玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]玉米(Zeamays)是世界上種植面積最大并且產(chǎn)量最高的禾本科作物之一，大多用于動物飼料，食物以及工業(yè)原料，在工農(nóng)業(yè)中均有著廣泛的應(yīng)用。玉米對于現(xiàn)代社會的發(fā)展起到了重要作用。但玉米蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的儲藏蛋白醇溶蛋白中賴氨酸和色氨酸嚴重缺乏。有研究表明，低含量的醇溶蛋白以及粉質(zhì)的胚乳會增加非醇溶蛋白的積累，從而顯著改善玉米籽粒中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)。
[0003]0paque2 (02)是一個含有bZIP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。在生化成分中，o2突變體籽粒相對野生型表現(xiàn)出了粉質(zhì)的胚乳以及低含量的醇溶蛋白，因此其賴氨酸和色氨酸積累量較野生型有大幅提高。所以，o2是一個著名的籽粒高賴氨酸突變體。目前研究表明，轉(zhuǎn)錄因子0paqUe2可以調(diào)控絕大部分醇溶蛋白的表達。從02克隆至今，人們找到了一些和02互作的蛋白，如:？8?、0即1/0即2、60肥，211^&1丨1丨11等。但是對于02在玉米籽粒發(fā)育中具體的調(diào)控機制依然未得到完全解析。
[0004]鑒于02本身轉(zhuǎn)錄因子的分子結(jié)構(gòu)以及其調(diào)控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人們普遍認為02是一個在籽粒發(fā)育中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。尋找其他與02互作的蛋白從而進一步解釋醇溶蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于人們改進玉米蛋白品質(zhì)具有極為重要的意義。一般來講，研究蛋白互作的方法包括酵母雙雜，Pu 11-down以及免疫共沉淀(Co IP)等實驗。
[0005]酵母雙雜實驗是基于酵母體系篩潛在互作蛋白的方法。該實驗可以大范圍地篩選出可能存在直接互作的兩個蛋白。但其背景信號較高，會有一些假陽性情況出現(xiàn)。
[0006]Pull-down與免疫共沉淀是基于免疫沉淀和Western技術(shù)發(fā)展來的體外以及體內(nèi)檢測蛋白互作的技術(shù)。該技術(shù)通過抗體的特異性吸附以及互作蛋白之間的相互物理性結(jié)合來進行互作驗證。該實驗方法相對于酵母雙雜可以大幅降低背景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于提供一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因的應(yīng)用。
[0009]為達到上述目的，本發(fā)明具體涉及到的方面為:
一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因，其特征在于所述基因為SEQ ID NO:1所示的堿基序列。
[0010]—種載體，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因。
[0011 ] 一種質(zhì)粒，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體。
[0012]一種克隆上述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:首先獲得均一化的玉米籽粒cDNA片段，將該cDNA片段與雙雜載體pGADT7-Rec連接轉(zhuǎn)化，獲得了約1.0 X 16個克隆，選取了包含bZIP結(jié)構(gòu)域以及核定位信號又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的02-2片段，將其連入PGBK-T7載體中，通過PEG/LiAc法將構(gòu)建的庫質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到16個酵母轉(zhuǎn)化子，通過DDO與QDO的篩選，共獲得了50個疑似陽性克隆，對這些克隆質(zhì)粒抽提、測序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個與水稻0sMADS47同源的基因ZmMADS47。
[0013]一種上述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因與0paque2基因相互作用在RNAi轉(zhuǎn)基因沉默過程中的應(yīng)用。
[0014]一種上述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因與0paque2基因相互作用在下調(diào)玉米種19kD醇溶蛋白，22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白含量中的應(yīng)用。
[0015]通過Pull-down和coIP實驗明確了ZmMADS47和02在體外和體內(nèi)都能相互作用。
[0016]通過醇溶蛋白抽提實驗以及對醇溶蛋白基因的定量PCR實驗證明了該基因在轉(zhuǎn)基因沉默后會導(dǎo)致19kD醇溶蛋白、22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白的表達下降。
[0017]本發(fā)明通過RNA干擾的方法獲得一個02互作蛋白ZmMADS47的基因沉默轉(zhuǎn)基因玉米材料，并通過醇溶蛋白抽提，透射電鏡觀察等對轉(zhuǎn)基因材料進行表型分析。通過透射電鏡觀察證明了該基因在轉(zhuǎn)基因沉默后會導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白體體積變小并且不規(guī)則。
[0018]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)植物MIKC類的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47能夠和bZIP類的轉(zhuǎn)錄因子02發(fā)生互作，并且能夠影響醇溶蛋白表達，在細胞學(xué)上對蛋白體的形狀產(chǎn)生影響。為高品質(zhì)玉米的大規(guī)模生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
[0019]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)與02產(chǎn)生蛋白互作的ZmMADS47是一個轉(zhuǎn)錄因子，并且能夠直接結(jié)合部分醇溶蛋白啟動子，令02釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力，一同調(diào)控部分醇溶蛋白的表達。這對于解釋02的具體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制具有極為重要的意義，為o2突變體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供了新的應(yīng)用方向。
【附圖說明】
[0020]圖1是酵母雙雜篩庫中t耳質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖。由于0paque2本身就是一個轉(zhuǎn)錄因子，具有較強的轉(zhuǎn)錄激活能力，所以利用0paque2全長基因篩庫會有很高的自激活背景。因此，根據(jù)Opaque-2的序列特性，將0paque2全長分為三段，選擇第二段02-2(即包括了bZIP結(jié)構(gòu)域又屏蔽了轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)作為餌，和已經(jīng)成功構(gòu)建的庫質(zhì)粒進行篩庫；
圖2是酵母雙雜篩庫獲得的陽性克隆滴板驗證結(jié)果圖。
[0021 ] 圖3是通過GST ?1111_(10￥11實驗驗證2111140347與(^^1162的相互作用。
[0022]圖4是通過免疫共沉淀(coIP)實驗驗證ZmMADS47與0paque2的相互作用。
[0023]圖5是ZmMADS47轉(zhuǎn)基因RNAi載體構(gòu)建示意圖。
[0024]圖6是ZmMADS47 RNAi各個陽性事件籽粒中ZmMADS47在cDNA水平的表達量檢測。
[0025]圖7是ZmMADS47 RNAi 3號與6號事件籽粒中ZmMADS47在蛋白水平的表達量檢測。
[0026]圖8是ZmMADS47RNAi 3號與6號事件中總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的定量檢測。
[0027]圖9是ZmMADS47 RNAi 3號與6號事件中醇溶蛋白抽提的SDS-PAGE檢測。
[0028]圖10是ZmMADS47 RNAi 3號與6號事件中醇溶蛋白抽提的western blot檢測。
[0029]圖11是ZmMADS47RNAi 3號與6號事件種子的形態(tài)特征。雖然醇溶蛋白在這兩個事件中有顯著變化，但是卻并沒有使籽粒的外觀發(fā)生明顯變化。
[0030]圖12是ZmMADS47 RNAi 3號事件未成熟種子的透射電鏡觀察。
[0031]圖13是利用酵母轉(zhuǎn)錄激活體系對ZmMADS47全長以及各個分段的轉(zhuǎn)錄激活能力進行測試。
[0032]圖14是ZmMADS47全長及各分段的亞細胞定位分析。
[0033]圖15是利用ZlA醇溶蛋白啟動子對ZmMADS47的保守DNA結(jié)合序列進行篩選。
[0034]圖16是對篩選出的ZmMADS47所結(jié)合DNA片段進行進一步篩選。
[0035]圖17是對篩選出的ZmMADS47所結(jié)合CATGT結(jié)構(gòu)域以及其周圍堿基的突變掃描。
[0036]圖18是對篩選出的ZmMADS47所結(jié)合CATGT結(jié)構(gòu)域的冷探針競爭。
[0037]圖19是02以及ZmMADS47對19kD、22kD以及50kD醇溶蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄激活能力測試。
[0038]圖20是對02的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域進行缺失后檢測其影響ZmMADS47調(diào)控zIA醇溶蛋白啟動子起始轉(zhuǎn)錄能力的測試。
[0039]圖21是對50kD醇溶蛋白啟動子部分序列進行缺失后對02與ZmMADS47調(diào)控產(chǎn)生的影響進行測試。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實施事例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,3rd ed.)或植物分子生物學(xué)一實驗手冊(Plant Molecular B1logy—A Laboratory Manual, Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0041 ]實施例一:利用酵母雙雜實驗篩選和02有互作的蛋白
首先采取了 SMART方法，獲得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。將該cDNA片段與雙雜載體pGADT7-Rec連接轉(zhuǎn)化，獲得了約1.0X 16個克隆。在餌質(zhì)粒的構(gòu)建中，由于全長02轉(zhuǎn)錄背景較高，因此選取了包含bZIP結(jié)構(gòu)域以及核定位信號又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的02-2片段，參見圖1，將其連入PGBK-T7載體中。
[0042]結(jié)果:通過PEG/LiAc法將構(gòu)建的庫質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到16個酵母轉(zhuǎn)化子。通過DDO與QDO的篩選，共獲得了 50個疑似陽性克隆。對這些克隆質(zhì)粒抽提、測序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個與水稻0sMADS47同源的基因ZmMADS47，參見圖2。
[0043]實施例二:ZmMADS47和02的GST Pull-down蛋白互作驗證。
[0044]I分別取20 yg含有GST_Z