專利名稱：一種重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白的純化方法。具體而言，本發(fā)明公開了一種新型的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的純化工藝。
背景技術(shù)：
月中瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis inducing ligand,TRAIL)屬II型跨膜蛋白。其全序列分為分胞外段、跨膜區(qū)及胞內(nèi)段。胞外段為40-281氨基酸，在體內(nèi)能被切割形成包含114-281氨基酸的可溶活性肽段，被稱為可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體。全長的與膜結(jié)合的TRAIL和可溶的TRAIL具有相同的促凋亡活性。但由于全長的TRAIL蛋白是一個(gè)跨膜蛋白，表達(dá)存在困難，目前，多個(gè)研發(fā)小組開發(fā)了多種形式的TRAIL，只含胞外區(qū)114481氨基酸的TRAIL分子能自發(fā)的形成三聚體。TRAIL蛋白形成三聚體才有生物學(xué)活性，但只有在有鋅離子的情況下TRAIL蛋白才能維持的穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)。所以鋅離子是TRAIL蛋白維持結(jié)構(gòu)和活性穩(wěn)定的必須成分。TRAIL作用的主要途徑是通過TRAIL活性三聚體誘發(fā)細(xì)胞膜的表面死亡受體DR4 和DR5三聚化，并與死亡受體胞外富含Cys區(qū)域相結(jié)合，激活DR4、DR5分子中的死亡結(jié)構(gòu)域，使其死亡結(jié)構(gòu)域相互聚集，并進(jìn)一步通過同嗜作用招募FADDO^is-associated death domain protein)。FADD是通過兩個(gè)DD之間的相互作用來結(jié)合受體，并同時(shí)通過DED之間的相互作用來結(jié)合凋亡信號(hào)的起始因子胱冬酶原(pro-caspase-8)。被激活的caspase-8 啟動(dòng)了非線粒體依賴途徑和線粒體依賴的兩種細(xì)胞凋亡途徑。非線粒體凋亡途徑通過激活的csapaseS直接激活下游的效應(yīng)胱天蛋白酶分子caSpaSe3、caspase7而啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 不斷地傳遞和放大凋亡信號(hào)，從而引發(fā)對TRAIL敏感的細(xì)胞發(fā)生大量、快速的凋亡；線粒體依賴途徑通過激活的 caspase8 作用于 Bid (Bcl_2inhibitory BH3-domain_containing protein)形成有活性的tBid (truncated BID)，促使包括cytochrome C在內(nèi)的線粒體蛋白的釋放。被釋放的cytochrome C再與apaf_l，pro-caspase9和dATP形成一種被稱之為apoptosome的復(fù)合體。這種復(fù)合體二聚化以后再激活caspase9，進(jìn)而通過caspase3、 caspase7誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前，國內(nèi)外公司對TRAIL的相關(guān)臨床研究處在臨床II期。研究結(jié)果表明TRAIL 對非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤以及非霍奇金淋巴瘤均有一定的療效并具有良好的安全性。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白已經(jīng)實(shí)現(xiàn)原核系統(tǒng)大腸桿菌、真核系統(tǒng)酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。真核系統(tǒng)表達(dá)的樣品二聚體含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原核表達(dá)，所以一般用原核系統(tǒng)表達(dá)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)和專利中TRAIL蛋白的純化大多采用鎳金屬螯合層析、離子交換層析以及結(jié)晶的方法來純化，但鎳金屬螯合層析會(huì)有鎳離子的殘留問題；TRAIL蛋白在低鹽溶液中溶解度低，且不穩(wěn)定，使用離子交換層析降低樣品鹽濃度的同時(shí)需要稀釋以降低 TRAIL蛋白的濃度，這樣會(huì)導(dǎo)致樣品體積大、上樣時(shí)間延長和樣品不穩(wěn)定等問題；結(jié)晶的方法是利用了 TRAIL蛋白溶解度會(huì)隨溫度降低而減小的特點(diǎn)，但結(jié)晶耗時(shí)太長，也不適合工
3業(yè)化生產(chǎn)。為了得到生物學(xué)活性良好的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，并且使之各項(xiàng)指標(biāo)符合作為生物藥物開發(fā)的要求，本發(fā)明嘗試一套重組人TRAIL的純化工藝，避免使用鎳離子螯合、離子交換和低溫結(jié)晶等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的方法。新工藝主要包括鋅離子螯合層析和兩步疏水層析。整個(gè)工藝安排合理，不需要超濾操作。工藝可以有效去除宿主殘留蛋白、 宿主殘留DNA以及內(nèi)毒素，生產(chǎn)的樣品能滿足新版藥典對生物制品的要求。本發(fā)明中提到的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL是利用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)品，與全長的人TRAIL蛋白比較缺少N端113個(gè)氨基酸，只保留有天然蛋白C端的114-281位氨基酸，分子量19. 6KD。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的純化新工藝。本發(fā)明所述的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的新型純化工藝，包括鋅離子螯合層析與兩步疏水層析。該純化方法包括以下步驟1)鋅離子螯合層析發(fā)酵菌體均質(zhì)后離心處理，將所得上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白洗脫組份。螯合層析采用的金屬離子螯合層析的介質(zhì)包括GE公司的chelating sepharose FF, IMAC sepharose 6FF, IMAC sepharose high performance，以及西安吉諾泰生物科技有限公司金屬螯合瓊脂糖凝膠等介質(zhì)。2)第一步疏水層析將上步所得樣品加入0. 3 0. 6M硫酸銨后上樣于層析柱，收集含目的蛋白的流穿組份。3)第二步疏水層析向收集所得流穿組分中增加硫酸銨濃度至1. 0 1. 8M后，上樣于層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組份。本發(fā)明所述的疏水層析選用填料為帶有苯基官能團(tuán)的介質(zhì)。此種類型的介質(zhì)包 f舌:GE 公司白勺 phenyl sepharosephenyl sepharose big beads, phenyl sepharose 6FF(high sub), phenyl sepharose 6FF(low sub), phenyl sepharose hight performance, capto phenyl (HS)以及東曹的 T0Y0PEARL Phenyl-650S, T0Y0PEARL Phenyl-650M, T0Y0PEARL Phenyl-650C, T0Y0PEARL Phenyl_600M 等系列填料。本發(fā)明所述的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的純化新工藝，詳細(xì)步驟為1)鋅離子螯合層析發(fā)酵菌體經(jīng)高壓均質(zhì)離心后的上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，平衡液平衡后用洗脫液洗脫，收集含目的蛋白洗脫組份。2)第一步疏水層析將上步獲得的樣品中加入0. 3-0. 6M的硫酸銨后上樣于層析柱，收集含目的蛋白的流穿組份。有文獻(xiàn)報(bào)道在高鹽情況下讓目的蛋白結(jié)合在疏水填料上用于純化TRAIL蛋白的方法，但在樣品純度較低的情況下加入高濃度(如大于1. OM的硫酸銨)的鹽會(huì)導(dǎo)致樣品中的某些雜質(zhì)沉淀，部分目的蛋白也會(huì)被共沉淀，導(dǎo)致層析柱堵塞和目的蛋白損失。但在樣品中加入低濃度(如小于0.6M的硫酸銨)的鹽樣品會(huì)保持澄清，通過疏水層析柱時(shí)大部分雜質(zhì)和色素被吸附在柱上，而目的蛋白會(huì)流穿下來，純度可達(dá)98%。3)第二步疏水層析(吸附)平衡層析柱，向上步獲得的樣品中繼續(xù)增加硫酸銨濃度，增加硫酸銨濃度至1. 0 1. 8M，將所得產(chǎn)物上樣于層析柱，再用平衡液平衡至紫外吸收值穩(wěn)定后用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組份。樣品經(jīng)過上步純化后純度已經(jīng)可達(dá)98%，而經(jīng)過此步純化后純度可進(jìn)一步提高到99%以上。4)樣品脫鹽使用分子篩G-25層析或者超濾的方式把樣品中的鹽成份置換為 0. 1-0. 4M 硫酸鈉，0. 02M Tris, 0. 3mM 硫酸鋅即可。由于文獻(xiàn)報(bào)道的鎳離子螯合層析方法，最終產(chǎn)品會(huì)殘留鎳離子，因此存在一定的安全隱患，而本發(fā)明所采用的鋅離子螯合層析就能避免該風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)鋅離子螯合層析獲得的樣品純度明顯高于鎳離子螯合層析。本發(fā)明所述的重組人TRAIL的純化新工藝，簡便易行，省略了超濾置換的步驟。經(jīng)驗(yàn)證該方法可以方便地應(yīng)用于TRAIL的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明所述的重組人TRAIL的純化新工藝，經(jīng)過對重組人TRAIL純度驗(yàn)證與活性驗(yàn)證，并顯示了良好的實(shí)際效果。本發(fā)明制備重組人TRAIL蛋白經(jīng)檢測各項(xiàng)指標(biāo)均滿足新版藥典對生物制品的要求，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)良好的有效性和安全性。


圖1重組人TRAIL鋅螯合層析圖，其中圖A為chelating sepharose FF填料，圖 B為IMAC sepharose FF填料。其中縱坐標(biāo)mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標(biāo)為體積。圖2金屬螯合層析chelating sepharose FF填料掛鎳和掛鋅(實(shí)例2與實(shí)例3) 兩種情況下的電泳結(jié)果。1為蛋白marker ；2為上樣前樣品；3為掛鎳情況下的流穿；4為掛鎳情況下的洗脫；5為掛鋅情況下的流穿；6為掛鋅情況下的洗脫。圖3phenyl sepharose 6FF填料吸附層析，不同硫酸銨濃度下上樣的層析圖譜。其中圖A為硫酸銨濃度為1. OM時(shí)的層析圖譜；圖B為硫酸銨濃度為1. 3M時(shí)的層析圖譜；圖C為硫酸銨濃度為1. 8M時(shí)的層析圖譜(實(shí)例2)。其中縱坐標(biāo)mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標(biāo)為體積。圖 4chelating sepharose FF鎳螯合層析-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水層析(流穿)-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水層析(吸附)(實(shí)例 2)后的 rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于13. Imin 出峰。圖 5chelating sepharose FF 鋒螯合層析-phenyl sepharose 6FF (high sub)疏水層析(流穿)(實(shí)例3)后的rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于13. Imin出峰。圖6IMAC sepharose 6F. F.鋅螯合層析-phenyl sepharose 6FF疏水層析(流穿)(實(shí)例4)后的rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于13. Imin出峰。圖 7IMAC sepharose 6F. F.鋅螯合層析-phenyl sepharose 6FF 疏水層析(流穿)-phenyl sepharose 6FF (high sub)疏水層析(吸附)(實(shí)例 5)后的 rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于13. Imin 出峰。圖8經(jīng)實(shí)例2-5方法純化后的rhTRAIL蛋白液相純度比較。1為實(shí)例2純化的 rhTRAIL液相純度；2為實(shí)例3純化的rhTRAIL液相純度；3為實(shí)例4純化的rhTRAIL液相純度；4為實(shí)例5純化的rhTRAIL液相純度。圖9經(jīng)實(shí)例2-5方法純化后的rhTRAIL蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。1為蛋白分子量 marker ；2為實(shí)例2純化的rhTRAIL ；3為實(shí)例3純化的rhTRAIL ；4為實(shí)例4純化的rhTRAIL ； 5為實(shí)例5純化的rhTRAIL。圖10實(shí)例5各步純化樣品電泳圖譜，其中1為蛋白質(zhì)Marker ;2為IMACsepharose FF鋅螯合層析上樣樣品；3為IMAC sepharose FF鋅螯合層析上樣流穿；4為IMAC sepharose FF鋅螯合層析洗脫樣品；5為phenyl sepharose6FF (high sub)疏水層析(流穿)流穿樣品；6為phenyl sepharose 6FF(high sub)疏水層析(吸附)洗脫樣品。圖11供試品與參考品活性比較，把供試品和參考品稀釋到相同濃度用于體外活性測定，供試品活性與參考品相當(dāng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組人TRAIL在大腸桿菌中的表達(dá)1)菌株的構(gòu)建在pBR322載體EcoR I和HindIII的酶切位點(diǎn)之間插入依次排列的色氨酸啟動(dòng)子， 多酶切位點(diǎn)和TO終止子的序列，構(gòu)建成功表達(dá)載體pHS。設(shè)計(jì)引物Sequence NO 1與kquence NO 2)，從人胰腺cDNA樣品中擴(kuò)增出 TRAIL基因編碼114-281位氨基酸的DNA序列(kquence NO 3)，其對應(yīng)的氨基酸序列為 Sequence NO :4，再把這段序列插入到載體pHS上的^(balAhoI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pHS-TRAIL。重組質(zhì)粒pHS-TRAIL轉(zhuǎn)化宿主菌，然后經(jīng)搖瓶篩選得到高效表達(dá)的菌株 PHS-TRAIL/W3110-2。2)重組人TRAIL菌株的培養(yǎng)采取批培養(yǎng)的方式。發(fā)酵過程分為兩個(gè)階段第一個(gè)階段是擴(kuò)陪階段，此階段菌體利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基快速生長，此過程大約5小時(shí)，菌體OD6tltl可以達(dá)到10左右；第二階段是誘導(dǎo)表達(dá)階段，此階段開始補(bǔ)加色氨酸含量低的氮源和糖，菌體在低色氨酸情況下開始表達(dá)目的蛋白，同時(shí)菌體密度繼續(xù)升高，此階段持續(xù)11-13小時(shí)，菌體OD6tltl可達(dá)50左右，表達(dá)量可達(dá)3克/升以上。實(shí)施例2重組人TRAIL蛋白的純化方案A本實(shí)例中優(yōu)選以GE公司的chelating sepharose FF填料掛上鎳離子，用于樣品的第一步純化。chelating sepharose FF填料的優(yōu)點(diǎn)是反壓小，流速高。樣品經(jīng)過鋅離子螯合層析后再經(jīng)過兩步疏水層析，第一步疏水層析目的蛋白流穿，大部分雜質(zhì)和色素吸附在柱上，樣品純度可達(dá)90%，第二步疏水層析目的蛋白吸附于柱上，經(jīng)洗脫后樣品純度大于 98%。材料與儀器chelating sepharose FF 填料(GE healthcare 公司 產(chǎn)品)，phenyl sepharose6FF(low sub)(GE healthcare 公司產(chǎn)品)，AKTA Purifier 層析系統(tǒng) (GEhealthcare 公司產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)方法Dchelating sepharose FF 填料層析
6
清潔chelating sepharose FF層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用
0.2mol/L硫酸鎳水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 01mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎離心后上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 01mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩(wěn)定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 05mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF(low sub)填料層析流穿清潔phenyl sepharose 6FF(low sub)層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 6M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 3 0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液 (pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。3) phenyl sepharose 6FF(low sub)填料吸附試驗(yàn)中對硫酸銨濃度進(jìn)行調(diào)整，分為I，II，III三套方案。清潔phenyls印harose 6FF(low sub)層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，分別進(jìn)行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉 +0. 35mol/L 氯化鈉 +1 :1. 0mol/L，II :1. 3mol/L 或 III :1. 8mol/L 硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入I :0. 4mol/L, II :0. 7mol/L或III :1. 2mol/L硫酸銨后上樣； 上完樣后用(0. lmol/L 磷酸二氫鈉+0. 35mol/L 氯化鈉+1 1. 0mol/L,II :1.3mol/L 或 III
1.8mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收穩(wěn)定；用緩沖液(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)洗脫，收集洗脫峰(圖3)。
實(shí)施例3重組人TRAIL純化的純化方案B本實(shí)施例中金屬螯合層析用鋅離子螯合填料，同時(shí)疏水填料用phenyl sepharose 6FF(high sub)，疏水只做一步(流穿)，此方案總共兩步層析。材料與儀器chelating sepharose FF 填料(GE healthcare 公司 產(chǎn)品)，phenyl sepharose6FF(high sub) (GE healthcare 公司產(chǎn)品)，AKTA Purifier 層析系統(tǒng) (GEhealthcare 公司產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)方法Dchelating sepharose FF 填料層析清潔chelating sepharose FF層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩(wěn)定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 15mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub)填料流穿清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 4M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。實(shí)施例4重組人TRAIL純化的純化方案C本實(shí)施例優(yōu)選IMAC s印harose FF ±真料(掛鋅)代替chelating s印haroseFF填料，疏水填料與方案B —致，且疏水只做一步(流穿)材料與儀器IMAC sepharose F. F.填料(GE healthcare 公司產(chǎn)品),phenyl sepharose6FF(high sub) (GE healthcare 公司產(chǎn)品)，AKTA Purifier 層析系統(tǒng) (GEhealthcare 公司產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)方法DlMAC s印harose FF ±真料層析清潔IMAC sepharose FF層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩(wěn)定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 20mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub)填料流穿清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 4M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。實(shí)施例5重組人TRAIL純化的純化方案D本實(shí)施例選擇IMAC sepharose FF填料(掛鋅離子)作為第一步層析填料，隨后用phenyl sepharose 6FF(high sub)填料進(jìn)行兩步疏水層析，一步為目的蛋白流穿，一步為目的蛋白吸附。材料與儀器IMAC sepharose FF 填料(GE healthcare 公司產(chǎn)品)，phenyl sepharose 6FF(high sub) (GE healthcare 公司產(chǎn)品)，AKTA Purifier 層析系統(tǒng)(GEhealthcare 公司廣品)O實(shí)驗(yàn)方法1) IMAC sepharose FF 填料(掛鋅)層析清潔IMAC sepharose FF層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩(wěn)定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 15mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub) ±真料流穿(同實(shí)例 4)
3)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料吸附清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統(tǒng)，并作去熱原處理，依次進(jìn)行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+1. 3mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0.9M硫酸銨后上樣；上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉 +0. 35mol/L氯化鈉+1. 3mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收穩(wěn)定；用緩沖液(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)洗脫，收集洗脫峰。實(shí)施例6重組人TRAIL蛋白的檢測1) SDS-PAGE 檢測將分離純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過實(shí)施例2_5目標(biāo)蛋白以及蛋白質(zhì) Marker的檢測結(jié)果如圖6所示，目標(biāo)蛋白與理論分子量一致約19. 6kD。2) SEC-HPLC ^使用材料為G2000柱子，4. 6mmX25mm(T0S0H公司產(chǎn)品)；流動(dòng)相為20mmol/L PBS, 0. 2mol/L NaCl，ρΗ6· 8 ；檢測波長為280nm ；流動(dòng)相流速0. 5ml/min。通過實(shí)施例2-5所獲得目標(biāo)蛋白檢測結(jié)果分別如圖2-5所示，目標(biāo)蛋白于13. Imin出峰。實(shí)驗(yàn)表明，采用鋅離子螯合層析效果明顯優(yōu)于鎳離子螯合層析，鎳離子螯合一步層析純度只能達(dá)到70 %，鋅可以達(dá)到85 %以上(圖2)，且不必要擔(dān)心鎳離子殘留。填料IMAC sepharose F. F.要優(yōu)于 chelating sepharose FF (圖 7)使用 IMAC sepharose F. F.的實(shí)施例5純度要高于使用chelating sepharose FF實(shí)施例4，此步收率可以達(dá)到80%左右。疏 /K層析填料選擇phenyl sepharose 6FF (low sub)或者phenyl sepharose 6FF (high sub) 純化效果差別不大，但從載量上考慮high sub型要優(yōu)于low sub，此步層析收率90%左右， 目的蛋白純度可達(dá)95%以上。是否需要第三步疏水層析(吸附)要視具體要求而定，第三步層析可使目的蛋白純度由98%提高到99. 5% (液相純度，圖7)，收率80%左右。經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)后，目的蛋白粗提收率為40%左右，層析純化收率可達(dá)50%以上，總收率為20%左右。純化工藝完全能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本純化工藝采用的金屬螯合層析和疏水層析。已有的文獻(xiàn)純化TRAIL蛋白也用金屬螯合層析，但是用鎳離子，我們用鋅離子螯合層析相對于鎳離子，樣品純度有明顯的提高 (由70%提高到85%)，且避免了鎳離子殘留的問題；也有人將疏水層析應(yīng)用于TRAIL蛋白純化，但都是采取高鹽吸附的方式，而在樣品還純度不高的情況下加入很高濃度的鹽會(huì)使得樣品里面的某些雜質(zhì)沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致部分目的蛋白被共沉淀，導(dǎo)致柱子堵塞和目的蛋白損失。我們采取樣品流穿的方式，在樣品中加入較低濃度的鹽，此時(shí)樣品澄清，通過疏水層析柱時(shí)大部分雜質(zhì)和色素被吸附在柱上，而目的蛋白會(huì)流穿下來，純度可達(dá)95-98%的高純度，且色素能被除盡。接下來可以再用一步疏水吸附層析進(jìn)一步提高蛋白純度。使用一步或者兩步疏水層析代替離子交換層析可以避免rhTRAIL蛋白在低鹽下不穩(wěn)定的問題，同時(shí)可以省去超濾步驟，很大程度上節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間和成本。與低溫結(jié)晶工藝比較本工藝可以節(jié)約大量的時(shí)間，且過程更為可控。綜上所述，重組人TRAIL的本純化工藝過程便捷，填料成本低，目的蛋白活性高， 適合應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。
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權(quán)利要求
1.一種重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的新型純化工藝，其特征在于，所述的純化工藝包括一步鋅離子螯合層析與兩步疏水層析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋅離子螯合層析與兩步疏水層析，其特征在于，所述層析采用的介質(zhì)為s印harose。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的新型純化工藝，其特征在于包括以下步驟1)鋅離子螯合層析發(fā)酵菌體均質(zhì)后離心處理，將離心所得上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白洗脫組分。2)第一步疏水層析將上步所得樣品加入0.3 0. 6M硫酸銨后上樣于疏水層析柱，收集含目的蛋白的流穿組分。3)第二步疏水層析向上步收集所得的流穿組分樣品中增加硫酸銨濃度至1.0 1. 8M 后，上樣于層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的純化方法，其特征在于，所述疏水層析選用帶有苯基官能團(tuán)的填料。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的新型純化工藝。本發(fā)明采用鋅離子螯合層析、兩步疏水層析就能得到純度高、生物活性良好的重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體。本發(fā)明利用重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體需要鋅離子維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性的特點(diǎn)，采用鋅離子螯合層析，避免了使用其它金屬離子導(dǎo)致的殘留；采用疏水層析而非離子交換，避免了重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在低鹽條件下溶解度較小而需要高比例稀釋的問題，同時(shí)省略了超濾脫鹽的步驟。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102443055SQ201110328798
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者朱永芳, 王二文, 王海彬, 白驊 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司