專利名稱：長效型膠原蛋白及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是提供一種長效型膠原蛋白及其制造方法，其是透過制備一膠原蛋白 (Collagen),再添加一 Y-聚麩胺酸(Y-PGA)，最后經(jīng)過二次交聯(lián)，即可得到該長效型 膠原蛋白，其不但可增加該膠原蛋白在人體內(nèi)的存留時(shí)間，同時(shí)具有較佳的生物適應(yīng) 性(biocompatibility)等優(yōu)點(diǎn)，使得該長效型膠原蛋白在實(shí)際應(yīng)用上極具產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
人隨著年齡增長，肌膚會因老化而失去光澤、出現(xiàn)皺紋，甚至變得粗糙沒有彈性， 其主要原因是由于皮膚中的真皮層(Dermis)隨著年齡增長，其代謝能力會慢慢衰退， 而真皮層即是肌膚的彈性來源， 一但真皮層的代謝能力退化，肌膚便會隨的老化；于 是坊間逐漸發(fā)展出許多回春(rejuvenate)的方法，而在回春方法中，效果最佳為填充顏 面填充物，而顏面填充物的材料(facial fillers)中又可分為合成材料與天然材料兩種， 該合成材料包含有硅膠(Silicone)、氫氧基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)、聚乳酸 (Poly-lactic acid, PLA)、甲基丙烯酸樹脂(Polymethyl methacrylate, PMMA)及聚甲基丙 烯酸羥乙酯(Hydroxyethylmethacrylate,HEMA)等；而該天然材料則包含有肉毒桿菌 毒素(BT)、自體脂肪(Autologous fat)、膠原蛋白(Collagen)及玻尿酸(Hyaluronic acid,HA) 等。
該合成顏面填充材料卻具有下列缺點(diǎn)
1、 硅膠(Silicone):注射至人體內(nèi)可永久存在于體內(nèi)，不過極容易引起長期發(fā)炎反 應(yīng)及產(chǎn)生肉芽腫(granulomas),必須通過手術(shù)取出；另外，受到地心引力的影響，可 能會有植入物移位(migration)的現(xiàn)象產(chǎn)生，因此美國藥物食品檢驗(yàn)局(Food and Drug Administration,FDA)己明文禁止施打此材料于人體中。
2、 氫氧基磷灰石(HAP):目前以HAP為材料中，如Radiesse，其是唯一通過美 國藥物食品檢驗(yàn)局(FDA)所認(rèn)可的顏面填充物，其雖可維持2 5年不等，不過有時(shí)會 有結(jié)塊(nodule)產(chǎn)生，尤其是在嘴唇部位，相當(dāng)不美觀。3、 聚乳酸(PLA):目前主要是以左型聚乳酸(PLLA)作為施打材料，雖經(jīng)過美 國藥物食品檢驗(yàn)局(FDA)認(rèn)可，不過仍會有肉芽腫(granulomas)產(chǎn)生，是目前所有 顏面填充注射材料(facial fillers)的中，發(fā)生肉芽腫頻率最高者。
4、 甲基丙烯酸樹脂(PMMA):甲基丙烯酸樹脂雖然具有良好的生物適應(yīng)性 (biocompatibility)，但在人體內(nèi)卻不會被降解掉，會造成生物累積，雖是永久性植入
材料，也相當(dāng)容易產(chǎn)生肉芽腫，亦需要開刀取出，故目前已有許多國家禁止甲基丙烯 酸樹脂使用于皮下注射。
5、 聚甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA):其缺點(diǎn)與甲基丙烯酸樹脂類似，不過由于其中 含有一氫氧基(-OH)，所以在施打后其彈性較佳，不過隨著時(shí)間會有硬化現(xiàn)象發(fā)生。
上述該合成顏面填充材料的缺點(diǎn)，主要是會引起嚴(yán)重發(fā)炎反應(yīng)，同時(shí)在人體內(nèi)會 有較大副作用。
又，該天然顏面填充材料亦具有下列缺點(diǎn)-
1、 肉毒桿菌毒素(BT):其是透過阻止乙酰膽堿(acetylcholine)的釋放，以阻斷部分 神經(jīng)與肌肉的生理功能，以達(dá)到消除動態(tài)皺紋的效果，但肉毒桿菌毒素(BT)同時(shí)會阻 斷肌肉的部分生理功能，長期下來肌肉會有退化跡象，故當(dāng)患者在微笑時(shí)，其臉部表 情會不自然；另外，由于肌肉的活動力減少，故患者每天皆必須針對注射的部位進(jìn)行 按摩，另一方面，有研究文獻(xiàn)指出，施打過量肉毒桿菌毒素(BT)有1%的致死機(jī)率。
2、 自體脂肪其材料來源為患者自體的脂肪，所以生物兼容性極高，但由于脂肪 來源及患者的個(gè)體差異，使得自體脂肪在體內(nèi)存留時(shí)間的變異相當(dāng)大，期間可由數(shù)月 至數(shù)年不等，另一方面，由于自體脂肪顆粒較粗大，無法填補(bǔ)小范圍的皺痕或細(xì)紋， 故在使用效果及范圍均相當(dāng)有限。
3、 膠原蛋白目前膠原蛋白有人類活體(human collagen)、人類尸體(cadaveric collagen)、牛(bovine collagen)及豬(porcine collagen)等，其中牛的膠原蛋白(bovine collagen)已使用二十幾年，且都通過美國藥物食品檢驗(yàn)局(FDA)許可，不過由于爆發(fā) 人畜共通的狂牛癥(mad cow disease)疫情，有感染的疑慮；而來自人類活體的膠原蛋白， 雖通過美國藥物食品檢驗(yàn)局許可，但由于其來源取得較為困難，其價(jià)格亦較其它材料 昂貴許多；人類尸體的膠原蛋白雖然來源與人類活體的膠原蛋白相同，但由于受到培 養(yǎng)環(huán)境因素的影響，制備出來的顆粒度(particle size)較大，約介于微米O m)與厘米(mm) 范圍間，故亦需較粗大的針頭，造成患者額外的疼痛感。4、玻尿酸(HA):由于玻尿酸(HA)是由兩種單體(如N-acetyglucosamine與 D-glucuronic acid)聚合而成，是一種多醣類(polysaccharide)，其可被完全代謝，但其 中的該單體(如N-acetyglucosamine)的結(jié)構(gòu)非常接近肝素(heparin)，所以當(dāng)產(chǎn)生傷 口時(shí)，該單體(如N-acetyglucosamine)會進(jìn)行填補(bǔ)，因而導(dǎo)致玻尿酸(HA)的數(shù)量減 少，且由于玻尿酸(HA)只能強(qiáng)化真皮層中物質(zhì)的結(jié)合，并不能使肌膚具有彈性，所以 在植入后，必須盡量避免受外力擠壓及傷口產(chǎn)生，另一方面，肌肉移動會加速玻尿酸 (HA)的吸收，故患者必須避免過多臉部表情。
綜合上述天然及合成顏面填充材料中，以膠原蛋白的發(fā)炎反應(yīng)程度為最低，其可 應(yīng)用范圍也最廣，但膠原蛋白仍有下列缺點(diǎn)
1、 在體內(nèi)存留時(shí)間較短未交聯(lián)過的膠原蛋白在人體內(nèi)三個(gè)月便會被降解吸收， 而經(jīng)戊二醛(Ghitaraldehyde)等交聯(lián)劑交聯(lián)過的膠原蛋白可存留至六個(gè)月，但存留時(shí)間 仍然過短，必須常常補(bǔ)充施打，相當(dāng)不便。
2、 具有生物毒性經(jīng)過戊二醛交聯(lián)過的膠原蛋白，會有高濃度的戊二醛殘留，其 具有高度生物毒性、會危害人體健康。
由此可見，上述習(xí)用的膠原蛋白仍有諸多缺失，實(shí)非一良善的設(shè)計(jì)，而亟待加以 改良。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于習(xí)用膠原蛋白，其具有存留時(shí)間短及具有生物毒性等缺點(diǎn)；因此，發(fā)明人 依據(jù)多年來從事此方面的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，乃經(jīng)過長久努力研究與實(shí)驗(yàn)，并配合相關(guān)學(xué)理， 終于開發(fā)設(shè)計(jì)出本發(fā)明的一種長效型膠原蛋白及其制造方法。
本發(fā)明的一目的，在提供一種長效型膠原蛋白，是在一膠原蛋白中加入一Y-聚麩 胺酸(？polyglutarmicacid,，PGA)，再透過二次交聯(lián)，即可得到一交聯(lián)程度更均勻完全 及存留時(shí)間增長為2~3倍的長效型膠原蛋白，以解決習(xí)用膠原蛋白的存留時(shí)間過短、 必須常常補(bǔ)充施打的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一目的，在提供一低生物毒性的膠原蛋白，是利用一極低濃度的戊二 醛，透過二次交聯(lián)使該膠原蛋白與該戊二醛交聯(lián)均勻完全，即可得到一極低濃度的戊 二醛殘留、同時(shí)具有較佳的生物適應(yīng)性(biocompatibility)的膠原蛋白，以解決習(xí)用膠原 蛋白會有高濃度的戊二醛殘留，及該戊二醛具有生物毒性會危害人體健康的缺點(diǎn)。


6圖1為本發(fā)明的流程示意圖2為Y-聚麩胺酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖3為該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線圖4為A組、B組、C組樣本在相同濃度膠原蛋白降解酶下的降解速率測試結(jié) 果示意圖。
具體實(shí)施例方式
為便于貴審査委員能對本發(fā)明的技術(shù)手段及運(yùn)作過程有更進(jìn)一步的認(rèn)識與了解， 現(xiàn)舉一實(shí)施例配合圖式，詳細(xì)說明如下。
本發(fā)明是一種長效型膠原蛋白及其制造方法，其中先制備一膠原蛋白(Collagen)， 并在該膠原蛋白中加入一 Y-聚麩胺酸Cy-polyglutarmic acid, PGA)同時(shí)經(jīng)過下列一預(yù) 定制程，即可得到一長效型膠原蛋白，其中該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所 示，其結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵結(jié)(amidelinkage,CONH)，系由該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)的胺基(一 NH2)及側(cè)基(residue group)的羰基(-COOH)鍵結(jié)而成，稱為Y-鍵結(jié)，該鍵結(jié)較不易因 為受到人體體內(nèi)酵素的攻擊而快速降解，利用該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)對于人體體內(nèi)酵素 降解的高抵抗性，以大幅減緩膠原蛋白在人體內(nèi)的降解速率。
請參閱圖1所示，該長效型膠原蛋白的制造是依下列步驟進(jìn)行處理
步驟一、刮除多余組織首先，將一豬皮刮除多余肌肉及脂肪等組織，再將剩余 部分剪成小片段組織；
步驟二、去除油脂將該小片段組織浸泡于丙酮(acetone)中，以去除油脂，再以 二次水沖洗，直到完全去除油脂為止；
步驟三、膨潤將去除油脂的小片段組織，在一預(yù)定溫度下(該預(yù)定溫度為4'C)， 浸泡于一鹽水中(該鹽水濃度為10%)—預(yù)定時(shí)間(該預(yù)定時(shí)間為24小時(shí))后，再浸泡于 一特定酸堿值(該特定酸堿值為pH值4.5)的檸檬酸(citric acid)溶液中，并持續(xù)該預(yù)定 時(shí)間使該小片段組織膨潤；
步驟四、消化將經(jīng)過膨潤后的該小片段組織，在該預(yù)定溫度下浸泡于一第一溶 液中(該第一溶液為一濃度為0.5M的胃液素(pepsin)及一氫氯酸(hydrochloric acid)混 合的溶液)持續(xù)該預(yù)定時(shí)間，使該小片段組織消化成為一第二溶液；
步驟五、離心分離將該第二溶液在一第一預(yù)定條件下(該第一預(yù)定條件為5500g) 進(jìn)行離心，使其中被消化的該小片段組織與該第二溶液分離；步驟六、鹽析將前述分離后的該第二溶液加入一食鹽水溶液，制備為一第三溶 液(該第三溶液的濃度為0.8M)，同時(shí)加以劇烈搖晃直到析出一云狀物為止；
步驟七、收集下層沉淀物將搖晃后的該第三溶液在一第二預(yù)定條件(該第二預(yù)定 條件為22000g)下進(jìn)行離心，同時(shí)收集一下層沉淀物，再將該下層沉淀物置入二次水 中，同時(shí)加入一氫氧化鈉(NaOH)(該氫氧化鈉的濃度為0.1N)，調(diào)整酸堿值成為一第四 溶液(該第四溶液的pH值為7);
步驟八、冷凍干燥將該第四溶液于一另一預(yù)定溫度(該另一預(yù)定溫度為-20。C)下 冷凍該預(yù)定時(shí)間后，再進(jìn)行干燥，即可得一膠原蛋白(該膠原蛋白為一第一型膠原蛋 白(Type I collagen));
步驟九、與該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)混合將該膠原蛋白配置為一膠原蛋白溶液(該
膠原蛋白溶液的濃度為35mg/ml)，同時(shí)取一預(yù)定量(該預(yù)定量為4ml)的該膠原蛋白溶 液，與同樣預(yù)定量的Y-聚麩胺酸(Y-PGA)混合為一第五溶液；
步驟十、進(jìn)行第一次交聯(lián)在該第五溶液中以一泵浦(該泵浦為一蠕動泵浦)滴入 一另一預(yù)定量(該另一預(yù)定量為0.5ml)戊二醛溶液(該戊二醛溶液的濃度為0.05%)，同 時(shí)以一預(yù)定轉(zhuǎn)速(該預(yù)定轉(zhuǎn)速為250rpm)攪拌一另一預(yù)定時(shí)間(該另一預(yù)定時(shí)間為30分 鐘)，使該第五溶液中的膠原蛋白與戊二醛進(jìn)行第一次交聯(lián)；
步驟十一、進(jìn)行第二次交聯(lián)最后再重復(fù)步驟十，完成第二次交聯(lián)后，即可得該 長效型膠原蛋白。
以下則根據(jù)一 Bicinchoninic acid(簡稱BCA)檢測法步驟，加以證明本發(fā)明的該長
效型膠原蛋白確有其抗降解的效果
一、 首先，將一 A試劑及一B試劑以體積百分比50:1的比例均勻混合，制備出 一 BCA試劑；
二、 取一A組樣本、一 B組樣本及一C組樣本各25 Pl分別加入96孔滴定盤的 各槽中；
三、 于該各槽中分別加入200ul的該BCA試劑，于37。C下靜置30分鐘，使各 組樣本完全反應(yīng)；
四、 最后，利用一免疫酵素光譜分析儀分別測量各組樣本的吸收值，其測定波長 為650nm。
前述該A試劑的制備系利用將40mg的酒石酸鈉(Na2C4H406. 2H20)溶在10ml濃度為0.5M的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，待其完全溶解后，再加入lg碳酸鈉(Na2C03)， 持續(xù)攪拌，直到溶液呈透明澄清狀態(tài)。
前述該B試劑的制備系利用秤取0.2g的酒石酸鈉(Na2C4H406. 2H20)，溶于2ml 濃度為0.5M的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，待其完全溶解后，再加入去離子水使溶液體 積達(dá)到10ml，最后再加入0.3g硫酸銅(CuSO4)于該溶液內(nèi)，此時(shí)該溶液呈藍(lán)色澄清狀 態(tài)。
前述該A組樣本為一 4ml濃度為35mg/ml的膠原蛋白溶液。
前述該B組樣本系取4ml濃度為35mg/ml的膠原蛋白溶液，再以該泵浦在一分鐘 內(nèi)滴入0.5ml的該戊二醛溶液，同時(shí)以轉(zhuǎn)速250rpm攪拌三十分鐘均勻混合，進(jìn)行第一 次交聯(lián)，并在第一次交聯(lián)后，重復(fù)滴入0.5ml—戊二醛溶液，再以轉(zhuǎn)速250rpm攪拌三 十分鐘均勻混合后，進(jìn)行第二次交聯(lián)；其中該戊二醛溶液的制備，系取400!iL的戊 二醛溶于7.6ml的該磷酸緩沖鹽液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)中，即制備完成濃度 為0.5%的該戊二醛溶液。
前述該C組樣本即為依據(jù)本發(fā)明的制造方法所獲得的該長效型膠原蛋白，且為利 用該BCA檢測法的檢測，故需將該Y-聚麩胺酸(Y-PGA)溶于一磷酸緩沖鹽液 (Phosphate-Buffered Saline,PBS)中，以順利完成檢測。
此外，透過該BCA檢測法去檢測一膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，可得到將該膠原蛋白標(biāo) 準(zhǔn)溶液在波長為650nm處的一吸收值x，同時(shí)再將該吸收值x代入一曲線方程式y(tǒng) = 0.002x + 0.074，即可得到一y值，其中該曲線方程式中的y值系代表該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn) 溶液中的勝肽鏈(peptidebond)濃度，藉此即可得到如圖3所示的該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 曲線圖，透過該圖可得知該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長為650nm處的吸收值對應(yīng)其勝肽 鏈濃度的關(guān)系。
前述該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，系取2ml、濃度為35mg/ml的膠原蛋白，溶于5ml、 濃度為0.025N的醋酸溶液中，然后利用該磷酸緩沖鹽液(Phosphate-Buffered Saline,PBS) 溶液稀釋，即制備完成該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
請參閱圖4所示，為該A組、B組、C組樣本在相同濃度的膠原蛋白降解酶 (collagenase)下，經(jīng)該BCA檢測法的檢測結(jié)果，其結(jié)果中顯示在實(shí)驗(yàn)天數(shù)第11天時(shí)， 該A組樣本的溶液中勝肽鏈(peptide bond)濃度為2.052mg/ml，該B組樣本的溶液中勝 肽鏈濃度為1.77mg/ml，該C組樣本中溶液的勝肽鏈濃度為0.87mg/ml，經(jīng)由上述結(jié)果
9中可發(fā)現(xiàn)，在相同實(shí)驗(yàn)條件的下，該C組樣本的降解速率較該A組、該B組樣本的 降解速率緩慢許多，即表示該C組樣本較能抵抗人體體內(nèi)酵素的降解作用；該C組樣 本的降解速度約比該B組樣本的降解速度慢2倍，而以目前臨床測試結(jié)果得知，該B 組樣本可在人體體內(nèi)存留6 9個(gè)月，故可推算出該C組樣本在人體體內(nèi)中存留時(shí)間約 為12~18個(gè)月。
另一方面，由于該C組樣本中的該Y-聚麩胺酸(7-PGA)系以Y方式鍵結(jié)，而人體 體內(nèi)的胺鍵(aminebond)系以a方式鍵結(jié)，所以人體內(nèi)能降解Y方式鍵結(jié)的酵素在DNA 序列上系為一不活化(inactivated)狀態(tài)，而根據(jù)研究指出，活化此酵素需要6~7個(gè)月時(shí) 間，故當(dāng)一Y方式鍵結(jié)的多勝肽(polypeptide)進(jìn)入人體中，至少需6~7個(gè)月才能開始被 降解，代表一Y-聚麩胺酸(Y-PGA)與一膠原蛋白的共聚材料(如該C組樣本)，在人體中 至少需要比18~25個(gè)月才能被完全代謝降解。
下列系利用一細(xì)胞(該細(xì)胞為一3T3纖維母細(xì)胞)評估該A組、B組、C組樣本的 生物適應(yīng)性(biocompatibility):其系將該A組、B組、C組樣本分別與該細(xì)胞一起培 養(yǎng)3天，再分別透過下列項(xiàng)目數(shù)據(jù)，藉以得知細(xì)胞的活性、存活率、數(shù)量、衰老 (senescence)情形及基因毒性等各項(xiàng)信息
一、 粒線體酵素活性(Mitochondrial activity assay ，MTT):透過檢測分別與該A組、 B組、C組樣本一起培養(yǎng)的該等細(xì)胞中的粒線體酵素活性，以得知該等細(xì)胞的活性。
二、 乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase,LDH):透過檢測分別與該A組、B組、C 組樣本一起培養(yǎng)的該等細(xì)胞中的乳酸脫氫酶(LDH)，以檢測出該等細(xì)胞的存活率。
三、 總DNA含量透過檢測分別與該A組、B組、C組樣本一起培養(yǎng)的該等細(xì) 胞中的總DNA含量，以分析該等細(xì)胞的數(shù)量。
四、 半乳口甘酶(b-galactosidase):透過檢測分別與該A組、B組、C組樣本一起 培養(yǎng)的該等細(xì)胞中的半乳口甘酶(b-galactosidase)，以檢測該等細(xì)胞的衰老情形。
五、 染色體畸變(chromosome aberration):利用吉姆沙染色法(Giemsa stain)檢測分 別與該A組、B組、C組樣本一起培養(yǎng)的該等細(xì)胞的染色體畸變(chromosome aberration),以分別得知即該A組、B組、C組樣本對于該等細(xì)胞的基因毒性。
其檢測結(jié)果分別如下表所示，下表中的控制組即為前述的該膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液:
控制組A組樣本B組樣本c組樣本
粒線體酵素活性0.6430.6820.6110.692±0.
10(MTT)±0.154±0.124±0.173189
乳酸脫氫酶(LDH)0.487±0. 0940.503±0. 1630.476±0. 1200.511±0. 143
總DNA含量0.833±0. 1440.789±0. 1590.810±0. 2010.805±0. 176
半-乳□甘酶 (b-galactosidase )0.418±0. 0670.512±0. 1690.543±0. 1120.498±0. 128
染色體畸變 ( chromosome aberration)6.8%5.88%7.92%6.73%
由上表的結(jié)果可觀察到A組、B組、C組樣本與控制組在粒線體酵素活性(MTT)、 乳酸脫氫酶(LDH)、總DNA含量、半乳口甘酶(b-galactosidase)及染色體畸變 (chromosome aberration)等指標(biāo)，均沒有統(tǒng)計(jì)上的差異，藉此可證明A組、B組、C組 樣本沒有細(xì)胞毒性及引發(fā)染色體(chromosome)的變異，具有良好的生物適應(yīng)性。
由上述可證明，本發(fā)明的該長效型膠原蛋白有別習(xí)用的膠原蛋白關(guān)鍵在于
一、 本發(fā)明具有新穎性及進(jìn)步性，由于本發(fā)明是在膠原蛋白中加入該Y-聚麩胺酸 (Y-PGA)，并經(jīng)過兩次交聯(lián)，即可得到該長效型膠原蛋白，其可解決習(xí)用膠原蛋白的存 留時(shí)間過短、必須常常補(bǔ)充施打的缺點(diǎn)，故具有其新穎性及進(jìn)步性。
二、 本發(fā)明具有實(shí)用性，由于本發(fā)明系利用該低濃度的戊二醛，透過兩次交聯(lián)使 該膠原蛋白與該戊二醛交聯(lián)均勻完全，即可得到一極低濃度戊二醛殘留、同時(shí)具有較 佳的生物適應(yīng)性的該長效型膠原蛋白，故具有其實(shí)用性。
按，上述詳細(xì)說明為針對本發(fā)明的一種較佳的可行實(shí)施例說明而已，該實(shí)施例并 非用以限定本發(fā)明的申請專利范圉，舉凡其它未脫離本發(fā)明所揭示的技藝精神下所完 成的均等變化與修飾變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明所涵蓋的專利范圍中。
1權(quán)利要求
1、一種長效型膠原蛋白的制造方法，該方法包含下列步驟將一豬皮刮除多余肌肉及脂肪組織，再將剩余部分剪成小片段組織；將該小片段組織浸泡于一有機(jī)溶劑中，再以二次水沖洗直到完全去除油脂為止；將去除油脂的小片段組織，在一預(yù)定溫度下，浸泡于一鹽水中一預(yù)定時(shí)間后，再浸泡于一特定酸堿值的酸性溶液中持續(xù)該預(yù)定時(shí)間，使該小片段組織膨潤；將經(jīng)過膨潤后的該小片段組織，在該預(yù)定溫度下浸泡于一第一溶液中持續(xù)該預(yù)定時(shí)間，使該小片段組織消化成為一第二溶液；將該第二溶液在一第一預(yù)定條件下進(jìn)行離心，使其中被消化的該小片段組織與該第二溶液分離；將分離后的該第二溶液加入一食鹽水溶液，制備為一第三溶液，同時(shí)加以劇烈搖晃，直到析出一云狀物為止；將搖晃后的該第三溶液在一第二預(yù)定條件下進(jìn)行離心，同時(shí)收集一下層沉淀物，將該下層沉淀物置入二次水中，同時(shí)加入一氫氧化鈉，調(diào)整酸堿值成為一第四溶液；將該第四溶液于一另一預(yù)定溫度下冷凍該預(yù)定溫度，再進(jìn)行干燥即可得一膠原蛋白；將該膠原蛋白配置為一膠原蛋白溶液，同時(shí)取一預(yù)定量的該膠原蛋白溶液，與同樣預(yù)定量的γ-聚麩胺酸混合為一第五溶液；在該第五溶液中以一泵浦滴入一另一預(yù)定量戊二醛溶液，同時(shí)以一預(yù)定轉(zhuǎn)速攪拌一另一預(yù)定時(shí)間，使該第五溶液中的該膠原蛋白與戊二醛溶液中的戊二醛進(jìn)行第一次交聯(lián)；再次以該泵浦滴入該另一預(yù)定量戊二醛溶液，同時(shí)以一預(yù)定轉(zhuǎn)速攪拌該另一預(yù)定時(shí)間，進(jìn)行第二次交聯(lián)，即可得該長效型膠原蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該有機(jī)溶劑為丙酮。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該預(yù)定溫度為4'C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該酸性溶液為一檸檬 酸溶液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該第一溶液為一濃度為0.5M的胃液素及一氫氯酸的混合溶液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該另一預(yù)定溫度為 -20°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效型膠原蛋白的制造方法，其中該膠原蛋白為一第一 型膠原蛋白。
8、 一種長效型膠原蛋白，其系在一膠原蛋白添加一 Y-聚麩胺酸，并經(jīng)過一預(yù)定制 程以得到該長效型膠原蛋白。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的長效型膠原蛋白，其中該預(yù)定制程分別包含加入一戊二 醛溶液、進(jìn)行第一次交聯(lián)及進(jìn)行第二次交聯(lián)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長效型膠原蛋白及其制造方法，是將一豬皮經(jīng)過刮除多余組織、去除油脂、膨潤、消化、離心分離、鹽析、收集下層沉淀物、冷凍干燥后即可得一膠原蛋白，再將該膠原蛋白與γ-聚麩胺酸(γ-PGA)混合，同時(shí)加入一戊二醛溶液并攪拌均勻，進(jìn)行第一交聯(lián)，再重復(fù)加入該戊二醛溶液攪拌均勻，進(jìn)行第二次交聯(lián)后，即可得該長效型膠原蛋白，其可解決習(xí)用膠原蛋白的存留時(shí)間過短、必須常常補(bǔ)充施打，以及會殘留高濃度的戊二醛，具有生物毒性會危害人體健康等缺點(diǎn)。
文檔編號C07K1/14GK101648989SQ20081014708
公開日2010年2月17日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者盧香吟, 林峰輝, 林育德, 陳柏彰 申請人:雙美生物科技股份有限公司