一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 也稱為凋亡素-2 配體 (Apo_2L) ，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子 (TNF)基因超家族成員，屬于II型跨膜蛋白（transmembrane protein)。TRAIL是一個由281 個氨基酸構成的II型跨膜蛋白，其中從第114個精氨酸（arginine)到第281個甘氨酸 (glysine)的序列為誘導癌細胞凋亡的主要功能區(qū)域。它能通過與死亡受體結合選擇性誘 導多種腫瘤細胞與轉化細胞發(fā)生凋亡，而對正常組織和細胞幾乎沒有不良反應。這一特性 使得TRAIL在腫瘤的靶向治療中具有良好的應用前景，被認為是一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ?抗腫瘤因子，近年已成為國內外研究的熱點。但單體結構的TRAIL不能誘導細胞凋亡，把 TRAIL應用到臨床上仍有許多問題亟待解決。為了實現(xiàn)TRAIL誘導細胞凋亡的目的，現(xiàn)有技 術中通過重組TRAIL形成二聚體或多聚體后與死亡受體(DR4，DR5)相結合發(fā)揮細胞凋亡的 作用，但現(xiàn)有技術中針對重組TRAIL的制備方法存在生物活性低、產(chǎn)量低、性質不穩(wěn)定、易變 性等缺點。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一是為解決重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體生物活性低、產(chǎn) 量低、性質不穩(wěn)定、易變性的難題，提供一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方 法，利用PET表達載體對人類TRAIL基因（114-281序列）進行基因克隆制作出具有N-末端組 氨酸標簽(Histidine tag)和異亮氨酸拉鏈基序（Leucine zipper)的TRAIL重組基因 (PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281，簡稱HZ-TRAIL)。本發(fā)明的制備的重組腫瘤壞死因子相 關凋亡誘導配體對抗腫瘤和抗類風濕關節(jié)炎具有高藥效的優(yōu)點。為了達到上述技術效果， 本發(fā)明技術方案包括:一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法，所述制備方 法包括以下步驟：
[0004] 步驟一 :HZ-TRAIL的制備:利用PET表達載體對人類TRAIL蛋白中114-281基因序列 進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAILm-281 的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL;
[0005] 步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng)液中進行擴繁處理，然后將HZ-TRAIL在大 腸桿菌中重組表達，大腸桿菌細胞通過聲波降解法裂解，并離心處理后，取20ml上清液緩慢 注入到鎳-氮三乙酸螯合瓊脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的組氨酸和金屬鎳離子充分吸附，利用 鎳-親和色譜法進行逐步洗脫提取HZ-TRAIL，再經(jīng)凝膠過濾層析法進行純化，保存在-20°C。
[0006] 所述步驟二中的擴繁處理條件為在25~30°C，擴繁6~9個小時。
[0007] 所述步驟二中的離心處理條件為調節(jié)轉速為12000rpm，溫度為4°C，離心處理 20min〇
[0008] 所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0009] 所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳 動物細胞中表達。
[0010] 所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可誘導癌細胞或炎性淋巴細胞 凋亡。
[0011] 所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可應用于抗腫瘤藥物中。所述的 重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可應用于類風濕性關節(jié)炎藥物中。
[0012] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0013] 1、本發(fā)明的一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法可成功制備HZ-TRAIL，且產(chǎn)物活性高、產(chǎn)量高、性能穩(wěn)定、不易變形。
[0014] 2、本發(fā)明的一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法所制備出的HZ-TRAIL可以誘導多種癌細胞的凋亡，而對正常組織和細胞無任何副作用。
[0015] 3、本發(fā)明的一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法所制備出的HZ-TRAIL在RA發(fā)病過程中通過誘導炎性淋巴細胞的凋亡，降低炎癥反應，對關節(jié)起保護作用。
【附圖說明】
[0016] 圖1所示為本發(fā)明一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法的模式 圖。
[0017] 圖2所示為本發(fā)明野生型TRAIL和實施例2制備出的HZ-TRAIL的SDS-PAGE比較圖。 [0018]圖3所示為本發(fā)明制備出的HZ-TRAIL對大腸癌細胞(HCT116)殺傷能力圖。
[0019] 圖4A所示為本發(fā)明HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)凋亡和細胞壞死比例柱狀圖； [0020]圖4B所示為本發(fā)明HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)形態(tài)及顏色變化圖。
[0021]圖5所示為本發(fā)明實施例7建立類風濕關節(jié)炎動物模型和處理藥物流程圖。
[0022]圖6A所示為本發(fā)明實施例7HZ-TRAIL對類風濕關節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度 依賴性發(fā)病率變化圖；
[0023]圖6B所示為本發(fā)明實施例7HZ-TRAIL對類風濕關節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度 依賴性關節(jié)炎臨床指數(shù)的變化圖。
[0024]圖7A所示為本發(fā)明實施例7野生型小鼠（對照組)關節(jié)組織病理圖；
[0025]圖7B所示為本發(fā)明實施例7處理PBS后小鼠（陽性對照組)關節(jié)組織病理圖；
[0026] 圖7C所示為本發(fā)明實施例7處理30yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關節(jié)組織病理圖； [0027] 圖7D所示為本發(fā)明實施例7處理150yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關節(jié)組織病理圖； [0028] 圖7E所示為本發(fā)明實施例7處理300yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關節(jié)組織病理圖。 [0029]圖8A所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質TNF-a 水平的變化圖；
[0030]圖8B所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質IL-Ιβ 水平的變化圖；
[0031 ]圖8C所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質IFN-γ 水平的變化圖；
[0032]圖8D所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質IL-2水 平的變化圖。
[0033]圖9A所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白IgGl 的水平的變化圖；
[0034]圖9B所示為本發(fā)明實施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白 IgG2a的水平的變化圖。
[0035]圖10A所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL抑制炎性淋巴細胞的增殖效果圖；
[0036]圖10B所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL對促炎介質IL-2的表達水平變化圖；
[0037]圖10C所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL對促炎介質IFN- γ的表達水平變化圖。
[0038]圖11Α所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL抑制Jurkat細胞的增殖效果圖；
[0039]圖11B所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL誘導炎性T淋巴細胞凋亡能力圖；
[0040]圖11C所示為本發(fā)明實施例8HZ-TRAIL對凋亡關聯(lián)caspase 3蛋白質的水平變化 圖。
【具體實施方式】
[0041] 下文將結合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中 描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術效果。
[0042] 實施例1
[0043] -種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法，本發(fā)明一種重組腫瘤壞死 因子相關凋亡誘導配體的制備方法的模式圖，包括以下步驟：
[0044] 步驟一 :HZ-TRAIL的制備:利用PET表達載體對人類TRAIL蛋白中114-281基因序列 進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，如圖1所示HZ-TRAIL的制備模式圖； [0045]步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)液在25°C，擴