一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效玉米骨干自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效玉米骨干自交系遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米(Zeamays L.)是重要的糧食、飼料作物，也是現(xiàn)代工業(yè)的重要原料。隨著畜牧業(yè)、工業(yè)的發(fā)展以及世界人口的增長(zhǎng)，玉米在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有越來越重要的地位，1998年以來，玉米已超過水稻和小麥成為全球第一大作物。建國(guó)以來，我國(guó)玉米播種面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)量都呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，2002年我國(guó)玉米播種面積超過小麥而僅次于水稻，玉米單產(chǎn)由1123.lkg/hm2增加到5394.0公斤/公頃，超過世界玉米平均單產(chǎn)水平，2006年玉米總產(chǎn)量達(dá)到1.45億噸，2015年玉米總產(chǎn)達(dá)到2.25億噸，單產(chǎn)為5891.9公斤/公頃。盡管我國(guó)玉米的總產(chǎn)和單產(chǎn)得到了大幅度提升，但與美國(guó)等玉米生產(chǎn)大國(guó)還存在較大差距。據(jù)相關(guān)研究推測(cè)，到2020年世界玉米需求量將達(dá)到7.53億噸，屆時(shí)中國(guó)玉米需求量為2.5億噸。因此，在種植面積難以進(jìn)一步擴(kuò)大的情況下，玉米總需求量的不斷攀升使得玉米生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。
[0003]1996至今，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物總面積的百分比穩(wěn)定增長(zhǎng)。目前，轉(zhuǎn)基因玉米農(nóng)藝性狀改良主要涉及抗除草劑、抗蟲、抗病、抗旱和品質(zhì)改良等，商業(yè)化種植面積較多的是抗除草劑、抗蟲和二者復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米。毫無疑問，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越重要的作用。
[0004]高效植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn):轉(zhuǎn)化體系穩(wěn)定;轉(zhuǎn)化效率高;轉(zhuǎn)化方法受基因型限制少，且便于操作;受體組織具有較強(qiáng)的分化和再生能力；。上世紀(jì)90年代，玉米的轉(zhuǎn)基因研究迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因方法也出現(xiàn)了多樣化。植物轉(zhuǎn)基因方法主要分為兩大類:一是DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化，包括基因槍轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇(PEG)法、電激穿孔法、超聲波介導(dǎo)法、碳化硅纖維介導(dǎo)法、花粉管通道法和顯微注射法等;二是載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，如農(nóng)桿菌法等。基因槍轉(zhuǎn)化法法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在玉米轉(zhuǎn)基因上應(yīng)用的較為成功，目前生產(chǎn)上所推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)化體以及已經(jīng)發(fā)表的科研論文中所使用的轉(zhuǎn)化方法90%以上是由農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化法。
[0005]玉米的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料類型包括:
[0006](I)原生質(zhì)體:Lusardi (1994)利用PEG法成功轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。原生質(zhì)體作為受體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化頻率相對(duì)較高。缺點(diǎn)是分離和再生植株較為困難，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)，限制了其應(yīng)用與發(fā)展。
[0007](2)懸浮細(xì)胞系:懸浮細(xì)胞系由均一小細(xì)胞團(tuán)組成，易大量獲得，便于轉(zhuǎn)化體的篩選，常用于基因槍轉(zhuǎn)化利用懸浮培養(yǎng)物為受體材料豐富，植株再生相對(duì)容易。但懸浮細(xì)胞系的建立耗時(shí)長(zhǎng)，且長(zhǎng)時(shí)期的繼代培養(yǎng)可能使細(xì)胞喪失再生能力或產(chǎn)生變異。
[0008](3)外植體:花藥、幼穗、幼胚、芽尖、子房、花粉等都可以作為外植體。幼胚是應(yīng)用較成功的外植體之一。幼胚易于產(chǎn)生胚性愈傷組織，且植株分化再生也較容易。盡管其轉(zhuǎn)化頻率可能低于胚性愈傷組織和胚性懸浮細(xì)胞系，但在分化和再生上優(yōu)勢(shì)明顯，轉(zhuǎn)化體獲得容易。但受體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化后代群體較大，需要簡(jiǎn)便可靠的篩選方法。
[0009](4)胚性愈傷組織:玉米幼胚培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織有較強(qiáng)的繼代能力和植株再生能力，是目前應(yīng)用最廣泛的受體材料。胚性愈傷組織具有操作簡(jiǎn)單，可避開原生質(zhì)體分離再生的困難的優(yōu)點(diǎn)。但胚性愈傷組織的產(chǎn)生基因型依賴嚴(yán)重，限制了其應(yīng)用范圍。
[0010]以我國(guó)玉米骨干自交系或優(yōu)良自交系為代表的基因轉(zhuǎn)化平臺(tái)研究具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。魏開發(fā)(2009)為了建立玉米高頻再生及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)影響玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)的11個(gè)因素及影響胚性愈傷分化的9個(gè)因素用正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，基因型對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)有極顯著影響。在整合后的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系中，玉米自交系黃早4以抗性愈傷率為指標(biāo)的GUS基因穩(wěn)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.6%，而沒有獲得玉米自交系金黃96B、GY237和海921 的轉(zhuǎn)化體。Ishida等(1996)用攜帶 intron-uidA 和bar(phosphinothricin acetyl trans-f erase，PPT，乙酉先車專移酉每)或hpt (hygromycinphospho-transferase，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因的超雙元載體的農(nóng)桿菌LBA4404侵染玉米自交系A(chǔ)188幼胚，通過對(duì)載體菌株組合、菌液濃度、幼胚發(fā)育階段等各種因素優(yōu)化，獲5%?30 %轉(zhuǎn)化率(獨(dú)立轉(zhuǎn)化體/幼胚數(shù))，而其它5種供試自交系(Wl 17，W59E，A554，W153R和H99)未獲得轉(zhuǎn)化體。
[0011 ]自交系X178為玉米骨干自交系之一，其為農(nóng)大108的母本，不但有較好的配合力，而且其對(duì)銹病、粗縮病、莖腐病等病害具有較好的抗性。綜31是我國(guó)重要的骨干自交系，是多個(gè)雜交種的親本，該自交系已經(jīng)獲得國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。對(duì)于自交系X178和綜31來說，目前尚無高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法被公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明所要解決的問題是如何對(duì)生產(chǎn)上能夠大面積應(yīng)用的玉米骨干自交系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
[0013]為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0014]本發(fā)明所提供的玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化方法，可包括如下步驟:
[0015](I)將含有目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；
[0016](2)取步驟(I)得到的重組農(nóng)桿菌，對(duì)玉米自交系的外植體進(jìn)行侵染；
[0017](3)完成步驟(2)后，取所述外植體，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行共培養(yǎng)；
[0018](4)完成步驟(3)后，取所述外植體，置于恢復(fù)培養(yǎng)基I，進(jìn)行初次恢復(fù)培養(yǎng)；
[0019](5)完成步驟(4)后，取所述外植體，依次在篩選培養(yǎng)基I和篩選培養(yǎng)基Π上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織；
[0020](6)完成步驟(5)后，取所述抗性愈傷組織，置于恢復(fù)培養(yǎng)基Π，進(jìn)行二次恢復(fù)培養(yǎng)；
[0021](7)完成步驟(6)后，取所述抗性愈傷組織，置于分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得幼苗；
[0022](8)完成步驟(7)后，取所述幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得玉米自交系轉(zhuǎn)化苗。
[0023]所述步驟(3)中，每IL所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基可包括:MS鹽3.90?4.80g(例如3.90?4.338或4.33?4.8(^或3.9(^或4.338或4.8(^)、煙酸1.2?1.411^(例如1.2?1.311^或1.3?1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VBi0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或
0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸|丐0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或
0.23mg或0.25mg或0.28mg)、鹽酸硫胺0.45?0.55mg(例如0.45?0.50mg或0.50?0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0?33.0g(例如27.0?30.0g或30.0?33.0g或27.0g或30.(^或33.(^)、1^-脯氨酸1.24?1.528(例如1.24?1.388或1.38?1.528或1.248或1.388或I.52g)、2，4_D 0.45?0.55mg(例如0.45?0.50mg或0.50?0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg) N 6-BA 0.009?0.01 Img (例如0.009?0.0I Omg或0.010 ?0.01 Img或0.009mg或0.0lOmgS0.01 lmg)、植物凝膠3.15?3.85g(例如3.15?3.5g或3.5?3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)和90?I 1ymol (例如90?10ymoI或 100?I 1ymoI或90ymol或10ymoI或110μmol)乙酰丁香酮。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的溶劑可為水。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值可為5.4?6.0(例如5.4?5.7或5.7?6.0或5.4或5.7或6.0)。
[0024]所述步驟(3)中，每IL所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基具體可由如下組分組成:MS鹽4.33g、煙酸
1.3mg、VB1.25mg、VBe0.25mg、泛酸|丐0.25mg、鹽酸硫胺0.5Omg、鹿糖30.0g、L-脯氨酸 I.38g、
2.4-D0.50mg、6-BA 0.0lmg、植物凝膠3.5g、乙酰丁香酮10ymoI，其余為水。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值具體可為5.7。
[0025]所述步驟(4)中，每IL所述恢復(fù)培養(yǎng)基I可包括:MS鹽3.90?4.80g(例如3.90?4.338或4.33?4.8(^或3.9(^或4.338或4.8(^)、煙酸1.2?1.411^(例如1.2?1.311^或1.3?
1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VBi0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸|丐0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或
0.23mg或0.25mg或0.28mg)、鹽酸硫胺0.45?0.55mg(例如0.45?0.50mg或0.50?0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0?33.0g(例如27.0?30.0g或30.0?33.0g或27.0g或30.(^或33.(^)、1^-脯氨酸1.24?1.528(例如1.24?1.388或1.38?1.528或1.248或1.388或I.52g) N 2,4-D 0.45 ?0.55mg (例如0.45 ?0.50mg 或 0.50 ?0.55mg 或 0.45mg 或 0.50mg 或
0.55mg) N 6-BA 0.009?0.01 Img (例如0.009?0.0I Omg或0.010 ?0.01 Img或0.009mg或0.0lOmgS0.01 lmg)、植物凝膠3.15?3.85g(例如3.15?3.5g或3.5?3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90?11Omg(例如90?10mg或 100?I 1mg或90mg或 10mg或 I 1mg)和AgN033.I?3.7mg(例如3.I?3.4g或3.4?3.7g或3.Ig或3.4g或3.7g)。所述恢復(fù)培養(yǎng)基I的溶劑可為水。所述恢復(fù)培養(yǎng)基I的PH值可為5.4?6.0 (例如5.4?5.7或5.7?6.0或5.4或5.7或6.0)。
[0026]所述步驟(4)中，每IL所述恢復(fù)培養(yǎng)基I具體可由如下組分組成:MS鹽4.33g、煙酸
1.3mg、VB1.25mg、VBe0.25mg、泛酸|丐0.25mg、鹽酸硫胺0.5Omg、鹿糖30.0g、L-脯氨酸 I.38g、
2.4-D0.50mg、6-BA 0.01mg、植物凝膠3.5g、特美汀10011^和48勵(lì)33.4g，其余為水。所述恢復(fù)培養(yǎng)基I的pH值具體可為5.7。
[0027]所述步驟(5)中，每IL所述篩選培養(yǎng)基I可包括:MS鹽3.90?4.80g(例如3.90?4.338或4.33?4.8(^或3.9(^或4.338或4.8(^)、煙酸1.2?1.411^(例如1.2?1.311^或1.3?
1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VBi0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或
0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸|丐0.23?0.28mg(例如0.23?0.25mg或0.25?0.28mg或
0.23mg或0.25mg或0.28mg)、鹽酸硫胺0.45?0.55mg(例如0.45?0.50mg或0.50?0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0?33.0g(例如27.0?30.0g或30.0?33.0g或27.0g或30.(^或33.(^)、1^-脯氨酸1.24?1.528(例如1.24?1.388或1.38?1.528或1.248或1.388或I.52g) N 2,4-D 0.45 ?0.55mg (例如0.45 ?0.50mg 或 0.50 ?0.55mg 或 0.45mg 或 0.50mg 或0.55mg) N 6-BA 0.009?0.01 Img (例如0.009?0.0I Omg或0.010 ?0.01 Img或0.009mg或0.0lOmgS0.01 lmg)、植物凝膠3.15?3.85g(例如3.15?3.5g或3.5?3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90?I 1mg(例如90?10mg或 100?I 1mg或90mg或10mg或I 1mg)、雙丙氛勝I.35?I.65mg(例如I.35?1.5mg或I.5?I.65mg或1.35mg或1.5mg