一種煙草甾醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bHLH93基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)煙草留醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 bHLH93基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物留醇是生物膜系統(tǒng)的重要組成成分，其除了調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還能響應(yīng) 多種生物和非生物脅迫。煙草中常見(jiàn)的留醇類物質(zhì)主要有膽留醇、菜油留醇、豆留醇和 谷留醇等。植物留醇經(jīng)由異戊二烯代謝途徑合成，目前煙草中對(duì)于留醇調(diào)控的研究主要 集中在異戊二烯代謝途徑中編碼關(guān)鍵酶的基因上，對(duì)于調(diào)控留醇合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子研究 的較少。所以探尋煙草中留醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于進(jìn)一步研究留醇合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有 著重要的意義。
[0003] 目前研究植物功能基因主要方法有通過(guò)根癌農(nóng)桿菌穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化和通過(guò)RNA 病毒介導(dǎo)瞬時(shí)基因沉默系統(tǒng)（VIGS)。由于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)周期較長(zhǎng)，并且獲得的轉(zhuǎn)基因植株 往往含有一個(gè)或多個(gè)的外源基因拷貝，所以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳的方法獲得的轉(zhuǎn)基 因植株外源基因的表達(dá)往往不穩(wěn)定。利用病毒介導(dǎo)VIGS技術(shù)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后基因 沉默技術(shù)，其可以快速高效的對(duì)目的基因進(jìn)行沉默。目前由煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)介導(dǎo)的VIGS在馬鈴薯、棉花及煙草等草本植物中都有廣泛的應(yīng)用。煙草作為 重要的模式植物，留醇合成的研究對(duì)于其他植物也具有重要的借鑒意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種煙草留醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bHLH93基因及其在調(diào)控葉 片中甾醇含量的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] -種煙草留醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bHLH93基因，所述bHLH93基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
[0007] 所述bHLH93基因是通過(guò)同源克隆的方法得到的。
[0008] -種煙草留醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bHLH93基因在調(diào)控?zé)煵萘舸己恐械膽?yīng)用，基 于bHLH93基因序列，根據(jù)干擾載體引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建煙草bHLH93基因干擾載 體，并通過(guò)VIGS (virus induced gene silencing)實(shí)驗(yàn)鑒定該轉(zhuǎn)錄因子的功能，發(fā)現(xiàn)其可 以調(diào)控葉片中甾醇的含量。
[0009] 所述煙草NtbHLH93基因干擾載體是由酶切后的bHLH93基因 PCR片段和TRV2病 毒空載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，并測(cè)序驗(yàn)證而得。
[0010] 所述PCR所用引物為：
[0011] NtbHLH93-VIGS 上游引物如 SEQ ID NO :2 所示；
[0012] NtbHLH93-VIGS 下游引物如 SEQ ID NO :3 所示。
[0013] 所述酶為兩種限制性內(nèi)切酶Nco I和Sac I。
[0014] 所述VIGS實(shí)驗(yàn)是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒侵染實(shí)現(xiàn)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的基因 NtbHLH93被沉默后，煙草葉片中留醇特 別是豆留醇的含量明顯降低，其含量的降低，可作為煙草留醇調(diào)控領(lǐng)域的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為基因 NtbHLH93沉默表型圖，其中Con為注射侵染緩沖液的對(duì)照，TRV為注 射攜帶TRV2空載體菌液的對(duì)照；NtbHLH93為攜帶NtbHLH93基因 TRV2載體菌液的試驗(yàn)組。
[0017] 圖2為基因 NtbHLH93在VIGS體系中基因表達(dá)量，其中Con為注射侵染緩沖液的 對(duì)照；TRV為注射攜帶空載體菌液的對(duì)照；NtbHLH93為注射攜帶目的基因菌液的試驗(yàn)組。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0019] -、煙草總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0020] 1.提取移栽后4周的紅花大金元葉樣品的總RNA用于基因克隆，提取RNA所用的 研缽、藥勺等均用95%酒精灼燒后使用。提取RNA所用的離心管和槍頭等均是無(wú) RNase產(chǎn) 品（AXYGEN)〇
[0021] 總RNA的提取按照Gene Answer RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的提取步驟進(jìn)行。
[0022] (1)取準(zhǔn)備好的煙草幼葉樣品（IOOmg)，在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨徹底，轉(zhuǎn)移到 I. 5ml離心管中；
[0023] (2)待液氮?jiǎng)倱]發(fā)完后，加入500 μ I RLT和50 μ I PLANTaid，劇烈渦旋混勾，并在 56°C 溫育 3min ;
[0024] (3)將裂解液13000rpm離心5-10min，取上清380 μ L，加入190 μ L無(wú)水乙醇，吹打 混合均勻；將混合液全部轉(zhuǎn)移到吸附柱RA上，13000rpm離心2min ;
[0025] (4)加入350 μ L RWl洗脫液，室溫放置lmin，13000rpm離心lmin，棄濾液；
[0026] (5)加 DNase I 工作液 80 μ L 于膜中央，22°C，酶解 15min ;
[0027] (6)加入350 μ L RWl洗脫液，13000rpm離心lmin，棄去收集管；
[0028] (7)將離心柱轉(zhuǎn)移到新的21111收集管上，加入50(^1^1^液，13000印111離心308，棄 濾液；
[0029] (8)加入500 μ L RW液到離心柱上，最大轉(zhuǎn)速離心2min，13000rpm離心lmin，棄濾 液，空管13000rpm離心2min ;
[0030] (9)小心移去離心管，把離心柱連接到新的I. 5ml收集管上，加入30 μ L無(wú) RNase 水（70°C )，室溫靜置2min，1000 Orpm離心lmin，洗脫RNA ;-80°C保存提取的RNA。
[0031] 2.煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0032] 使用寶生物 Prime ScripiiC 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第二鏈，反應(yīng)體系如表1所示：
[0033] 表1反轉(zhuǎn)錄體系
[0034]
[0035] 模板RNA與01 igo dT充分混合70 °C變性5分鐘，后迅速置于冰上冷卻5分鐘，并 加入一定體積的5XRT buffer、dNTP、雙蒸H2O和AMV，反應(yīng)條件：42°C保溫lh，放入75°C溫 育15分鐘滅活A(yù)MV逆轉(zhuǎn)錄酶，迅速取出置于冰上驟冷，終止cDNA第一鏈的合成，用于下一 步的PCR反應(yīng)，剩余的cDNA保存于-20°C備用。
[0036] 二、bHLH93基因的同源克隆
[0037] 通過(guò) Blast 分析（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)得到兩條與擬南芥及番 茄bHLH93相似的煙草EST序列（GenBank登錄號(hào)：FS420134和AM805227)，并對(duì)兩條EST序 列進(jìn)行拼接。根據(jù)基因的序列設(shè)計(jì)3對(duì)長(zhǎng)度為20bp左右的特異引物（?1、？213)，分別為：
[0038] Pl 上游引物：5' -GATAGAGCCATTGTGGAGGA-3'，
[0039] Pl 下游引物：5,-CTACATCAAACTTTGGAGGG-3' ；
[0040] P2 上游引物：5, -TCTATTCACTTTTTGACGTT-3'，
[0041] P2 下游引物：5' -GATCTTCACGCAACCTGTG-3' ；
[0042] P3 上游引物：5, -ATGGAGCTCACTCAACAGG-3'，
[0043] P3 下游引物：5' -GCTCATGCGGCCGCTACAG-3'。
[0044] PCR反應(yīng)體系25 μ L，包括一定體積的雙蒸H20 9. 7 μ UPremixTaq 12. 5 μ L、上游 引物0. 4 μ L、下游引物0. 4 μ L和cDNA 2 μ L。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s， 58°(：退火3〇8,72°(：延伸60~9〇8,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保溫。
[0045] 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒（TaKaRa公司）回收目的基因。將 回收產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T (TaKaRa公司）上；轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5a)感受態(tài)細(xì)胞 中，37°C培養(yǎng)，菌落PCR鑒定得到陽(yáng)性克隆。利用小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校?