專(zhuān)利名稱(chēng)：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CIDE-C(cell death-inducing DFF45-like effector C)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽是CIDE家族的一個(gè)新成員。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生命的基本特征之一。它在胚胎發(fā)育、機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)菌與病毒感染細(xì)胞的清除過(guò)程中起重要的作用。許多疾病的發(fā)生與細(xì)胞凋亡失控有關(guān)。如腫瘤、自身免疫綜合癥及持續(xù)的病毒感染與細(xì)胞凋亡減少密切相關(guān)；而神經(jīng)退化性疾病(如帕金森氏病、老年性癡呆等)及缺血性心肌損傷與細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)。
細(xì)胞凋亡可被多種因素誘發(fā)，凋亡細(xì)胞均表現(xiàn)出共同的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)特征，包括胞體皺縮、體積縮小、細(xì)胞核濃縮、染色體斷裂等等(Tomislav，D.etal.，Oncogene，173207-3213，1998)。
與細(xì)胞凋亡誘發(fā)、凋控過(guò)程相關(guān)的許多蛋白因子已被發(fā)現(xiàn)。一條途徑由線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)，細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體中釋放，與Apaf-1形成多聚體，從而招募和激活Caspase-9；另一條途徑由細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)，通過(guò)FADD與FLASH招募和激活Caspase-8。兩條途徑最終均激活Caspase-3，Caspase-3激活DNA片斷化因子(DFF)，引起染色體斷裂(Budihardjo，I.，et al.，Annual review of cell anddevelopmental biology，15269-290，1999)。
DFF有兩個(gè)亞基，核酸酶(DFF40/CAD)和它的抑制物(DFF45/ICAD)。通過(guò)與DFF45和DFF40的N端結(jié)構(gòu)域同源篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子蛋白家族CIDE(cell inducing death DFF45-like effector)(Inohara，N.et al.，EMBOJ.，172526-2533，1998)。過(guò)量表達(dá)CIDE可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子蛋白家族有兩個(gè)成員，CIDE-A和CIDE-B。
鑒于細(xì)胞凋亡與眾多疾病的密切相關(guān)性，本領(lǐng)域迫切需要了解與凋亡有關(guān)的基因和蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CIDE-C蛋白以及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的CIDE-C基因，是一個(gè)在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道的新基因，對(duì)它的作用機(jī)理的研究將有利于加深對(duì)凋亡發(fā)生途徑的分子機(jī)制的了解。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的CIDE-C多肽，該多肽源自人肝組織，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一個(gè)核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少75％相同性(a)編碼上述CIDE-C多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中11-724位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1191位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有CIDE-C蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)CIDE-C蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有CIDE-C蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的CIDE-C多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1190個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗CIDE-C多肽活性的化合物，以及抑制CIDE-C多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是CIDE-C多肽的編碼序列(或其片段)的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在CIDE-C蛋白的方法，它包括將樣品與CIDE-C蛋白的特異性抗體接觸，觀(guān)察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CIDE-C蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與CIDE-C多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的CIDE-C多肽、或其編碼序列、或含該編碼序列的載體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑和載體。這些藥物組合物可應(yīng)用于治療細(xì)胞凋亡相關(guān)病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明人通過(guò)同源篩選方法克隆了一種新的人類(lèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因CIDE-C。全序列測(cè)定該cDNA全長(zhǎng)為1191bp(見(jiàn)SEQ ID NO1)，編碼了一個(gè)由238個(gè)氨基酸組成的CIDE-C蛋白質(zhì)(見(jiàn)SEQ ID NO2)。同源性分析表明CIDE-C屬于CIDE基因家族。它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明進(jìn)行了CIDE-C基因的組織分布分析。通過(guò)與12種正常人組織mRNA的Northern雜交實(shí)驗(yàn)，表明CIDE-C的表達(dá)在結(jié)腸、心臟、小腸、胃中高量表達(dá)，在腦、脾臟、肝中微量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小為約1.3Kb。在胎盤(pán)中表達(dá)1.1kb的產(chǎn)物。因此，CIDE-C基因可以應(yīng)用于多種組織，具有較廣的普遍性。
本發(fā)明構(gòu)建了CIDE-C基因的真核表達(dá)載體，并在人的胎腎293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，并且用抗體進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在293T細(xì)胞中表達(dá)了CIDE-C基因。
本發(fā)明還進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用多種方法檢測(cè)CIDE-C基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。首先用CIDE-C基因轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，24小時(shí)后，收取細(xì)胞并抽提其基因組DNA。電泳鑒定表明，CIDE-C誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明人還運(yùn)用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染了外源基因的293T細(xì)胞。在陰性對(duì)照中，轉(zhuǎn)染載體pCMV-Tag2，其細(xì)胞核呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)樣的綠色熒光；在陽(yáng)性對(duì)照中，轉(zhuǎn)染了CIDE-B，其細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光亢進(jìn)的圓珠狀小體；在轉(zhuǎn)染了CIDE-C的細(xì)胞中，其細(xì)胞核也呈現(xiàn)出熒光亢進(jìn)的圓珠狀小體，說(shuō)明CIDE-C也誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。


圖1、Northern雜交檢測(cè)CIDE-C的mRNA在人各組織中的表達(dá)。
圖中1、腦；2、結(jié)腸；3、心臟；4、腎臟；5、肝；6、肺；7、骨骼??；8、胎盤(pán)；9、小腸；10、脾臟；11、胃；12、睪丸。
圖2、免疫印記檢測(cè)CIDE-C蛋白的表達(dá)。
圖中1、pCMV-Tag2；2、pCMV-Tag2-CIDE-B；3、pCMV-Tag2-CIDE-C圖3、抽取基因組DNA檢測(cè)CIDE-C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
圖中1、分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、pCMV-Tag2；3、pCMV-Tag2-CIDE-B；4、pCMV-Tag2-CIDE-C圖4、熒光顯微鏡檢測(cè)CIDE-C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
圖中1、pCMV-Tag2；2、pCMV-Tag2-CIDE-B；3、pCMV-Tag2-CIDE-C箭頭所指的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“CIDE-C蛋白”、“CIDE-C多肽”或“誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CIDE-C”可互換使用，都指具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CIDE-C氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白CIDE-C。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的CIDE-C蛋白或多肽”是指CIDE-C多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CIDE-C蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括CIDE-C蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然CIDE-C蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
一類(lèi)特殊的CIDE-C類(lèi)似物是在其他哺乳動(dòng)物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中CIDE-C的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的序列，通過(guò)雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過(guò)常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“CIDE-C多肽”指具有CIDE-C蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與CIDE-C蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括CIDE-C蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與CIDE-C DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗CIDE-C多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含CIDE-C多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了CIDE-C多肽的可溶性片段。通常，該片段具有CIDE-C多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供CIDE-C蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然CIDE-C多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“CIDE-C蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少60％，較佳地至少75％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼CIDE-C蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的CIDE-C核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或CIDE-C蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的CIDE-C多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼CIDE-C多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，CIDE-C多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含CIDE-C編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS-1、293細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的CIDE-C蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CIDE-C蛋白功能低下或喪失所致的疾病(例如用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笴IDE-C蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組CIDE-C蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激CIDE-C蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)CIDE-C DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于CIDE-C基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與CIDE-C基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制CIDE-C蛋白的分子，也包括那些并不影響CIDE-C蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的CIDE-C基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的CIDE-C基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物(如家兔，小鼠等)以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)CIDE-C蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體?？墒褂枚喾N佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中包括(但不限于)弗氏佐劑等。
本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用CIDE-C基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與CIDE-C基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗CIDE-C蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的CIDE-C蛋白。此外，與CIDE-C蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CIDE-C蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于肝臟損傷修復(fù)方面的治療。在使用本發(fā)明CIDE-C蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CIDE-C多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的CIDE-C蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
CIDE-C蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CIDE-C蛋白的無(wú)表達(dá)、無(wú)活性或活性低下所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常，也可用于增加CIDE-C的表達(dá)和活性(例如用于促進(jìn)肝再生)。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)CIDE-C蛋白，以增加內(nèi)源性的CIDE-C蛋白活性。來(lái)源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將CIDE-C基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶外源基因的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組CIDE-C基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制CIDE-C mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過(guò)編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與CIDE-C蛋白結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)CIDE-C蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的CIDE-C蛋白水平，可以用作解釋CIDE-C蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷CIDE-C蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在CIDE-C蛋白的方法是利用CIDE-C蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與CIDE-C蛋白特異性抗體接觸；觀(guān)察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CIDE-C蛋白。
CIDE-C蛋白的多聚核苷酸可用于CIDE-C蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CIDE-C蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)CIDE-C蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下CIDE-C蛋白的異常表達(dá)。如CIDE-C DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷CIDE-C蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用CIDE-C蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)CIDE-C蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)CIDE-C基因的突變也可用于診斷CIDE-C蛋白相關(guān)的疾病。CIDE-C蛋白突變的形式包括與正常野生型CIDE-C DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、提供了一個(gè)全新的人類(lèi)凋亡相關(guān)基因CIDE-C。它是一個(gè)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能基因。該發(fā)明對(duì)于加深對(duì)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的了解具有重要的意義。
2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CIDE-C可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明CIDE-C參與細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)凋控，可以作為藥物或作為藥物的靶序列等一系列臨床應(yīng)用，包括凋亡相關(guān)疾病的早期診斷、基因治療。
3、CIDE-C在正常人組織中的表達(dá)有特異性，在結(jié)腸、心臟、小腸、胃中高量表達(dá)，在其他微量表達(dá)或不表達(dá)，顯示該基因在這四種組織中具有重要的功能。可應(yīng)用于作為結(jié)腸、心臟、小腸和胃相關(guān)疾病的診斷制劑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
實(shí)施例1CIDE-C全長(zhǎng)基因克隆根據(jù)CIDE家族的序列，與人類(lèi)基因組的核酸序列進(jìn)行同源序列比較，設(shè)計(jì)合成了多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物P15-＇gctgacaaggatggaatacg-3＇(SEQ ID NO3)，引物P25＇-cttgtgggca ctaccagtta a-3＇(SEQ IDNO4)。以肝臟的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒(GIBCO BRL公司產(chǎn)品)為模板，PCR擴(kuò)增獲得CIDE-B基因cDNA，PCR反應(yīng)條件為94℃2分鐘預(yù)變性，循環(huán)反應(yīng)為94℃30秒，55℃30秒，68℃90秒，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。將約800bp的PCR產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化，克隆至T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)中，方法參照《分子克隆.實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniais，T.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。然后進(jìn)行全序列測(cè)序(由博亞公司測(cè)定)。
再以T7引物(5＇-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3＇)與引物P1進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物直接測(cè)序得到cDNA的3＇端序列。該cDNA全長(zhǎng)為1191bp(SEQ ID NO1)，包含了一個(gè)完整的蛋白編碼區(qū)(SEQ ID NO1中第11-724位)，編碼了一個(gè)由238個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。
實(shí)施例2CIDE-C在人正常組織中的表達(dá)分析將固定有正常人的12種不同組織的poly(A)+RNA雜交膜(南京大學(xué)提供)放入雜交管中，加入5mL快速雜交液(Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司產(chǎn)品)，65℃預(yù)雜交30分鐘，加入變性的32P隨機(jī)標(biāo)記的CIDE-C片段的探針(Random Primer DNA標(biāo)記試劑盒，TaKaRa公司)，65℃雜交1.5小時(shí)。雜交膜用洗滌緩沖液I(0.3M NaCl，0.03M醋酸鈉(PH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉)于室溫20分鐘；然后用洗滌緩沖液II(37.5mM NaCl，3.75mM醋酸鈉(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS))于65℃洗兩次，每次15分鐘。然后，壓X光片，-70℃放射自顯影(圖1)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CIDE-C基因在結(jié)腸、心臟、小腸、胃中高量表達(dá)，在腦、脾臟、肝中微量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小為1.3Kb。在胎盤(pán)中表達(dá)1.1kb的產(chǎn)物。
實(shí)施例3CIDE-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白產(chǎn)物的表達(dá)與檢測(cè)。
根據(jù)CIDE-C的cDNA序列設(shè)計(jì)引物P35＇-gctctagaat ggaatacgcc atga-3＇(SEQ IDNO5)與引物P45＇-cggaattcac tgcagtatcttc-3＇(SEQ ID NO6)，引物的兩側(cè)分別有XbaI與EcoRI的酶切位點(diǎn)。以經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的CIDE-C序列為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化，加入限制性?xún)?nèi)切酶XbaI與EcoRI(TaKaRa公司產(chǎn)品)。37℃消化一個(gè)小時(shí)后，回收純化。同時(shí)將載體pCMV-Tag2(Stratagene公司產(chǎn)品)用相同的限制性?xún)?nèi)切酶XbaI與EcoRI酶切一個(gè)小時(shí)，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化。將兩種回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至DH5α菌株中。通過(guò)篩選，得到重組的CIDE-C質(zhì)粒，命名為pCMV-Tag2-CIDE-C。
正常胎腎細(xì)胞293T用DMEM培養(yǎng)液(GIBCOL BRL公司產(chǎn)品)加入10％小牛血清(GIBCOL BRL公司產(chǎn)品)，37℃，5％CO2培養(yǎng)。細(xì)胞以90,000個(gè)的接種量接種入60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)。24小時(shí)后用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。分別加入5μg的pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收取293T細(xì)胞。300μl Triton X-100裂解液(10mMTris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％Triton X-100，1mM PMSF，10mM DTT，5μg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10分鐘，細(xì)針頭剪切DNA，離心去沉淀。取10μl上樣于15％SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠，進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司產(chǎn)品)。用小鼠的抗Flag標(biāo)簽蛋白的單克隆抗體(Sigma)進(jìn)行免疫印跡，再用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)交聯(lián)的二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品)進(jìn)行雜交。最后用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，壓X光片1分鐘(圖2)。
結(jié)果表明，在30kDa處存在表達(dá)的CIDE-C/Tag融合蛋白。
實(shí)施例4CIDE-C可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡正常胎腎細(xì)胞293T用加入10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)。細(xì)胞以9×105個(gè)的接種量接種入60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)。24小時(shí)后用10μlLipofectamine轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。分另加入5μg的pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收取293T細(xì)胞，抽取細(xì)胞的基因組DNA。在1.8％的瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染了CIDE-B、CIDE-C基因的細(xì)胞基因組DNA呈現(xiàn)梯型。這說(shuō)明CIDE-C可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例5熒光顯微鏡檢測(cè)CIDE-C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡將293T細(xì)胞分至六孔板，每孔分30,000個(gè)細(xì)胞。24小時(shí)后轉(zhuǎn)染1μg的質(zhì)粒DNA，各孔分別為pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，吖啶橙(AO)與溴化乙錠(EB)染色。熒光顯微鏡下檢測(cè)，拍照(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CIDE-C誘導(dǎo)了293T細(xì)胞的凋亡。
實(shí)施例6抗CIDE-C蛋白抗體的產(chǎn)生取200μg實(shí)施例3中獲得的純化融合蛋白，溶于0.5毫升去離子水中，加入等體積的弗氏完全佐劑并混勻，多點(diǎn)注射于體重2.5Kg的雄性新西蘭大白兔皮內(nèi)。4周后使用同樣的蛋白量以及弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)注射。過(guò)2周后進(jìn)行再次加強(qiáng)。加強(qiáng)后在耳動(dòng)脈取血，使用免疫雙擴(kuò)散方法檢測(cè)抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到要求時(shí)，頸動(dòng)脈放血收集血液并制備抗血清，加入NaN3至0.1％，置于-20℃保存。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序 列 表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所<120>誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白、其編碼序列及用途<130>012165<160>7<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1191<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(11)..(724)<400>1gctgacaagg atg gaa tac gcc atg aag tcc ctt agc ctt ctc tac ccc 49Met Glu Tyr Ala Met Lys Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Pro1 5 10aag tcc ctc tcc agg cat gtg tca gtg cgt acc tct gtg gtg acc cag 97Lys Ser Leu Ser Arg His Val Ser Val Arg Thr Ser Val Val Thr Gln15 20 25cag ctg ctg tcg gag ccc agc ccc aag gcc ccc agg gcc cgg ccc tgc145Gln Leu Leu Ser Glu Pro Ser Pro Lys Ala Pro Arg Ala Arg Pro Cys30 35 40 45cgc gta agc acg gcg gat cga agc gtg agg aag ggc atc atg gct tac193Arg Val Ser Thr Ala Asp Arg Ser Val Arg Lys Gly Ile Met Ala Tyr50 55 60agt ctt gag gac ctc ctc ctc aag gtc cgg gac act ctg atg ctg gca241Ser Leu Glu Asp Leu Leu Leu Lys Val Arg Asp Thr Leu Met Leu Ala65 70 75gac aag ccc ttc ttc ctg gtg ctg gag gaa gat ggc aca act gta gag289Asp Lys Pro Phe Phe Leu Val Leu Glu Glu Asp Gly Thr Thr Val Glu80 85 90aca gaa gag tac ttc caa gcc ctg gca ggg gat aca gtg ttc atg gtc337Thr Glu Glu Tyr Phe Gln Ala Leu Ala Gly Asp Thr Val Phe Met Val95 100 105ctc cag aag ggg cag aaa tgg cag ccc cca tca gaa cag ggg aca agg385Leu Gln Lys Gly Gln Lys Trp Gln Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Arg110 115 120 125cac cca ctg tcc ctc tcc cat aag cct gcc aag aag att gat gtg gcc433His Pro Leu Ser Leu Ser His Lys Pro Ala Lys Lys Ile Asp Val Ala130 135 140cgt gta acg ttt gat ctg tac aag ctg aac cca cag gac ttc att ggc481Arg Val Thr Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Asn Pro Gln Asp Phe Ile Gly145 150 155tgc ctg aac gtg aag gcg act ttt tat gat aca tac tcc ctt tcc tat529Cys Leu Asn Val Lys Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ser Leu Ser Tyr160 165 170gat ctg cac tgc tgt ggg gcc aag cgc atc atg aag gaa gct ttc cgc577Asp Leu His Cys Cys Gly Ala Lys Arg Ile Met Lys Glu Ala Phe Arg175 180 185tgg gcc ctc ttc agc atg cag gcc aca ggc cac gta ctg ctt ggc acc625Trp Ala Leu Phe Ser Met Gln Ala Thr Gly His Val Leu Leu Gly Thr190 195 200 205tcc tgt tac ctg cag cag ctc ctc gat gct acg gag gaa ggg cag ccc673Ser Cys Tyr Leu Gln Gln Leu Leu Asp Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro210 215 220ccc aag ggc aag gcc tca tcc ctt atc ccg acc tgt ctg aag ata ctg721Pro Lys Gly Lys Ala Ser Ser Leu Ile Pro Thr Cys Leu Lys Ile Leu225 230 235cag tgaaagccca agtccttgga agctttcccc agtgaaggac tgactggggg 774Glncctcacgctt aactggtagt gcccacaagt ggtagtggcc acaagcctgg cagctgtaga 834gccgcgaacc tccccacacc tccctcaccg cgcaggaccc tgagtgagga ggaggagctg 894gaaacctggg gtgggttggc caaaggagaa cctcaagctc ctggcctgat ccagctcctt 954cctgcccaag gcagcttagc ccatccagac tggtcctgaa gtctgtccct ccattggcat1014gaagtctgcc ccttagcaat ccggcctcgc aggctgtact ttcatggtgc tctctacctt1074ctggccccca tcccggaaca ttcctgagtg aattcgcaag cgcactagca tgtgatatta1134gggagtttgc aataaattat tgaggctgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1191<210>2<211>238<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Tyr Ala Met Lys Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Pro Lys Ser Leu1 5 10 15Ser Arg His Val Ser Val Arg Thr Ser Val Val Thr Gln Gln Leu Leu20 25 30Ser Glu Pro Ser Pro Lys Ala Pro Arg Ala Arg Pro Cys Arg Val Ser35 40 45Thr Ala Asp Arg Ser Val Arg Lys Gly Ile Met Ala Tyr Ser Leu Glu50 55 60Asp Leu Leu Leu Lys Val Arg Asp Thr Leu Met Leu Ala Asp Lys Pro65 70 75 80Phe Phe Leu Val Leu Glu Glu Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Glu Glu85 90 95Tyr Phe Gln Ala Leu Ala Gly Asp Thr Val Phe Met Val Leu Gln Lys100 105 110Gly Gln Lys Trp Gln Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Arg His Pro Leu115 120 125Ser Leu Ser His Lys Pro Ala Lys Lys Ile Asp Val Ala Arg Val Thr130 135 140Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Asn Pro Gln Asp Phe Ile Gly Cys Leu Asn145 150 155 160Val Lys Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ser Leu Ser Tyr Asp Leu His165 170 175Cys Cys Gly Ala Lys Arg Ile Met Lys Glu Ala Phe Arg Trp Ala Leu180 185 190Phe Ser Met Gln Ala Thr Gly His Val Leu Leu Gly Thr Ser Cys Tyr195 200 205Leu Gln Gln Leu Leu Asp Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro Pro Lys Gly210 215 220Lys Ala Ser Ser Leu Ile Pro Thr Cys Leu Lys Ile Leu Gln225 230 235<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3gctgacaagg atggaatacg20<210>4<211>21<212>DNA<213>合成的引物<400>4cttgtgggca ctaccagtta a 21<210>5<211>24<212>DNA<213>合成的引物<400>5gctctagaat ggaatacgcc atga 24<210>6<211>22<212>DNA<213>合成的引物<400>6cggaattcac tgcagtatct tc 22<210>7<211>23<212>DNA<213>合成的引物<400>7taatacgact cactataggg aga2權(quán)利要求
1.一種分離的CIDE-C多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一個(gè)核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少75％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中11-724位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1191位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有CIDE-C蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)CIDE-C蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有CIDE-C蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的CIDE-C蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽或權(quán)利要求3所述的多核苷酸或權(quán)利要求6所述的載體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白,即CIDE－C(cell death－inducing DFF45－like effector C)蛋白以及編碼CIDE－C蛋白的多核苷酸。CIDE－C蛋白是CIDE家族的一個(gè)新成員。本發(fā)明還公開(kāi)了CIDE－C蛋白及其多核苷酸的制法和用途。本發(fā)明還公開(kāi)了此CIDE－C蛋白用于治療多種疾病(如腫瘤、老年性癡呆)的方法。本發(fā)明還提供了含CIDE－C蛋白的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1388132SQ0111298
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者趙慕鈞, 梁亮, 徐振華, 李載平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所