專(zhuān)利名稱(chēng)：：人腫瘤壞死因子α抗原表位及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程和分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及新的人腫瘤壞死因子a抗原表位及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：已知肺瘤壞死因子cx(TNF-ot)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要來(lái)源于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，T'淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞在一定條件下也能產(chǎn)生[OldL(1985)Science230:630-632]。成熟TNF-ct分子量為17kD,以三聚體形式與細(xì)胞表面的TNF-ot受體(TNFR)結(jié)合，介導(dǎo)多種生物學(xué)活性。正常水平的TNF-a可以參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的感染，促進(jìn)組織修復(fù)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，但TNF-a在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理?yè)p傷，例如惡病質(zhì)和敗血癥休克所致的多器官功能衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊亂綜合癥(MDS)等多種疾病(MoellerAetal.(1990)Cytokine2:162-169;Moeller等的美國(guó)專(zhuān)利5231024號(hào)；VasilliP(1992)A畫(huà)RevImmunol10:411-452;TraceyKJ,CeramiA(1994)A廳RevMed45:491-503)。為了治療與腫瘤壞死因子oc(TNF-a)相關(guān)的疾病，目前已經(jīng)研究出多種對(duì)其具有中和作用的抗體。目前上市的腫瘤壞死因子單克隆抗體有英夫利西單抗(抗體名Infliximab,商品名Remicade)和阿達(dá)木單抗(抗體名Adalimumab，商品名Humira)。這幾種抗體藥物在美國(guó)和歐洲廣泛用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病等。在抗體制備過(guò)程中，通常使用抗原分子(免疫原)來(lái)致敏動(dòng)物或者誘發(fā)細(xì)胞，免疫原可以是完整的抗原分子或者是特征性的抗原表位。已知抗原分子不但含有與免疫識(shí)別密切相關(guān)的表位結(jié)構(gòu)，同時(shí)還含有一些對(duì)于保護(hù)性免疫不利的結(jié)構(gòu)，如毒性或抑制性表位、病理及自身抗原交叉反應(yīng)性表位等。因此，天然抗原在引發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，由于中和性表位隱匿或非顯性表位，引發(fā)的免疫反應(yīng)不強(qiáng)，或所引發(fā)的免疫反應(yīng)發(fā)生了免疫偏移(Deviation)，造成T、B細(xì)胞間或T細(xì)胞亞群間互相殘殺從而加重感染等原因，使病原體不能得到有效清除。并且，完整的抗原分子往往是生物大分子，制備、保存困難，所需劑量大，易引起副作用(DerooSetal(2001)CombChemHighThroughputScreen4:75-115)。所以為了獲得特異性強(qiáng)、親和力高且具有中和活性的抗體，需要選擇合適的抗原表位。抗原表位(Epitope)，又稱(chēng)為抗原決定簇(Antigenicdeterminant)，是抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合。因此，嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，抗體的特異性是針對(duì)抗原表位而不是針對(duì)完整的抗原分子的[周光炎(2000)免疫學(xué)原理]。在同一分子的眾多表位中，各表位對(duì)抗原性的貢獻(xiàn)不同，有優(yōu)勢(shì)表位和非優(yōu)勢(shì)表位之分。此外，就蛋白抗原表位而言，其含有的各個(gè)氨基酸殘基對(duì)抗原性的貢獻(xiàn)也不同，抗原的特異性主要由其中幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基的組成和順序決定。以特定的抗原表位甚至是其關(guān)鍵氨基酸殘基為靶標(biāo)制備治療性抗體和治療性疫苗，可以增強(qiáng)療效，減少毒副作用，是目前治療性抗體的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)[PrakkenBJetal(2004)ProcNat1AcadSci101:4228-33.，F(xiàn)ockeMetal(2001)FASEBJ15:2042-4〗。隨著抗原表位的研究的日益深入，對(duì)獲得有效的胂瘤壞死因子ot的抗原表位的需要也與日俱增，但是到目前為止還沒(méi)有有關(guān)獲得有效的腫瘤壞死因子a的抗原表位的相關(guān)報(bào)道。鑒于這一現(xiàn)狀，申請(qǐng)人進(jìn)行了多方面研究和探索,通過(guò)下述試驗(yàn)策略獲得了新的rhTNFa抗原表位，具體而言，申請(qǐng)人用rhTNFct(笫一靶標(biāo))免疫動(dòng)物，制備和純化得到抗rhTNFcx的多克隆抗體(第二靶標(biāo))，然后以線性十二肽庫(kù)與抗體孵育，經(jīng)篩選獲得了與抗體特異結(jié)合的噬菌體克隆。之后通過(guò)竟?fàn)嶦LISA確定陽(yáng)性噬菌體克隆，測(cè)定陽(yáng)性克隆的噬菌體展示肽序列(第三靶標(biāo))。通過(guò)比對(duì)這些結(jié)合肽序列，發(fā)現(xiàn)其與hTNFcc的4-15位氨基酸序列相似性很高。然后申請(qǐng)人合成了312號(hào)肽(笫四乾標(biāo)，序列為FHLTPSERPVEA，SEQIDNO:4),并將其與KLH偶聯(lián)免疫動(dòng)物檢測(cè)其抗原表位的功能，即是否可以制備得到抗rhTNFoc多抗。結(jié)果，通過(guò)ELSIA和Western印跡結(jié)果表明，制備的抗血清(第四靶標(biāo))能夠與rhTNF發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，提示此多肽為hTNFot的模擬表位，與之相對(duì)應(yīng)的hTNFoc區(qū)段可能是一個(gè)抗原表位。然后申請(qǐng)人合成了hTNFoc的4-15位氨基酸對(duì)應(yīng)的肽段，將其偶聯(lián)KLH后免疫動(dòng)物。ELSIA和Western印跡結(jié)果顯示，獲得的抗血清能夠與rhTNFot特異結(jié)合，即其具有rhTNFot的抗原表位功能。進(jìn)一步地，申請(qǐng)人通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)，確定所述的TNFa抗原表位YG1不能夠被已有的商品化的抗體所識(shí)別，是一種新的TNFa抗原表位。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，該抗原表位肽能夠延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型CIA的進(jìn)程，進(jìn)而提供了制備抗hTNFa抗體的一個(gè)新耙標(biāo)o申請(qǐng)人并不滿足僅僅獲得一個(gè)單一的抗原表位，而是希望能夠在獲得的TG1的基礎(chǔ)上確定其中關(guān)鍵的氨基酸殘基，為制備抗hTNFoc抗體提供更為精確的作用靶點(diǎn)，提高抗體特異性、親和力，從而降低抗體的使用量、減少副作用。為此申請(qǐng)人通過(guò)丙氨酸掃描的方法[WeissG.A.，etal.(2000)ProcNatlAcadSci，16:8950-8954]，進(jìn)一步提供了一組具有通式(I)所示的氨基酸序列A^AAAsAsAAA^oAuAu(I)其中Ai表示Ser,A2表示Ser，As表示Arg，入4表示Thr，A5表示Pro,A^表示Ser,A表示Asp,7As表示Lys，As表示Pro，A!。表示Val，Au表示Ala，Au表示His，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定義的A!-Au中的A"A2、A3、A4、A5、A6、A7、As和A12中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被Ala取代。并通過(guò)生物學(xué)試驗(yàn)就所述抗原表位進(jìn)行了生物學(xué)活性的檢測(cè)，由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容具體地，本發(fā)明提供了1.一種人肺瘤壞死因子a的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列A^AsAoAsAsAAAgAmAnAu(I)其中Ai表示氨基酸S，A2表示氨基酸S，A3表示氨基酸R,A4表示氨基酸T，A5表示氨基酸P,Ae表示氨基酸S，A7表示氨基酸D,As表示氨基酸K，A9表示氨基酸P,A^表示氨基酸V，Au表示氨基酸A,Au表示氨基酸H，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定義的ArAu中的A,、A2、A3、A"A5、A6、A7、A8、A9、A:。和A"中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被氨基酸A取代。2.核苷酸序列，其編碼項(xiàng)目1的通式(I)所示的氨基酸序列、且具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。3.項(xiàng)目1的抗原表位，其中所述取代是指如項(xiàng)目1所定義的A,-Au中的A,、A2、A6、As和Au中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被氨基酸A置換。4.項(xiàng)目l的抗原表位，所述通式(I)是未取代的，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH。5.編碼項(xiàng)目4的SEQIDNO:2的氨基酸序列的核苷酸序列。6.項(xiàng)目l的抗原表位，所述通式(I)是被取代的，其具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列AARTPADAPVAA。7.編碼項(xiàng)目6的SEQIDNO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。8.腫瘤壞死因子cc的抗原表位模擬肽，其具有SEQIDNO4:FHLTPSERPVEA。9.多肽，其在腫瘤壞死因子ot的第4-15位是除SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH以外的、項(xiàng)目1的通式(I)所定義的氨基酸序列。10.核普酸序列，其編碼項(xiàng)目9的多肽。11.多肽，其在胂瘤壞死因子a的第6、7、8或者IO位的氨基酸中的一個(gè)被氨基酸A置換。12.核苷酸序列，其編碼項(xiàng)目ll的多肽。13.—種組合物，其含有項(xiàng)目1、3、4和6的抗原表位，項(xiàng)目8的腫瘤壞死因子a的抗原表位模擬肽，或者項(xiàng)目9和11的多肽。14.項(xiàng)目8的組合物，其中還含有藥學(xué)上可接受的載體。15.—種組合物，其含有項(xiàng)目2、5、7、10或12的核苷酸序列。16.項(xiàng)目IO的組合物，其中還含有藥學(xué)上可接受的載體。17.項(xiàng)目1、3、4和6的抗原表位，項(xiàng)目8的腫瘤壞死因子ot的抗原表位模擬肽，或者項(xiàng)目9和11的多肽在制備用于產(chǎn)生抗人腫瘤壞死因子oc的抗體的免疫原中的用途。18.項(xiàng)目1、3、4和6的抗原表位，項(xiàng)目8的腫瘤壞死因子cc的抗原表位模擬肽，或者項(xiàng)目9和11的多肽在制備疫苗中的用途。19.項(xiàng)目1、3、4和6的抗原表位，項(xiàng)目8的肺瘤壞死因子cc的抗原表位模擬肽，或者項(xiàng)目9和11的多肽在制備用于延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA的進(jìn)程的藥物中的用途。20.項(xiàng)目2、5、7、10或12的核苦酸序列在制備用于產(chǎn)生抗人肺瘤壞死因子oc的抗體的免疫原中的用途。21.項(xiàng)目2、5、7、10或12的核苷酸序列在制備疫苗中的用途。22.項(xiàng)目2、5、7、10或12的核苷酸序列在制備用于延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA的進(jìn)程的藥物中的用途。圖1:表示陽(yáng)性噬菌體克隆的竟?fàn)嶦LISA結(jié)果。圖2:表示噬菌體結(jié)合肽與hTNFa的序列比對(duì)。圖3:表示抗312-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的BLISA結(jié)果。圖4:表示抗312-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的WesternBolt結(jié)果，其中1表示抗hTNFa,2表示抗312-KLH。圖5:表示抗YG1-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的ELISA結(jié)果。圖6:表示抗YG1-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的WesternBolt結(jié)果，其中l(wèi)表示抗hTNFa，2表示抗YG1-KLH。圖7:表示YG1與幾種hTNFa抗體反應(yīng)的ELISA結(jié)果。圖8:表示YGl-KLH免疫的大鼠產(chǎn)生抗hTNFa抗體的ELISA結(jié)果。圖9:表示KLH免疫組和YGl-KLH免疫組的大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較。圖IO:表示KLH免疫組和YGl-KLH免疫組的大鼠踝關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分比較。圖11:表示陽(yáng)性噬菌體克隆的竟?fàn)嶦LISA結(jié)果。圖12:表示噬菌體結(jié)合肽與hTNFa的序列比對(duì)。圖13:表示抗AP-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的ELISA結(jié)果。10圖14:表,示抗AP-KLH抗血清與hTNFa交叉免疫反應(yīng)的WesternBolt結(jié)果，其中1表示抗hTNFa，2表示抗AP-KLH。圖15:表示抗YG1-KLH抗血清與hTNFa及其6個(gè)突變體結(jié)合的ELISA結(jié)果。圖16:表示hTNFot及突變體T5、T6的細(xì)胞毒活性檢測(cè)。具體實(shí)施例方式為了更清楚地闡述本發(fā)明，具體提供了下述闡述性的實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不僅僅限定于下述實(shí)施例，任何與本發(fā)明的實(shí)施例等同的變體也包括在本發(fā)明中。實(shí)施例1、噬菌體展示肽庫(kù)篩選抗rhTNFa的抗體結(jié)合肽Ph.D.-12肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自NEB公司，庫(kù)容量為2.7x109,滴度為1.5x1013/(il。f"力er/c力hco/2'ER2537為肽庫(kù)的宿主菌。篩選過(guò)程參見(jiàn)噬菌體展示肽庫(kù)使用說(shuō)明書(shū)。每輪篩選以抗rhTNFoc抗體(每孔10卩g)包被，每孔投入lxl(T噬菌體。噬菌體富集通過(guò)抗入/產(chǎn)出比計(jì)算。經(jīng)過(guò)三輪篩選，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。陽(yáng)性噬菌體克隆與抗rhTNFoc抗體的特異性結(jié)合通過(guò)ELISA測(cè)定?？箁hTNFoc抗體(每孔10ng)包被96孔板(Nunc公司)4。C過(guò)夜。傾去不結(jié)合的抗體，3%BSA37X:封閉1小時(shí)。每孔投入lxl(T噬菌體37。C孵育2小時(shí)。洗滌液(PBS-O.05。/。Tween20)洗板5次，共3分鐘?？筂13單抗(1:IOOQ稀釋?zhuān)珹mershamBiosciences公司)37。C孵育l小時(shí)。洗滌方法同上，以TMB(Sigma)為底物檢測(cè)結(jié)合的抗M13單抗，450nm檢測(cè)光吸收，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)竟?fàn)嶦LISA確定陽(yáng)性噬菌體克隆，即抗rhTNFoc抗體(每孔lO)ag)包被96孔板(Nunc公司)，加入不同劑量的rhTNFa與lx109噬菌體混合物孵育，抗M13單抗(1:1000稀釋?zhuān)珹mershamBiosciences乂〉司)檢測(cè)結(jié)合的嗟菌體，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖l可知，這12個(gè)克隆均為陽(yáng)性克隆。2、rhTNFa抗原表位的獲得及其活性驗(yàn)證對(duì)挑取的20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得了7條陽(yáng)性克隆的展示肽序列(見(jiàn)表1)。通過(guò)比對(duì)這些結(jié)合肽序列，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)其與hTNFa的4-13位氨基酸序列相似性很高(見(jiàn)圖2)。申請(qǐng)人據(jù)此合成了312號(hào)肽，其具體的氨基酸序列為FHLTPSERPVEA(SEQIDN0:4)，并將其與KLH偶聯(lián)以制備多抗。ELSIA和Westernblot結(jié)果表明，制備的抗血清能夠與rhTNF發(fā)生交叉免疫反應(yīng)(見(jiàn)圖3、4),提示此多肽為hTNFa的模擬表位，而hTNFa的相應(yīng)區(qū)段(4-15位氨基酸)可能是一個(gè)抗原表位。因此申請(qǐng)人合成了hTNFa的第4-15位氨基酸對(duì)應(yīng)的肽段，其氨基酸序列為SSRTPSDKPVAH(SEQIDNO:2)將其偶聯(lián)KLH后免疫動(dòng)物。ELSIA和Westernblot結(jié)果顯示，獲得的抗血清能夠與rhTNFa特異結(jié)合(見(jiàn)圖5、6)，表明該區(qū)段是一個(gè)潛在的抗原表位(命名為YG1)。表l噬菌體展示肽序列測(cè)定結(jié)果噬菌體克隆序列31RPPADEPLLTSR33EHRWPADNPVPR34RTPAHDPIjEHRF38STPOLPRLSIjSIj39ATPSDLPIAPPY310YTPRDSP工ASSQ312314VSRTPSEHTVQP3.YG1是一個(gè)新的hTNFot抗原表位通過(guò)ELISA檢測(cè)抗原表位YG1是否能與商品化的抗體結(jié)合。分別包被合成的抗原表位肽(SEQIDNO:)和rhTNFa(5jag/孔)，再分別加入三種商品化的抗hTNFa單克隆抗體(infliximab,adalimumab和Z12)和抗rhTNFa的多克隆抗體(2ng/孔)孵育。ELISA結(jié)果顯示，該抗原表位肽不能與這些商品化的抗體結(jié)合(見(jiàn)圖7)。因而，申請(qǐng)人認(rèn)為YG1是新的抗原表位。4.YG1延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型CIA的進(jìn)程的驗(yàn)證申請(qǐng)人用膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)研究YG1的生物學(xué)功能。其原理是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性炎性疾病，特征為多關(guān)節(jié)炎伴隨進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷和機(jī)能障礙。在患者發(fā)炎的滑膜尤其是軟骨與血管翳結(jié)合處TNF-oc高水平表達(dá)。事實(shí)上，英夫利西(Infliximab,人鼠嵌合型的抗hTNFoc單抗)與依那西普(可溶性TNF受體-Fc融合蛋白)均已在臨床上用于RA治療。膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是多關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其許多組織病理學(xué)特征與RA相似。申請(qǐng)人采用此動(dòng)物模型研究獲得的抗原表位的功能。按照文獻(xiàn)方法，以bovineCII(Sigma公司)免疫7周齡Lewis大鼠。將A組、B組分別用bovineCII(Sigma>&司)免疫兩次，C組作為對(duì)照。CII以終濃度4mg/ml溶于0.1M乙酸，與等體積與完全弗氏混合，第0、7天皮內(nèi)注射尾巴末梢。每只大鼠注射150jal(含300ngofCII)。關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和嚴(yán)重程度通過(guò)體重減輕和爪子腫脹程度、紅斑和關(guān)節(jié)變形進(jìn)行評(píng)估。關(guān)節(jié)損傷的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0-4，0分為無(wú)改變，1分為腫脹和趾上出現(xiàn)紅斑，2分為輕微腫脹和肢體上紅斑，3分為明顯肺脹和肢體上紅斑，4分為明顯變形和肢體運(yùn)動(dòng)障礙。每只大鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分為各爪的評(píng)分相加，最高為16分。將大鼠分為三組，分別用KLH偶聯(lián)的YG1或KLH預(yù)先免疫兩次。ELISA結(jié)果顯示，YG1能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生特異性的抗hTNFa抗血清(見(jiàn)圖8)。第一次免疫后12至14天，A組和B組的16只大鼠均出現(xiàn)了關(guān)節(jié)腫脹，發(fā)病率為100%。預(yù)先用YG1免疫的大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯低于預(yù)先用KLH免疫的大鼠(見(jiàn)圖9)。C組大鼠未出體重減輕和皮膚病損。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，切去后爪固定于10%中性緩沖液配制的福爾馬林溶液48小時(shí)，10%(w/v)EDTA-2Na脫鈣至骨易彎曲。組織在梯度濃度酒精中膠脫水，石蠟包埋，4nim切割，蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下觀察炎癥程度和軟骨和骨的破壞，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分為滑膜正常，1分為滑膜腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，2分為血管翳和軟骨侵蝕，3分為大多數(shù)軟骨和軟骨下骨侵蝕，4分為關(guān)節(jié)不完整和僵硬。預(yù)先用YG1免疫的大鼠踝關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分也明顯低于預(yù)先用KLH免疫的大鼠(見(jiàn)圖10)。這些結(jié)果表明，通過(guò)抗原表位YG1免疫動(dòng)物能夠延緩CIA的進(jìn)程。5.構(gòu)建丙氨酸掃描肽庫(kù)并應(yīng)用該肽庫(kù)確定抗原表位YG1中的關(guān)鍵氨基酸殘基丙氨酸掃描肽庫(kù)是基于噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)進(jìn)行的高通量、快速的丙氨酸掃描方法，即由丙氨酸殘基替代目標(biāo)序列中的各個(gè)氨基酸殘基，由此驗(yàn)證所述氨基酸的在所述序列中的作用[WeissG.A.,etal.(2000)ProcNatlAcadSci，16:8950-8954]。具體地，申請(qǐng)人利用載體M13KEgffl進(jìn)行用于丙氨酸掃描的肽庫(kù)構(gòu)建，Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem購(gòu)自NEB/>司。合成了一條寡核苷酸鏈5，-CATGTTTCGGCCGAAKSAGCARCAGSCKYAKCAGMAGSAGYCSYAGMAGMAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3，(SEQIDNO:以IUB編碼表示，即K=G/T，M-A/C，N=A/C/G/T，R=A/G，S-G/C，W=A/T,Y=C/T))，其中含有編碼hTNFa(4-15)(具體氨基酸序列為SSRTPSDKPVAHSEQIDNO:1)或丙氨酸突變的序列(見(jiàn)表2)。表2:丙氨酸掃描肽庫(kù)中的展示肽密碼子天然序列中的丙氨酸掃描對(duì)丙氨酸掃描對(duì)應(yīng)氨基酸殘基應(yīng)的密碼子的氨基酸sKCTA/SsKCTA/SRRSGA/G/T/RTRCTA/TPSCTA/PSKCTA/SDGMTA/DK墜A/E/T/KPSCTA/PVGYTA/VAGCTAHSMTA/D/P/H14將該DM片段與延伸引物退火，進(jìn)而用DM聚合酶，Klenow大片段延伸成雙鏈。Acc65I和EagI雙酶切該雙鏈DNA，得到約60bp大小的片段，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，洗脫緩沖液(0.5MNH4AC，10mMMg(AC)2，和lmMEDTA)洗脫，并通過(guò)乙醇沉淀純化、濃縮。Acc65I和Eagl雙酶切的M13KE載體與純化的DNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ER2537感受態(tài)細(xì)胞，共轉(zhuǎn)化10次，轉(zhuǎn)化后的混合物接種于200ml對(duì)數(shù)早期的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4.5h。噬菌體的純化參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。隨機(jī)挑取20個(gè)原始轉(zhuǎn)化子測(cè)序鑒定。通過(guò)生物淘洗和竟?fàn)嶦LISA，獲得了抗hTNFa抗體特異性的結(jié)合肽(見(jiàn)圖11)。然后進(jìn)行測(cè)序，并將獲得的序列和建庫(kù)的模板序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中的7個(gè)氨基酸殘基為關(guān)鍵殘基，即XXRTPXDXPVAX，其中X為任意氨基酸(見(jiàn)圖12)。因此設(shè)計(jì)合成了多肽AP(具體序列為AARTPADAPVAA，SEQIDNO:3)，其含有7個(gè)關(guān)鍵殘基，其它位置上的氨基酸殘基均由丙氨酸殘基取代，將多肽AP與KLH偶聯(lián)，免疫小鼠以制備多抗。ELSIA和Westernblot結(jié)果顯示，獲得的抗血清能夠與rhTNFa特異結(jié)合(見(jiàn)圖13、14)，說(shuō)明這些關(guān)鍵的氨基酸殘基足以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗hTNFa的抗體。因?yàn)樗龅目乖木切‰?，為了?yàn)證這些小肽在完整hTNFa上是否還能表現(xiàn)出抗原肽的作用，申請(qǐng)人對(duì)位于完整hTNFa上的、與YG1相對(duì)應(yīng)的肽區(qū)域進(jìn)行了選擇性的點(diǎn)突變。表3:hTNF-a及6個(gè)突變體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>突變的位點(diǎn)詳見(jiàn)表3，并人工設(shè)計(jì)了用于hTNFa點(diǎn)突變的引物(表4),通過(guò)PCR擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的基因片段，并將這些片段分別克隆到表達(dá)栽體pET28a(購(gòu)自Novagen^^司)，表達(dá)純化了6個(gè)突變體蛋白(T1-T6)。表4:hTNF-oc及6個(gè)突變體的引物引物序列(5'-3，)野生型正向引物R-A:CGT-GCTTl正向引物R-A:CGT-GCTT2正向引物T-A:ACT-GCTT3正向引物P-A:CCG-GCGT4正向引物D-A:GAC-GCCT5正向引物P-A:CCT-GCTT6正向引物V-A:GTA-GCA反向引物GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:5)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTgcTACTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:6)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTgCTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:7)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACT^GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:8)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGcCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:9)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAAG^TGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:10)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAA11)12)GCCTGcAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:CCGCTCGAGTCACAGGGCAATGATCCCAA(SEQIDNO:注小寫(xiě)字母為突變位點(diǎn)，下劃線對(duì)應(yīng)的為酶切位點(diǎn)對(duì)6個(gè)突變體進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證，6個(gè)突變體與抗YG1-KLH抗血清的ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明(見(jiàn)圖15)，T5和T6不能與該抗血清反應(yīng)，提示Pro"和Val"可能為抗原表位YG1中最重要的氨基酸殘基。6.通過(guò)TNFa的細(xì)胞毒活性對(duì)突變體T5和T6的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。將L929細(xì)胞100(il以每孔4xl(T個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板(Costar公司)，于含10。/。胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco公司)16不同濃度，將稀釋后的蛋白20nl與5|il放線菌素D(25pg/ml)加入細(xì)胞板中，37X:、5%C02條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。細(xì)胞存活率通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的MTT法測(cè)定，595nm測(cè)定光吸收，以計(jì)算存活細(xì)胞的百分比。結(jié)果突變體T5和T6的細(xì)胞毒活性明顯減弱(見(jiàn)圖16)，表明這兩個(gè)突變體突變的氨基酸殘基Pro"和Val"可能為表位YG中最重要的氨基酸殘基，其對(duì)于TNF-a發(fā)揮生物活性起著重要作用。綜上可知，本申請(qǐng)的系列肽以SEQIDNo:2為基礎(chǔ)，除了第3、4、5、8、9、IO位氨基酸以外，即使任選地替換為丙氨酸，也不影響其作為T(mén)NF-a抗原表位的功能，而且體外生物學(xué)活性試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，由此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳缡?I)所示的抗原表位。序列表〈110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120〉人腫瘤壞死因子a抗原表位及其制備方法和用途<130>IDC080040<160>12<170>Patentlnversion3.2<210〉1<211〉76<212〉腿<213〉人工序列，K:G/T，M=A/C，N=A/C/G/T，R=A/G,S=G/C，W=A/T,Y=C/T<400>1catgtttcggccgaaksagcarcagsckyakcagmagsagycsyagraagmagagtgagaa60tagaaaggtacccggg76<210>2<211>12<212〉PRT<213>人工序列，YGl,TNFa3—15位氨基酸〈400〉2SerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHis1510<210〉3<211>12<212>PRT〈213〉人工序列，多肽AP〈400〉3AlaAlaArgThrProAlaAspAlaProValAlaAla1510<210>4<211>12<212>PRT<213〉人工序列，312號(hào)肽<400〉'4PheHisLeuThrProSerGluArgProValGluAla1510〈210〉5<211>66<212>DNA<213〉引物<400>5gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210>6<211>66<212>DNA<213〉引物<400>6gggaattccatatggtacgttcttcttctgctactccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210>7<211>66<212〉DNA<213〉引物<400>7gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtgctccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66〈210〉8<211>66<212〉DNA19<213>引物<400>8gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactgcgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210〉9<211>66<212〉DNA<213〉引物<400>9gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgccaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210〉10<211>66<212〉DNA<213>引物<400>10gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaaggctgtagcccatg60ttgtag66<210>11<211>66<212〉DNA<213〉引物〈400〉11gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaagcctgcagcccatg60ttgtag66'<210〉12<211〉29<212>DNA<213>引物20<400>12ccgctcgagtcacagggcaatgatcccaa29權(quán)利要求1.一種人腫瘤壞死因子α的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12(I)其中A1表示氨基酸S，A2表示氨基酸S，A3表示氨基酸R，A4表示氨基酸T，A5表示氨基酸P，A6表示氨基酸S，A7表示氨基酸D，A8表示氨基酸K，A9表示氨基酸P，A10表示氨基酸V，A11表示氨基酸A，A12表示氨基酸H，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定義的A1-A12中的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A12中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被氨基酸A取代。2.核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1的通式(I)所示的氨基酸序列、且具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。3.權(quán)利要求1的抗原表位，其中所述取代是指如權(quán)利要求1所定義的A!-Au中的A,、A2、A6、As和A12中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被氨基酸A置換。4.權(quán)利要求1的抗原表位，所述通式(I)是未取代的，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH。5.編碼權(quán)利要求4的SEQIDNO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1的抗原表位，所述通式(I)是被取代的，其具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列AARTPADAPVAA。7.編碼權(quán)利要求6的SEQIDNO:4的氨基酸序列的核苷酸序列。8.腫瘤壞死因子ot的抗原表位模擬肽，其具有SEQIDNO5:FHLTPSERPVEA。9.多肽，其在腫瘤壞死因子oc的第4-15位是除SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH以外的、權(quán)利要求1的通式(I)所定義的氨基酸序列。10.核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求9的多肽。11.多肽，其在腫瘤壞死因子oc的第6、7、8或者IO位的氨基酸中的一個(gè)被氨基酸A置換。12.核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求11的多肽。13.—種組合物，其含有權(quán)利要求l、3、4和6的抗原表位，權(quán)利要求8的腫瘤壞死因子ct的抗原表位模擬肽，或者權(quán)利要求9和11的多肽。14.權(quán)利要求8的組合物，其中還含有藥學(xué)上可接受的載體。15.—種組合物，其含有權(quán)利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列。16.權(quán)利要求10的組合物，其中還含有藥學(xué)上可接受的載體。17.權(quán)利要求l、3、4和6的抗原表位、權(quán)利要求8的肺瘤壞死因子ct的抗原表位模擬肽或者權(quán)利要求9和11的多肽在制備用于產(chǎn)生抗人肺瘤壞死因子a的抗體的免疫原中的用途。18.權(quán)利要求1、3、4和6的抗原表位、權(quán)利要求8的胂瘤壞死因子a的抗原表位模擬肽或者權(quán)利要求9和11的多肽在制備疫苗中的用途。19.權(quán)利要求l、3、4和6的抗原表位、權(quán)利要求8的肺瘤壞死因子oc的抗原表位模擬肽或者權(quán)利要求9和11的多肽在制備用于延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA的進(jìn)程的藥物中的用途。20.權(quán)利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制備用于產(chǎn)生抗人腫瘤壞死因子oc的抗體的免疫原中的用途。21.權(quán)利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制備疫苗中的用途。22.權(quán)利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制備用于延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA的進(jìn)程的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了人腫瘤壞死因子α的抗原表位，其具有通式(I)所示的氨基酸序列A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀A₁₁A₁₂其中，A₁、A₂、A₆表示氨基酸S；A₅、A₉表示氨基酸P；A₃、A₄、A₇、A₈、A₁₀、A₁₁、A₁₂分別表示氨基酸R、T、D、K、V、A、H；通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，所述取代是指如上定義的A₁-A₁₂中的A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇、A₈、A₉、A₁₀和A₁₂中的一個(gè)或者多個(gè)任選地被氨基酸A取代；本發(fā)明還提供了所述抗原表位的制備方法和用途。文檔編號(hào)C07K7/00GK101654475SQ200810147190公開(kāi)日2010年2月24日申請(qǐng)日期2008年8月22日優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日發(fā)明者玉劉,光楊,沈倍奮,潔董,邵寧生,高亞萍申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所