(shù)的小麥植株水平的轉(zhuǎn)化技術(shù)具有重大的意義。
[0004]Erwin Smith在一個(gè)世紀(jì)前對(duì)植物病原體進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種個(gè)革藍(lán)氏陰性的植物病原菌一根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，研究發(fā)現(xiàn):在植物受到損傷的情況下，農(nóng)桿菌能夠侵染大多數(shù)雙子葉植物和部分單子葉植物，植物受傷部位便會(huì)產(chǎn)生一種特異的生物堿一冠癭堿，進(jìn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。從而導(dǎo)致攜帶有外源基因的Ti質(zhì)粒上的T一DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究所采用的受體材料有很多，包括:幼穗、幼胚、成熟胚、胚性愈傷組織、根尖、莖尖等。研究表明:上述材料來(lái)源植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，具有時(shí)空差異性，針對(duì)不同的材料需采取了不同轉(zhuǎn)化以及培養(yǎng)方法，操作過(guò)程較為繁瑣，為了提高轉(zhuǎn)化效率，獲得新的小麥品種。應(yīng)該采用較為理想的遺傳轉(zhuǎn)化材料，其應(yīng)具有以下優(yōu)點(diǎn):第一，材料處理方式相對(duì)均一，具有高重復(fù)性與普遍性。第二，材料分化程度低，細(xì)胞全能性強(qiáng)，具有發(fā)育成完整植株的可能性。第三，材料容易獲取，減少取材對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第四，材料相對(duì)較大，有利于遺傳轉(zhuǎn)化成功。由于小麥成熟個(gè)體較大，材料均一，重復(fù)性高，且易獲得，易保存，細(xì)胞全能性強(qiáng)，是進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想材料。研究表明，傳統(tǒng)小麥農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化往往需要借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)，而其中小麥?zhǔn)荏w基因型是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一，不同小麥?zhǔn)荏w基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性不同，轉(zhuǎn)化效率也顯著不同，研究表明，只有部分小麥基因型的受體材料再生頻率高，絕大多數(shù)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的小麥，其基因型差異較大，再生性能差，仍然難以進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因此，建立一個(gè)轉(zhuǎn)化受體基因型依賴程度較低的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述領(lǐng)域中的需求，本發(fā)明提供了一種小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，避免了傳統(tǒng)小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法中的缺點(diǎn)，包括植物組織培養(yǎng)中嚴(yán)格無(wú)菌條件，培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，所需經(jīng)濟(jì)成本高，對(duì)材料的狀態(tài)和基因型要求較高等，建立了一種簡(jiǎn)單方便高效快速的農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥莖尖的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0006]—種快速高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥莖尖遺傳轉(zhuǎn)化方法，采用以下步驟:
[0007]I)取小麥成熟種子萌發(fā)，得到其發(fā)芽期個(gè)體，低溫處理；
[0008]2)以發(fā)芽期的小麥個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)材料，橫切其部分胚芽，將裸露的莖尖分生組織作為遺傳轉(zhuǎn)化受體；
[0009]3)通過(guò)真空滲透處理的方式，將農(nóng)桿菌導(dǎo)入小麥莖尖分生組織細(xì)胞，使農(nóng)桿菌攜帶的目的基因的T-DNA插入植物基因組；
[0010]4)將小麥移入適宜生長(zhǎng)的土壤，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)管理，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，挑選出轉(zhuǎn)基因小麥植株。
[0011]所述小麥種子萌發(fā)的方法為無(wú)需消毒處理，直接以20-25°C自來(lái)水浸泡破肚露白后置于培養(yǎng)皿中20-25 °C催芽生根。
[0012]所述低溫處理為4°C低溫保存試驗(yàn)材料36-48小時(shí)。
[0013]所述低溫處理時(shí)胚芽長(zhǎng)度為1.5-2.0cm。
[0014]所述遺傳轉(zhuǎn)化受體是帶有完整胚根、胚乳的切除胚芽后的莖尖分生組織。
[0015]所述步驟(3)真空滲透處理方法為將暴露出莖尖分生組織的小麥材料用YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液浸泡，抽真空處理。
[0016]所述YEP農(nóng)桿菌菌液其OD6qq為0.5，農(nóng)桿菌菌液中加入乙酰丁香酮(AS)和表面活性劑(Silwet L-77)，以增加轉(zhuǎn)化效率。
[0017]所述抽真空處理的條件為:1.5Kpa壓強(qiáng)下浸泡5min。
[0018]所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404，攜帶杜仲幾丁質(zhì)酶基因EuCHITI及卡那霉素(Kanamycin Monosulfate)抗性基因的pSH-35S_CHITl載體。
[0019]所述小麥品種為紫粒麥。
[0020]本發(fā)明以小麥成熟種子為材料，經(jīng)過(guò)催芽處理和低溫處理后，橫切其莖尖分生組織，以此為受體;不需要無(wú)菌環(huán)境，在真空條件下，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用真空處理將外源基因?qū)胄←溁蚪M，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。
[0021]本發(fā)明無(wú)需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，受小麥基因型影響程度低，種子萌發(fā)后可直接進(jìn)行操作，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0022]第一、操作簡(jiǎn)單。除了農(nóng)桿菌的培養(yǎng)外，其他步驟無(wú)需在無(wú)菌環(huán)境下操作，避免了植物組織培養(yǎng)過(guò)程必須的培養(yǎng)基配制、外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、共培、篩選、再生芽誘導(dǎo)、生根等一系列繁瑣過(guò)程。
[0023]第二、生長(zhǎng)周期短。從浸種到獲得轉(zhuǎn)基因植株，只需小麥一個(gè)生長(zhǎng)周期，相對(duì)于傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)的方法所需時(shí)間較短。
[0024]第三、重復(fù)性與普遍性高。受轉(zhuǎn)化材料基因型的影響較小，且對(duì)材料的處理方式統(tǒng)一，簡(jiǎn)便，易重復(fù)，轉(zhuǎn)化效率高，Tl代種子轉(zhuǎn)化率為11 %。
[0025]第四、經(jīng)濟(jì)效益高。直接采用農(nóng)桿菌菌液浸染小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體，利用土壤培養(yǎng)小麥，減少了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中植物組織培養(yǎng)所需的一系列人力物力投入，可大幅度減少遺傳轉(zhuǎn)化成本。
[0026]本發(fā)明的用語(yǔ)及培養(yǎng)基:
[0027]本發(fā)明中農(nóng)桿菌培養(yǎng)一般采用YEP培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L+蛋白胨10g/L+NaCl5g/L，pH 7.2，固體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂)培養(yǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1 pSH-35S_EuCHIT植物表達(dá)載體，
[0029]圖2紫粒麥種子，
[0030]圖3GUS染色呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因紫粒麥葉片，
[0031]圖4GUS染色呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因紫粒麥幼穗，
[0032]圖5野生型植株與轉(zhuǎn)基因紫粒麥幼穗GUS染色對(duì)比，
[0033]圖6 EuCHITI基因PCR檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0035]實(shí)施例:采用本方法獲得紫粒麥轉(zhuǎn)基因植株.
[0036]1.小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體準(zhǔn)備
[0037]取紫粒麥成熟種子(見(jiàn)圖2所示)，清水浸泡于25°C下，12h后取出破肚露白的種子，吸出多余水分置于培養(yǎng)皿中催芽生根2d，待胚芽長(zhǎng)度長(zhǎng)到1.5-2.0cm，置于4°C下低溫處理2d，用手術(shù)刀從莖尖莖環(huán)處將胚芽及胚芽鞘切除，從而暴露其莖尖分生組織。
[0038]2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化
[0039]根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404，攜帶杜仲幾丁質(zhì)酶基因EuCHITI的pSH-35S-EuCHIT載體，見(jiàn)圖1所示，劃線接種到Y(jié)EP固體培養(yǎng)基中(含20mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素(Kan)上。置于培養(yǎng)箱，280C黑暗條件下培養(yǎng)2d后，取出培養(yǎng)基并挑取單菌落至5ml YEP液體培養(yǎng)基中(含20mg/L利福平Rif+50mg