一株防治植物根癌病的蒼白桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)、林和園藝作物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及防治植物根癌病病的生防 細(xì)菌及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 根癌病是由根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的一種常見細(xì)菌性 病害。根癌土壤桿菌的寄主范圍很廣,能侵染93科、331屬的643種植物(DeCleene,et al.,1981)。在歐洲、北美、南非及亞洲等一些國家普遍發(fā)生。而在我國較為嚴(yán)重的根癌病 發(fā)生區(qū)域?yàn)楹颖薄⑸綎|、遼寧、河南、湖北、江蘇等省區(qū)(馬德飲和王慧敏,1995)。其中核果 類、漿果類、仁果類、堅(jiān)果類果樹以及一些林木和花卉受害較為嚴(yán)重,桃樹幼苗受害后早衰, 植株矮化,甚至死亡;成齡樹感染此病后會生長不良、樹勢變?nèi)?、果?shí)小、產(chǎn)量低、樹齡縮短 (尹玲莉,2009),造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對根癌病最有效的防治措施是輪作和生物防 治。但許多果園或苗圃無法實(shí)行常年輪作。提前使用生物菌劑是降低病原菌進(jìn)入植物體內(nèi) 并干擾其代謝的有效措施。本技術(shù)投入低、效率高,是一項(xiàng)農(nóng)民認(rèn)可的、可操作強(qiáng)的農(nóng)產(chǎn)品 生產(chǎn)技術(shù)。
[0003] 因根癌土壤桿菌具有三種不同的生物型,其中III型為A.vitis,一般只侵染葡 萄;而I型和II型根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)可侵染多種核果類和堅(jiān)果類果樹以及 其他林木、花卉和雙子葉植物,危害更為廣泛。前人研究報(bào)道對核果類果樹根癌病有效的 生防菌對葡萄根癌病防效較差,而對葡萄根癌病有效的生防菌對核果類果樹根癌病防效也 比較差。目前僅生防菌1^84(厶.抑(1;[(^&(^61')(1(61'1',1972,]\1〇〇代6七311979)或1(1026 已 經(jīng)在澳大利亞和美國登記注冊(商品名為Nogall)。已報(bào)道的其他生防菌株還有:防治桉 樹根癌病的根癌土壤桿菌無毒株D286 (Hendson,1983)、防治葡萄根癌病的生防菌E26 (A. vitis)(梁亞杰等 1990)、HLB_2(A.radiobacter) (Pu&Goodman,1993 ;游積峰等,1990)和 MI15(A.radiobacter)(謝學(xué)梅等,1984)、防治櫻桃和梨根癌病的生防菌UHFBA-8和11 (A. radiobacter) (Gupta等,2010)。上述生防菌都屬于土壤桿菌屬細(xì)菌,其他屬生防菌還有菌 根真菌(宋福強(qiáng)等,2005)、放線菌(梁靜等,2008 ;季敬霖等,2011)、假單孢菌(張春明等, 1988,1991)、芽孢桿菌提取物(Hammami等,2009)等,但未商品化。因此針對在果樹和其他 植物上發(fā)生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病,獲得具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的生防菌 及其無細(xì)胞制劑對根癌病的防控具有重要的實(shí)際意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種防治植物根癌病的拮抗細(xì)菌,該拮抗細(xì)菌分離于山東 省泰安市桃樹根際,對根癌病菌A.tumefaciens具有明顯的措抗作用,并抑制根癌病菌 A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的可抑制根癌病發(fā)生的拮抗細(xì)菌的用途,其用途 是防治由A.tumefaciens引起的植物根癌病。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007] 本發(fā)明提供的一株根癌病拮抗菌,其特征在于,該拮抗菌的分類命名為蒼白桿菌 (Ochrobactrumoryzae),于2014年9月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC),其保藏編號為CGMCCNo. 9634。
[0008] 該拮抗菌(2#)經(jīng)形態(tài)、生理生化和16SrDNA序列同源性分析鑒定為蒼白桿菌 Ochrobactrumoryzae,2#菌株在ρΗ7· 0-7. 5,溫度28_35°C生長良好,可利用多種碳源生長。
[0009] 采用平板拮抗法測定該菌株的抗菌性能,發(fā)現(xiàn)2#菌株在YEB培養(yǎng)基上并不抑制根 癌土壤桿菌A.tumefaciens的生長,但菌體生長速度很快,菌落粘稠。分別以向日葵和番爺 作為感病植物,采用生物測定的方法,測定2#菌株對A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤 的抑制作用,結(jié)果表明:將lOkfuml1的2#菌株的菌懸液和A.tumefaciens菌懸液以10 : 1 的體積比混和,接種向日葵7天后,調(diào)查結(jié)果表明,2#菌株處理可顯著抑制根癌瘤的形成,對 根癌病的防效為78. 1%。將100ml濃度為106cfuml1的2#菌株菌懸液提前澆灌番茄苗, 1天后燒灌同樣體積同樣濃度的A.tumefaciens菌懸液,可大大降低番爺上根癌瘤的形成, 防效為94. 9%。
[0010] 本發(fā)明的可防治植物根癌病的蒼白桿菌的篩選:
[0011] 采集泰安桃園中桃樹的根、莖和根際土,采用選擇性培養(yǎng)基(NewKerr培養(yǎng)基), 稀釋涂布法對細(xì)菌進(jìn)行分離。采用virD2A/virD2C引物5'-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3', 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3'(Hass,.etal.,1995)和Tip6F/Tip6R引物: 5' -GGTCTAATGCGCAGAGGTGT-3, 5' -CGGCTCAAGGATTAGACAGG-3' (Yakabe,2012),對所分離細(xì) 菌的vir區(qū)及T-DNA區(qū)進(jìn)行測定,選擇未擴(kuò)增到224bp和243bp目的片段的菌株作為非致 病待測菌株。將A.tumefaciens菌懸液加入YEB培養(yǎng)基,然后點(diǎn)接待測菌株,28°C培養(yǎng)72h 后,發(fā)現(xiàn)一株不產(chǎn)生抑菌圈,但落顏色不同于前人報(bào)道的根癌土壤桿菌,而且生長迅速的菌 株。因該菌可在選擇性培養(yǎng)基上生長,與根癌土壤桿菌的營養(yǎng)需求有相同之處,因此認(rèn)為是 一株有潛力的拮抗菌,將該菌株定名為2#。以向日葵為感病植物,采用將在NB培養(yǎng)液中培 養(yǎng)的2#菌株的菌懸液和A.tunefaciens菌懸液(106cfuml^以體積比10 :1的比例混和后 接種的方法,測定2#菌株對A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用,接種7天 后,調(diào)查發(fā)現(xiàn)2#菌株處理比單獨(dú)接種A.tumefaciens的向日葵苗上根癌瘤明顯減少,癌瘤 變小,對根癌病的防效可達(dá)到78. 1%。以番茄為感病植物,模擬田間種植模式,在中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊基地對2#菌株的防病效果進(jìn)行了確認(rèn)。在番茄移栽時(shí),劃傷番 茄幼苗莖基部,用濃度為l〇6cfuml1的2#菌株的菌懸液蘸根,每株番茄苗再澆灌100ml,1 天后澆灌同樣體積同樣濃度的A.tumefaciens菌懸液,2個(gè)月后調(diào)查,發(fā)現(xiàn)2#菌株菌懸液處 理可大大降低番茄莖基部根癌瘤的形成,癌瘤直徑大幅度減小,防效為94. 9%。
[0012] 所述的細(xì)菌vir區(qū)的擴(kuò)增體系(總體積:25· 0μL)為:DNA模板0· 6μL( < 1μg)、 上下游弓丨物(5pmol/yL)各 1.0yL、10X緩沖液 2.5yL、dNTPMixture(2.5mM each) 1· 5μL、Taq聚合酶(2. 5u/μL) 0· 5μL、超純水 18. 0μL〇
[0013]PCR擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性