一種農(nóng)桿菌介導的荻種子愈傷組織轉(zhuǎn)化方法及應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領域，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導的荻種子愈傷組織轉(zhuǎn) 化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 荻（Miscanthus saccharif lorus (Maxim) Benth.)為禾本科多年生水陸兩生的草 本植物。荻高1~1. 5m，直徑約5mm，具有10多個節(jié)和發(fā)達被鱗片的長匍匐根狀莖，原產(chǎn)于 東亞，目前在我國東北、華北、西北和華東地區(qū)均有分布。因具有再生能力強、適應性強和干 物質(zhì)產(chǎn)量高等特點，被認為是一種重要的能源植物。而利用能源植物開展重金屬污染土壤 修復可以實現(xiàn)生物質(zhì)原料生產(chǎn)與污染土壤治理的雙贏。
[0003]例如，公開號為CN101786097A的中國發(fā)明專利申請文獻公開了一種修復鎘鉛等 重金屬污染土壤的方法，技術(shù)方案是：在含污染物鎘鉛等金屬的土壤上種植荻，當荻長到成 熟期后，將荻整體從污染土壤上移走；在含污染物鎘鉛等重金屬的土壤上種植荻，采用露天 常規(guī)栽培，調(diào)節(jié)土壤水份和營養(yǎng)成分。
[0004][0005]然而，荻對于土壤修復還存在一定的局限性，例如，雖然荻對重金屬具有較強的耐 性，但由于其不能把較多的重金屬轉(zhuǎn)移到地上部，而不能有效的用于植物修復。建立荻轉(zhuǎn)基 因技術(shù)是一種很好的快速培育荻抗逆新品種的方法。例如，公開號為CN 102239808A的中 國發(fā)明專利申請文獻公開了荻的組織培養(yǎng)基及組培方法，組培方法經(jīng)過如下五個步驟：一 是外植體的采集與消毒，二是初代培養(yǎng)，三是不定芽誘導，四是不定芽增殖培養(yǎng)，五是生根 誘導。并公開了分別用于初代培養(yǎng)、不定芽誘導、不定芽增值培養(yǎng)基生根誘導的4中培養(yǎng) 基。
[0006]由于轉(zhuǎn)化方法成熟、轉(zhuǎn)化效率高和操作簡單等優(yōu)點，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法已成為應用最 廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法。然而，截止到目前，還沒有關(guān)于采用農(nóng)桿菌介導荻愈傷組織轉(zhuǎn)基因技 術(shù)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導的荻種子愈傷組織轉(zhuǎn)化方法及應用，為通過轉(zhuǎn)基因 技術(shù)培育荻抗逆新品種奠定了基礎。
[0008] -種農(nóng)桿菌介導的荻種子愈傷組織轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：
[0009] (1)選取荻成熟種子，消毒、清洗后依次進行愈傷組織誘導、繼代培養(yǎng)；
[0010] (2)將繼代培養(yǎng)后的胚性愈傷組織置于含有農(nóng)桿菌菌液的侵染液中侵染，所述農(nóng) 桿菌菌液帶有表達載體；侵染后的胚性愈傷組織在共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)；
[0011] (3)取共培養(yǎng)后的愈傷組織依次經(jīng)無菌水和含羧卞青霉素的無菌水清洗，然后移 至含有羧卞青霉素和潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行篩選；
[0012] (4)將篩選得到的抗性愈傷組織移至分化培養(yǎng)基上，進行分化培養(yǎng)，誘導出不定 芽；
[0013] (5)將分化出的不定芽移至生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成完整植株。
[0014] 荻成熟種子的消毒、清洗過程為：選取籽粒飽滿的荻種子，依次用75%的乙醇和 30%的次氯酸鈉消毒，消毒結(jié)束后用無菌水清洗種子。
[0015] 愈傷組織誘導過程為：將消毒的種子在無菌濾紙上晾干，接種到誘導培養(yǎng)基上，每 皿20顆左右，用封口膜封好培養(yǎng)皿，在28°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)40天。
[0016] 繼代培養(yǎng)過程為：用鑷子挑選生長良好的胚性愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，在 28°C光照培養(yǎng)箱繼代培養(yǎng)15天。
[0017] 愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8。
[0018] 優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌為EHA105;所述表達載體為pCAMBIA1300。pCAMBIA1300的物 理圖譜如圖1所示，該表達載體為空載體，載體上含有35S啟動子序列和hptll基因序列。
[0019] 進一步地，步驟（2)中所述含農(nóng)桿菌菌液的侵染液由如下方法制備：
[0020] 挑取單個攜帶PCAMBIA1300載體的農(nóng)桿菌菌落，接入到含有卡那霉素和鏈霉素的 YEP液體培養(yǎng)基中，26~30°C過夜培養(yǎng)，得到0D600為0. 8-1. 0的菌液；取培養(yǎng)好的菌液 離心收集菌體，用含乙酰丁香酮的侵染液重懸菌體，使重懸后的菌液0D600達到0. 015~ 0. 025,即得所述含農(nóng)桿菌菌液的侵染液。
[0021] 更進一步，挑取單個攜帶PCAMBIA1300載體的農(nóng)桿菌菌落，接入到含有50mg/L卡 那霉素和50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)，得到0D600為0. 8-1. 0的菌 液；取培養(yǎng)好的菌液lml離心收集菌液，用含200 y M乙酰丁香酮的侵染液重懸菌液，使重懸 后的菌液0D600達到0.02,即得步驟（2)中所述含農(nóng)桿菌菌液的侵染液。
[0022] 其中，含200 y M乙酰丁香酮的侵染液的組成為：MS培養(yǎng)基+lmg/L煙酸+lmg/L鹽 酸吡哆醇+l〇mg/L鹽酸硫脘素+0. lg/L肌醇+3. 9g/L 2- (N-嗎啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解 酪蛋白；蔗糖30g/L ;pH 5. 5;高壓滅菌冷卻至55°C時加入乙酰丁香酮至終濃度為200 yM。
[0023] YEP液體培養(yǎng)基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化鈉。
[0024] 優(yōu)選地，步驟（2)中在侵染液中侵染的時間為5-10min。
[0025] 步驟（2)中共侵染時的振蕩速度為80rpm。
[0026] 優(yōu)選地，共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+lmg/L煙酸+lmg/L鹽酸吡哆醇+10mg/L鹽 酸硫脘素+〇. lg/L肌醇+3. 9g/L 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8 ;高壓滅菌冷卻至55°C時加入乙酰丁香酮至終濃度為 200 y M〇
[0027] 共培養(yǎng)時的培養(yǎng)條件為：將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；將 愈傷組織置于有一張無菌濾紙的共培養(yǎng)基上，24~26 °C (優(yōu)選25 °C )暗培養(yǎng)2~4 (優(yōu)選 3)天。
[0028] 優(yōu)選地，步驟（3)中在利用選擇培養(yǎng)基進行兩輪篩選。
[0029] 進一步優(yōu)選地，選擇培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8 ;第一 輪篩選的選擇培養(yǎng)基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二輪篩選 的選擇培養(yǎng)基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。
[0030] 更進一步優(yōu)選地，每輪篩選的周期為20天。
[0031] 選擇培養(yǎng)前先用無菌水清洗5-6次，再用含300mg/L的羧卞青霉素的無菌水清洗 2遍；然后在無菌濾紙上晾干。
[0032] 優(yōu)選地，分化培養(yǎng)條件：將選擇培養(yǎng)后的抗性愈傷移至分化培養(yǎng)基上，放入恒溫 (25±1°C )培養(yǎng)室中，光照時間16小時，光照強度為12001x，相對濕度為60±2%，培養(yǎng)40 天后可誘導出不定芽。
[0033] 分化培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0? 5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0? 05mg/L萘乙酸；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8。
[0034] 優(yōu)選地，生根培養(yǎng)條件：將分化出來的不定芽分成的單株接種到生根培養(yǎng)基上，放 入恒溫（25±1°C )培養(yǎng)室中，光照時間16小時，光照強度為12001x，相對濕度為60±2%， 10天后形成完整植株。
[0035] 生根培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基+0? 4mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/ L ；pH 5. 8〇
[0036] 對獲得的完整植株進行陽性苗PCR檢測：將獲得的所得的轉(zhuǎn)35S啟動子和hpt基 因的植株進行PCR檢測。
[0037] 陽性苗PCR檢測方法是：用CTAB法提取T。代轉(zhuǎn)基因荻株系的基因組DNA，以35S 啟動子序列為模板設計引物，擴增得到238bp(SEQ ID N0:1)片段，引物序列如下：
[0038]正向引物35SU:5' -TCCATCTTTGGGACCACTGT-3'（SEQ ID N0 :3)
[0039]反向引物35SL:5' -CGACACTCTCGTCTACTCCA-3'（SEQ ID NO :4)
[0040] 以hptll基因序列為模板設計引物，擴增得到373bp(SEQ ID NO :2)片段，引物序 列如下：
[0041]正向引物hptU:5' -GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATC-3'（SEQ ID N0 :5)
[0042]反向引物hptL:5' -CATAACAGCGGTCATTGACTGGAGC-3'（SEQ ID NO :6)。
[0043] 本發(fā)明的方法用于培育荻轉(zhuǎn)基因植株。為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育荻抗逆新品種奠定 了基礎。
[0044] 本發(fā)明的有益效果：
[0045] 1、本發(fā)明在國內(nèi)外首次利用農(nóng)桿菌介導荻成熟種子愈傷組織轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植 株，為今后荻的遺傳改良培育抗逆種質(zhì)資源提供了新的技術(shù)平臺。利用農(nóng)桿菌介導荻成 熟種子愈傷組織轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株相對于其他傳統(tǒng)方法，具有費用低、拷貝數(shù)低、重復性 好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點。
[0046] 2、本發(fā)明的受體材料易于獲得，實驗不受季節(jié)限制。在種子成熟期，可收集大量的 種子于4°C保存油種子誘導出的胚性愈傷，增值率高。
[0047] 3、本發(fā)明從種子誘導胚性愈傷到獲得完整轉(zhuǎn)基因植株需要5個月，操作方便，再 生率高達30. 2%。
[0048] 4、荻為單子葉植物，本發(fā)明通過誘導愈傷進行侵染，優(yōu)化得到誘導荻愈傷的培養(yǎng) 基，采用農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，大大的提高了轉(zhuǎn)化效率。
【附圖說明】
[0049] 圖1是本發(fā)明應用的表達載體PCAMBIA1300的物理圖譜。
[0050] 圖2 :是本發(fā)明實施例中米用荻成熟種子誘導的胚性愈傷。
[0051]圖3是本發(fā)明實施例中胚性愈傷的不同狀態(tài)：圖3A在第一輪選擇培養(yǎng)基上的抗性 愈傷；圖3B在第二輪選擇培養(yǎng)基上的抗性愈傷；圖3C是抗性愈傷分化20天后的狀態(tài)；圖 3D是抗性愈傷分化30天后的狀態(tài)；圖3E是分化出的植株不定芽增殖的狀態(tài)；圖3F是不定 芽生根的狀態(tài)。
[0052] 圖4是T0代植株35S啟動子PCR鑒定示意圖。
[0053] 圖5是T0代植株hptll基因PCR鑒定示意圖。
【具體實施方式】
[0054] 為了進一步闡明本發(fā)明，以下結(jié)合實例加以說明。
[0055] 實施例1荻成熟種子胚性愈傷的誘導和繼代
[0056] 1)種子的收集：荻的成熟種子于2013年11月采于浙江臨安大明山景區(qū)，采回后 連帶花序烘干置于4°C保存。
[0057] 2)種子的消毒：將荻種子的外殼剝?nèi)?，選取健壯成熟的種子裝入1. 5mL離心管中 進行消毒處理。過程如下：向裝有種子的離心管中加入lmL75%的乙醇，上下顛倒試管30s 后倒掉酒