一種阿苯達(dá)唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阿苯達(dá)唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的阿苯達(dá)唑人工抗原為將式I所示的阿苯達(dá)唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。本發(fā)明所提供阿苯達(dá)唑人工抗原合成方法簡(jiǎn)單，純度高和產(chǎn)率高，對(duì)于阿苯達(dá)唑抗體的制備，以及阿苯達(dá)唑藥物殘留檢測(cè)具有重大價(jià)值。
【專利說明】
一種阿苯達(dá)唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種阿苯達(dá)唑人工抗原及其制備方法與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿苯達(dá)唑?yàn)橐桓咝У投镜膹V譜驅(qū)蟲藥。臨床可用于驅(qū)蛔蟲、蟯蟲、絳蟲、鞭蟲、鉤 蟲、糞圓線蟲等。在體內(nèi)代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲對(duì)葡萄糖的吸收，導(dǎo)致蟲體糖 原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統(tǒng)，阻礙ATP的產(chǎn)生，使寄生蟲無法存活和繁殖。在動(dòng)物食 品中的殘留對(duì)人體健康有潛在的威脅。
[0003] 目前，獸藥殘留檢測(cè)常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用等理化 分析方法。雖然這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也 不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫化學(xué)分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特的優(yōu) 勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在 阿苯達(dá)唑的殘留檢測(cè)中起著越來越重要的作用。
[0004] 影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定于 免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分 子獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種阿苯達(dá)唑人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的阿苯達(dá)唑人工抗原是在阿苯達(dá)唑半抗原的基礎(chǔ)上構(gòu)建所得的抗 原。
[0007] 所述阿苯達(dá)唑半抗原屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其結(jié)構(gòu)如式I所示。
[0008]
12 本發(fā)明還提供了制備所述阿苯達(dá)唑半抗原的方法。 2 本發(fā)明所提供的制備所述阿苯達(dá)唑半抗原的方法，具體可包括如下步驟:將阿苯 達(dá)挫與4-氨基丁酸按照質(zhì)量比為500mg: 550-580mg (如580mg)的比例進(jìn)行反應(yīng)，獲得所述化 合物。
[0011] 其中，所述反應(yīng)的溫度具體可為70-80°C (如80°C)，時(shí)間具體可為4-5h(如5h)。所 述反應(yīng)的溶劑為二甲基甲酰胺(DMF)。
[0012]具體而言，制備所述阿苯達(dá)唑半抗原的方法包括如下步驟:將阿苯達(dá)唑溶于二甲 基甲酰胺(DMF)中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯達(dá)唑、所述二甲基甲酰胺(DMF)和所述4-氨 基丁酸的配比為 50011^:201111:550-58011^(如58011^)，70-80°(：(如80°(：)反應(yīng)4-511(如511)，獲 得所述化合物。
[0013] 在所述"70-80°C (如80°C)反應(yīng)4-5h(如5h)"后還可包括如下步驟：向反應(yīng)液中加 入冰水，析出白色固體，過濾，水洗干燥，獲得所述化合物。其中，所述阿苯達(dá)唑、所述二甲基 甲酰胺（DMF)、所述4-氨基丁酸和所述冰水的配比為500mg :20ml:550-580mgGn580mg): 10ml 〇
[0014] 在阿苯達(dá)唑半抗原的基礎(chǔ)上構(gòu)建所得的阿苯達(dá)唑抗原也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 所述阿苯達(dá)唑抗原，為將所述阿苯達(dá)唑半抗原(式I)與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述載體蛋白具體為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0016] 所述阿苯達(dá)唑抗原的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 所述阿苯達(dá)唑抗原的制備方法，具體可包括如下步驟:將所述阿苯達(dá)唑半抗原(式 I)與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯(lián)，獲得所述阿苯達(dá)唑抗原。
[0018] 其中，所述阿苯達(dá)唑半抗原(式I)與所述載體蛋白偶聯(lián)的摩爾比為13.70:1。
[0019] 在本發(fā)明中，所述阿苯達(dá)唑抗原具體是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：
[0020] (al)將所述阿苯達(dá)唑半抗原（式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，20-25°C磁力攪 拌反應(yīng)3h，得到溶液I;
[0021] 其中，所述阿苯達(dá)唑半抗原（式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、所述N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的配比為15mg: 1.5ml: 26mg：25mg；
[0022] (a2)將所述載體蛋白置于0.1M碳酸緩沖液中，4000rpm攪拌10mn，充分溶解，得到 溶液II;所述〇. 1M碳酸緩沖液的pH為9.6，溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:碳酸鈉0. lmol/L，碳 酸氫鈉〇. lmol/L;所述載體蛋白與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為5〇-67mg: 3.5ml;
[0023] 其中，若所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)，則所述牛血清白蛋白（BSA)與所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為50mg:3.5ml;若所述載體蛋白為卵清蛋白（0VA)，則所述卵清蛋白 (0VA)與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為67mg: 3.5ml;
[0024] (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件A進(jìn)行混合，混合后后于20_25°C磁力攪 拌反應(yīng)24h，得到溶液III;
[0025] 所述條件A為:所述溶液I中的所述阿苯達(dá)唑半抗原(式I)與所述溶液II中的所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為15mg: 3.5ml;
[0026] 其中，將所述溶液I和所述溶液II混合，具體為在4°C條件下，將所述溶液I逐滴加 入到所述溶液Π 中，邊加邊攪拌；
[0027] (a4)用磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.4)，于4°C(對(duì)所述溶液III攪拌透析3天， 得到所述阿苯達(dá)唑抗原;所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、 氯化鈉和氯化鉀;所述磷酸二氫鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為〇. 27g/L，所述磷酸氫二 鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.42g/L，所述氯化鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為 8g/L，所述氯化鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.2g/L;所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。 [0028] 所述阿苯達(dá)唑半抗原(式I)或所述阿苯達(dá)唑抗原在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0029] (a)定性或定量檢測(cè)阿苯達(dá)唑；
[0030] (b)制備阿苯達(dá)唑抗體。
[0031]利用所述阿苯達(dá)唑抗原制備的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032 ]所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體或抗血清。
[0033] 本發(fā)明所提供的阿苯達(dá)唑半抗原，以及所述阿苯達(dá)唑抗原，合成方法簡(jiǎn)單，純度高 和產(chǎn)率高，對(duì)于阿苯達(dá)唑抗體的制備，以及阿苯達(dá)唑藥物殘留檢測(cè)具有重大價(jià)值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為阿苯達(dá)唑半抗原的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果圖。
[0035] 圖 2 為BSA 的 MALDI-T0F-MAS 圖。
[0036] 圖3為阿苯達(dá)唑BSA復(fù)合物的MALDI-T0F-MAS圖。。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 阿苯達(dá)唑:百靈威科技有限公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為282654。
[0040]實(shí)施例1、阿苯達(dá)唑半抗原的制備 [0041 ] 一、阿苯達(dá)唑半抗原的制備
[0042] 在50ml圓底燒瓶中加入阿苯達(dá)唑500mg，20ml二甲基甲酰胺(DMF)(作為反應(yīng)的溶 劑)溶解后加入4-氨基丁酸580mg，80°C反應(yīng)5h，TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完畢后處理，將反應(yīng)液滴 加到10ml冰水中，析出白色固體，過濾，水洗干燥得320mg產(chǎn)品。
[0043] 反應(yīng)方程式如下：
[0044]
[0045] 二、阿苯達(dá)唑半抗原的結(jié)構(gòu)鑒定
[0046] 對(duì)所得 320mg 產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，M+:M+H = 337.2，M+Na = 359.2，M-:M-H = 335.4， 如圖1所示。結(jié)果顯示其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示(Mff=336.4)，即為阿苯達(dá)唑半抗原。
[0047] 123 大肥 土八丄-」幾評(píng)>μ:_| 2 -、阿苯達(dá)唑人工抗原的制備 3 1、免疫原的合成
[0051] (1)將實(shí)施例1制備得到的半抗原（式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中， 完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)3h，得到溶液I。
[0052] (2)稱取50mg牛血清白蛋白（BSA)，溶解于3.5mL 0· 1M碳酸緩沖液中，400rpm攪拌 lOmin，充分溶解，得到溶液II。
[0053]其中，所述0. 1M碳酸緩沖液的pH為9. 6,溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下： Na2C〇3l.59g/L，NaHC〇3 2.94g/L。
[0054] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )環(huán)境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)24h，得到溶液III。
[0055] (4)將所述溶液III裝入1個(gè)蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL 0.01M roS(pH = 7.4) 透析3天，4 °C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產(chǎn)物4500rpm離心6min，0.5ml/管分 裝，將抗原編號(hào)，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0056] 其中，所述0.01M PBS(pH=7.4)的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：磷酸二氫鉀 0.27g/L，磷酸氫二鈉1.42g/L，氯化鈉8g/L，氯化鉀0.2g/L。
[0057] 2、包被原的合成
[0058] (1)將實(shí)施例1制備得到的半抗原（式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中， 完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)3h，得到溶液I。
[0059] (2)稱取67 · Omg卵清蛋白（0VA)，溶解于3 · 5mL 0 · 1Μ碳酸緩沖液pH = 9 · 6 (配方同 上）中，400rpm攪拌1 Omin，充分溶解，得到溶液II。
[0060] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )環(huán)境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)24h，得到溶液III。
[0061 ] (4)將所述溶液III裝入1個(gè)蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL0.01M PBS(pH = 7.4) (配方同上)透析3天，4 °C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產(chǎn)物4500rpm離心6min， 0.5ml/管分裝，將抗原編號(hào)，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0062]二、阿苯達(dá)唑人工抗原的鑒定
[0063] 免疫原 MALDI-TOF-MS 鑒定結(jié)果顯示偶聯(lián)比為：R= (70895 · 500-66288 · 367)/336 · 4 = 13.70(圖2和圖3)。即免疫原中，所述阿苯達(dá)唑半抗原(式I)與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)的 摩爾比為13.70:1。
[0064] 實(shí)施例3、阿苯達(dá)唑人工抗原免疫動(dòng)物制備抗血清
[0065] 一、動(dòng)物免疫
[0066]用步驟實(shí)施例2獲得的阿苯達(dá)唑人工抗原"阿苯達(dá)唑-BSA"作為免疫原免疫新西蘭 大白兔。每次免疫劑量為1〇〇~200!^，免疫方式為雙肩部和后大腿皮下多點(diǎn)注射，每個(gè)區(qū)域 大約用1/4的免疫原。首免時(shí)將免疫原用生理鹽水稀釋，然后與弗氏不完全佐劑進(jìn)行1:1(體 積比）混合制成乳化劑，每間隔2周取相同劑量免疫原加等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后 加強(qiáng)免疫一次，采用此方式共加免3次后，間隔3~4周再取相同劑量免疫原加弗式不完全佐 劑進(jìn)行末次免疫，耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。末次免疫7-10天后采用頸動(dòng)脈放血，每只兔子 可得血100-120ml左右，取完的血在4°C冰箱放置5~6小時(shí)，然后以5000rpm離心10min，分離 血清。
[0067]二、抗血清效價(jià)測(cè)定
[0068]采用間接ELISA法測(cè)定步驟一所得血清的抗體效價(jià)，具體如下：
[0069] 1)包被:在96孔酶標(biāo)板中加入lOOyL濃度為2yg/mL的"阿苯達(dá)唑-OVA"溶液（用包被 緩沖液進(jìn)行稀釋），同時(shí)設(shè)置不包被抗原的對(duì)照，4°C包被過夜，用PBS緩沖液洗滌3次。
[0070] 包被緩沖液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(溶劑為水，溶質(zhì)及其濃 度如下：Na 2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0071] 2)封閉：加入150μLν孔的封閉液，在37 °C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍干。置于4 °(：冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0072]封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸鹽緩 沖液，PH7.4。
[0073] 3)加待測(cè)樣品：吸取不同稀釋度的待測(cè)血清100μΙ，加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板中，37°C孵 育30min，洗板4次，拍干。
[0074]同時(shí)設(shè)置未經(jīng)免疫的兔血清的對(duì)照；以PBS代替待檢測(cè)樣品的對(duì)照（陰性對(duì)照孔）。
[0075] 4)加酶標(biāo)二抗:取HRP標(biāo)羊抗兔IgG抗體(Jackson ImmunoResearch公司，貨號(hào)111-035-003)，按體積比1:5000倍稀釋后，100μΙ/孔，37°C孵育20至30min，洗滌4次，拍干。
[0076] 5)顯色:將 20 X TMB 稀釋至1 X TMB，按100μΙ/孔加入，37 °C 顯色 15-30min。
[0077] 6)終止：加入終止液（2M H2S〇4)50yl/孔。
[0078] 7)讀數(shù)：以450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔0D值，以與陰性對(duì)照孔（以PBS代替待測(cè)樣品的對(duì) 照)0D值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為血清效價(jià)的臨界點(diǎn)。
[0079] ELISA結(jié)果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀釋倍數(shù)表示。
[0080] 結(jié)果表明血清中的抗體效價(jià)為1:20000。
[0081 ]實(shí)施例4、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿苯達(dá)唑
[0082] -、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝
[0083] 1、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的組成包括如下：
[0084] (1)阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品工作液:6瓶，1 · 5mL/瓶，濃度為0ng/ml、0 · 15ng/ml、0.45ng/ ml、1·35ng/ml、4·05ng/ml、12·15ng/ml;
[0085] (2)阿苯達(dá)唑酶標(biāo)板：1塊(8孔X 12條），為包被了實(shí)施例2制備得到的"阿苯達(dá)唑-0VA"的酶標(biāo)板。
[0086] (3)阿苯達(dá)唑抗體工作液：1瓶(7mL)，為抗體稀釋液將抗體進(jìn)行1:8000稀釋，抗體 稀釋液為含6% (體積分?jǐn)?shù)）山羊血清的0.2mol/L PBS，所述阿苯達(dá)唑抗體為實(shí)施例3制備得 到的抗血清純化所得的抗體。
[0087] (4)酶標(biāo)記物工作液：1瓶（12mL)，酶標(biāo)記物具體為經(jīng)辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠 的抗體。
[0088] (5)樣品稀釋液：1 瓶（10X，15mL)，為0.01M ρΗ7·4的PBS。
[0089] (6)洗滌液：1 瓶（20Χ，25mL)，為0.01mol/L ρΗ7·4的PBST溶液。
[0090] (7)底物Α液、底物Β液各1瓶(7mL)。其中，底物Α為2%過氧化脲水溶液。底物Β為1 % 四甲基聯(lián)苯胺水溶液。
[0091] (8)終止液：1瓶(7mL)，為2mol/L H2S〇4溶液。
[0092] (9)蓋板膜；
[0093] (10)自封袋。
[0094] 2、需要而未提供的設(shè)備和材料
[0095] (1)設(shè)備
[0096] 酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm)、天平(精度:0.01g)、漩渦振蕩器、離心 機(jī)(4000g)、搖床(300rpm)、氮吹儀、微量移液器、計(jì)時(shí)器。
[0097] (2)試劑
[0098] 樣品提取液:稱取NaCl 20g，K2HP〇4 · 3H20 26g于干凈燒杯中，加入200mL去離子水 溶解。
[0099] 乙酸乙酯、正己烷。
[0100] 3、貯存
[0101] 該試劑盒貯存于2_8°c，切勿冷凍，有效期1年。
[0102] 未使用完的酶標(biāo)板條應(yīng)密封，2_8°C保存。
[0103] 4、試劑盒檢測(cè)原理
[0104] 樣品中的阿苯達(dá)唑與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)記物，催化 底物顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中阿苯達(dá)唑的含量。顯色深，含量少，反之，含量多。
[0105] 二、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法
[0106] 1、樣品前處理
[0107] (1)雞肉、鴨肉(稀釋系數(shù):1)
[0108] a)取2±0.02g組織樣品于50mL離心管中，加入2mL樣品提取液(見步驟一2)，充分 禍動(dòng)30s;b)加入8mL乙酸乙酯，禍動(dòng)lmin;c)搖床300rpm振搖10min;d)4000g以上，離心 1 Omin; e)取4mL上清液于新的4mL離心管中；f)50-60°C水浴中，氮?dú)獯蹈?g)加入lmL樣品稀 釋液，再加入2mL正己燒，充分禍動(dòng)lmin;h)4000g以上，離心5min，完全棄去上層正己燒及中 間層雜質(zhì)；i)取50yL進(jìn)行檢測(cè)。
[0109] (2)原奶(稀釋系數(shù):2)
[0110] a)取2ml新鮮原奶于50mL離心管中，加入8mL乙酸乙酯，劇烈渦動(dòng)lmin(如果使用多 管漩禍混合儀則需禍動(dòng)2min); b)4000g以上，離心10min; c)取2mL上清液于新的4mL離心管 中（注:避免吸入上層漂浮雜質(zhì)，否則影響檢測(cè)結(jié)果）；d)50-60°C水浴中，氮?dú)獯蹈?e)加入 lmL樣品稀釋液，再加入2mL正己燒，充分禍動(dòng)lmin;f )4000g以上，離心5min，完全棄去上層 正己烷及中間層雜質(zhì);g)取50yL進(jìn)行檢測(cè)。
[0川]2、檢測(cè)步驟
[0112] (1)將板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，建議均做雙孔平 行，未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2_8°C環(huán)境中；
[0113] (2)將50yL各濃度的阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品工作液(或待測(cè)樣品溶液)分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo) 準(zhǔn)品(或待測(cè)樣品孔)中；
[0114] (3)在每孔中加入50yL阿苯達(dá)唑抗體工作液；
[0115] (4)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25 ± 2 °C )，避光反應(yīng) 20min；
[0116] (5)揭開蓋板膜；
[0117] (6)倒掉板孔中液體，在每孔加入260yL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15-30s ；
[0118] (7)倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干；
[0119] (8)立即在每孔中加入1 OOyL酶標(biāo)記物工作液；
[0120] (9)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25 ±2°C)，避光反應(yīng) 20min；
[0121] (10)重復(fù)步驟(5)-(7);
[0122 ] (11)立即在每孔中加入lOOyL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按體 積1:1混合，必須充分混勾，混合液在5min內(nèi)使用，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑）；
[0123] (12)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下(25 ± 2 °C )，避光反應(yīng)15-20min；
[0124] (13)揭開蓋板膜，在每孔中加入50yL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板1 Os，充分混勻；
[0125] (14)終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值。
[0126] 3、結(jié)果計(jì)算或判定
[0127] (1)各標(biāo)準(zhǔn)品（或待測(cè)樣品）的平均吸光度值，除以零標(biāo)(濃度為Ong/ml的標(biāo)準(zhǔn)品） 吸光度值，乘以100,可以得到各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
[0128]
[0129] (2)以各標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光度值為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的阿苯達(dá)唑濃度為橫坐標(biāo)繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0130] (3)將待測(cè)樣品的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可得出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的濃度， 再乘以相應(yīng)樣品的稀釋倍數(shù)，方得待測(cè)原樣品中阿苯達(dá)唑的實(shí)際含量。
[0131 ]三、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿苯達(dá)唑
[0132] 1、特異性檢測(cè)
[0133] 阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性是通過與相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)來確 定的。交叉反應(yīng)越小，特異性越好。
[0134] 將阿苯達(dá)唑及其它類似物奧苯達(dá)唑、帕苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑和環(huán)苯達(dá)唑分別做系列 稀釋，分別按照如上步驟二2進(jìn)行操作，以阿苯達(dá)唑及其它類似物的系列稀釋液替代其中的 "阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品工作液"，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出各自50%抑制濃度（IC 5Q)，具體 方法如下:得到縱坐標(biāo)數(shù)值等于50%對(duì)應(yīng)的阿苯達(dá)唑濃度(ng/mL)，即IC5Q值。用下式計(jì)算試 劑盒對(duì)阿苯達(dá)唑和各類似物的交叉反應(yīng)率。
[0135]
[0136] 結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)各種類似物的交 叉反應(yīng)率均小于1%。這說明阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)阿苯達(dá)唑具有極高的特異性，可有 效的排除其它類似物的干擾，可專門用于阿苯達(dá)唑的檢測(cè)。
[0137] 表1阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性
[0138]
[0139] ~2、不同樣品的最低檢測(cè)限測(cè)定
[0140] 分別測(cè)定采用阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)雞肉、鴨肉和原奶中阿苯達(dá)唑進(jìn)行檢測(cè) 時(shí)的最低檢測(cè)限。具體方法如步驟二。
[0141] 結(jié)果顯示，采用步驟二2(1)中的樣品前處理方法處理雞肉，測(cè)得的最低檢測(cè)限可 達(dá)lng/g(即每g雞肉中含有l(wèi)ng的阿苯達(dá)唑即可被檢測(cè)到，下同）；采用步驟二2(1)中的樣品 前處理方法處理鴨肉，測(cè)得的最低檢測(cè)限可達(dá)lng/g;采用步驟二2(2)中的樣品前處理方法 處理原奶，測(cè)得的最低檢測(cè)限可達(dá)lng/ml。
[0142] 3、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒板內(nèi)板間誤差的測(cè)定
[0143] 分別測(cè)定阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的板內(nèi)誤差和板間誤差。具體方法如步驟二。
[0144] 結(jié)果顯示，試劑盒吸光度的板內(nèi)誤差小于10%，板間誤差小于15%。
[0145] 4、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿苯達(dá)唑的回收率測(cè)定
[0146] 測(cè)定采用阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿苯達(dá)唑的回收率。具體方法如下步驟 --〇
[0147] 結(jié)果顯示，采用阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿苯達(dá)唑的回收率范圍為70-100%〇
[0148] 5、阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度測(cè)定
[0149] 測(cè)定阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度。具體方法如步驟二。
[0150] 結(jié)果顯示，阿苯達(dá)唑酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度為0.15ppb，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0.15ppb-12.15ppb(注：ppb=yg/kg)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示：2. 制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟:將阿苯達(dá)唑與4-氨基丁酸按照質(zhì) 量比為500mg:550-580mg的比例進(jìn)行反應(yīng)，獲得所述化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述反應(yīng)的溫度為70-80°C，時(shí)間為4-5h; 或 所述反應(yīng)的溶劑為二甲基甲酰胺。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述包括如下步驟:將阿苯達(dá)唑溶于二 甲基甲酰胺中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯達(dá)唑、所述二甲基甲酰胺和所述4-氨基丁酸的 配比為500mg: 20ml: 550-580mg，70-80 °C反應(yīng)4-5h，獲得所述化合物。5. 阿苯達(dá)唑抗原，為將權(quán)利要求1所述化合物與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的阿苯達(dá)唑抗原，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或 卵清蛋白。7. 權(quán)利要求5或6所述的阿苯達(dá)唑抗原的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1所述化 合物與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯(lián)，獲得所述阿苯達(dá)唑抗原;和/或 權(quán)利要求1所述化合物與所述載體蛋白偶聯(lián)的摩爾比為13.70:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的阿苯達(dá)唑抗原的制備方法，其特征在于:所述方法包括如下步 驟： (al)將權(quán)利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，20-25°C反應(yīng)3h，得到溶液I; 所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、 所述N-羥基琥泊酰亞胺的配比為15mg: 1.5ml :26mg:25mg; (a2)將所述載體蛋白溶解于0.1 M碳酸緩沖液中，得到溶液II; 所述載體蛋白與所述〇. IM碳酸緩沖液的配比為50-67mg: 3.5ml; (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件A進(jìn)行混合，混合后后于20-25Γ反應(yīng)24h，得 到溶液ΠΙ; 所述條件A為:所述溶液I中的所述化合物與所述溶液II中的所述0.1 M碳酸緩沖液的配 比為15mg:3· 5ml; (a4)用磷酸鹽緩沖液，于4 °C對(duì)所述溶液III透析3天，得到所述阿苯達(dá)唑抗原。9. 權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求5或6所述阿苯達(dá)唑抗原在如下（a)或（b)中的應(yīng) 用： (a) 定性或定量檢測(cè)阿苯達(dá)挫； (b) 制備阿苯達(dá)唑抗體。10. 利用權(quán)利要求5或6所述阿苯達(dá)唑抗原制備的抗體。
【文檔編號(hào)】C07K14/77GK106008361SQ201610388712
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】劉志萍, 蘇麗芳, 于書英, 吳小平, 王文珺, 溫凱, 秦譽(yù), 王照鵬, 楊柳, 邢維維
【申請(qǐng)人】北京維德維康生物技術(shù)有限公司, 西南大學(xué)