專利名稱：膠原蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用級(jí)膠原蛋白及海綿，涉及一種高純度完整三螺旋結(jié)構(gòu)大分子活性 膠原蛋白。尤其是生化醫(yī)藥級(jí)高純度膠原蛋白的制備，尤其是涉及的用于從動(dòng)物結(jié)締 組織中取得可溶性醫(yī)用級(jí)膠原的工藝以及包含由該工藝所制得可溶性膠原醫(yī)用產(chǎn)品。 可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、生物材料制備及美容保健等行業(yè)。
二背景技術(shù)：
膠原蛋白是構(gòu)成各種細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角
色。它是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，約占人體蛋白質(zhì)的25 — 35%，相當(dāng)于人體重 量的6%，分布遍及全身各個(gè)組織器官，如骨骼、軟骨、韌帶、皮膚、角膜、各種內(nèi) 膜、筋膜等，尤其在人體的皮膚和結(jié)締組織中，含有大量的膠原蛋白。由于膠原蛋 白富含甘胺酸及一般較少存在于其它蛋白質(zhì)中的脯胺酸、羥脯胺酸等，所以衡量膠原 蛋白的純度高低，有時(shí)會(huì)以羥脯胺酸含量做為膠原蛋白的純度指標(biāo)。
膠原蛋白(Collagen)的來(lái)源由于膠原蛋白普遍存在于動(dòng)物、魚類、植物體內(nèi)， 其來(lái)源、結(jié)構(gòu)性、效能性及安全性，是選用膠原蛋白產(chǎn)品時(shí)必須加以考慮的地方。膠 原蛋白依其溶解性可分為(1)可溶性膠原蛋白；(2)不可溶性膠原蛋白。而可溶性 膠原蛋白又可分為酸性可溶、堿性可溶和中性鹽可溶膠原蛋白。此外，還有膠原蛋白 的變性產(chǎn)物明膠。如中國(guó)專利CN1040309食用明膠的生產(chǎn)方法，涉及一種從動(dòng)物骨和 皮中或者從骨膠和皮膠中制取食用明膠的生產(chǎn)方法。是在l 8'C—2 5°C， pH為 5. 5 — 6. 5條件下，用4 3%—6 5%的乙醇萃取明膠蛋白，經(jīng)濃縮后回收乙醇 的方法代替復(fù)雜的前處理過(guò)程，使生產(chǎn)周期縮短了6 5天時(shí)間，成品率提高l 5%以 上。膠原蛋白的制造工藝較為復(fù)雜，主要應(yīng)用在醫(yī)療和生物醫(yī)學(xué)材料方面，如人工皮 膚、止血?jiǎng)⑷斯ぱ?、以及護(hù)膚化妝品等，因此價(jià)位較高。而明膠不具備完整的三 螺旋結(jié)構(gòu)，制造較為簡(jiǎn)易，是一種由真皮或其它組織以酸、堿、熱或酵素水解后的產(chǎn) 物，分子量小，價(jià)位較低。對(duì)于其特殊立體結(jié)構(gòu)與效能之間的關(guān)系仍有許多有待厘清 的地方。明膠(果凍的成分之一)或市售某些水解性膠原蛋白幾乎與蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 (氨基酸)無(wú)異，其原有的生理活性已遭到破壞,不同的處理方式會(huì)影響膠原蛋白原 有的生理活性，但是如不進(jìn)一步依開(kāi)發(fā)的目的處理膠原蛋白分子，又會(huì)限制了它的應(yīng) 用范圍。所幸研究顯示，經(jīng)特殊處理后的膠原蛋白，仍可維持其原有的三螺旋結(jié)構(gòu)。 膠原蛋白海綿具有低免疫性、組織親和性強(qiáng)、止血性能好、生物降解性好、機(jī)械強(qiáng)度 好、組織修復(fù)功能強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床上使用的理想的止血修復(fù)生物材料，它可在體內(nèi) 自行降解吸收。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提出一種膠原蛋白制備方法、尤其是具備完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，保
持了完整的生物活性結(jié)構(gòu)的膠原蛋白。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是膠原蛋白的制備方法，步驟如下1)原料前處理 將新鮮牛腱去除脂肪、筋膜，并經(jīng)O.l ±0.05%的碳酸鈉(CP)溶液浸泡4土2hr，用蒸 餾水漂洗數(shù)次晾干；2)經(jīng)預(yù)處理的牛腱加入蛋白水解酶，其質(zhì)量配比為0.3土0.1 wt%; 并加入乙酸(CP)溶液(pH二2 3)適量，在l-12。C條件下緩慢攪拌3 5d (天)， 然后用高速冷凍離心機(jī)離心，取上清溶液，粗提得膠原蛋白溶液；3)膠原蛋白的提 純?cè)诖痔崮z原蛋白溶液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1±0.5 %的？1202溶液混勻靜置4 士2hr， 用檸檬酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到5土1，離心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化鈉 鹽析，緩慢攪拌，4±2 'C靜置過(guò)夜保存，鹽析沉淀是采用的氯化鈉示差沉淀的方法, 即運(yùn)用不同的氯化鈉的濃度對(duì)此蛋白液進(jìn)行處理，然后取出鹽析沉淀物用酸性溶液在 4±2 'C下浸泡24士8 h ，再將沉淀物裝入透析袋中，用乙酸溶液透析1士0.5 d ，再 用蒸餾水透析3土1 d ，每天換透析液2-3次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水 液。尤其是透析后進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮液上陰離子交換樹脂，在PH6.0，鹽濃度為 0.2mol/L進(jìn)行提純。經(jīng)Akta分析表明，產(chǎn)品純度可達(dá)到98. 5%以上。
本發(fā)明方法的產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)一般膠原蛋白、明膠產(chǎn)品放在一起做SDS—PAGE電泳試 驗(yàn)比較，可以看出本發(fā)明的產(chǎn)品具備完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，保持了完整的生物活性結(jié) 構(gòu)，而明膠和其它一般膠原蛋白是變性蛋白，不具備生物活性，分子量呈現(xiàn)不規(guī)則散 亂分布。而且，將本發(fā)明方法得到的產(chǎn)品做HPLC，也可看出，產(chǎn)品純度可達(dá)到98.5% 以上，這也是現(xiàn)有技術(shù)不能企及的。
本發(fā)明的有益效果是膠原蛋白海綿具有低免疫性、組織親和性強(qiáng)、止血性能好、 生物降解性好、機(jī)械強(qiáng)度好、組織修復(fù)功能強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床上使用的理想的止血修 復(fù)生物材料，它可在體內(nèi)自行降解吸收。決定膠原蛋白在臨床應(yīng)用中效果的最關(guān)鍵的
因素是膠原是否保持了三螺旋分子結(jié)構(gòu)的完整性。將我公司的產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)一般膠原
蛋白、明膠產(chǎn)品放在一起做SDS—PAGE電泳試驗(yàn)比較，可以看出我公司的產(chǎn)品具備 完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，保持了完整的生物活性結(jié)構(gòu)，而明膠和其它一般膠原蛋白是變性 蛋白，不具備生物活性，分子量呈現(xiàn)不規(guī)則散亂分布。決定膠原蛋白在臨床應(yīng)用中效
果的最關(guān)鍵的因素是膠原是否保持了完整的三螺旋分子結(jié)構(gòu)。通過(guò)本發(fā)明所提取的
膠原主要是可溶的膠原蛋白.且由于保持了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)使膠原蛋白的生理功能 得到了充分的體現(xiàn).
四

圖1是兩種酶法提取方法樣品的紫外吸收譜圖的對(duì)比
圖2是過(guò)濾壓力與膜孔的過(guò)濾曲線 圖3膠原蛋白的分析色譜圖
圖4本發(fā)明方法的樣品的紫外吸收光譜圖(吸收值一波長(zhǎng))
五具體實(shí)施例方式
主要是前處理一經(jīng)乙酸酸化處理一提取(氯化鈉示差沉淀)一純化(過(guò)濾、層析)
—濃縮(超濾、離子交換樹脂、Akta、冷凍干燥)一切割一雙層包裝一消毒(r線) —成品。
1) 前處理將新鮮牛腱去除脂肪、筋膜后,4 'C冷凍硬化后取出，再用手術(shù)刀刮 除牛腱表面的殘余筋膜，順著牛腱纖維方向切成適當(dāng)大小的薄片，稱重,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為O.l %的碳酸鈉(CP)溶液浸泡4 hr ,用蒸餾水漂洗數(shù)次，用不銹鋼絲網(wǎng)濾去水溶液, 晾干備用。
2) 膠原蛋白的提取將上述預(yù)處理的牛腱放入三角燒瓶中，分別加入含不同酶 質(zhì)量配比的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3 %乙酸(CP)溶液(pH = 2 3)適量，低溫下控溫緩慢攪 拌3 5d ，同時(shí)每隔一段時(shí)間用721型紫外分光光度計(jì)于540 nm處測(cè)量酶水解的 膠原蛋白吸光度，以吸光度作指標(biāo)來(lái)分析最佳的酶加入量。然后用高速冷凍離心機(jī)離 心，取上清溶液，即可得粗提膠原蛋白液。所述的酶是常用的蛋白酶(如胃蛋白酶、 木瓜或無(wú)花果蛋白酶等常用型號(hào)的酶)。
具體而言新鮮牛腱去除脂肪、筋膜后經(jīng)4 土2。C冷凍硬化后取出，再用手術(shù)刀 刮除牛腱表面的殘余筋膜，順著牛腱纖維方向切成適當(dāng)大小的薄片，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1 %的碳酸鈉(CP)溶液浸泡4 hr ，用蒸餾水漂洗數(shù)次,用不銹鋼絲網(wǎng)濾去水溶液, 晾干備用。
蛋白水解酶酶解時(shí)每隔一段時(shí)間用紫外分光光度計(jì)于540 nm處測(cè)量酶水解的膠 原蛋白吸光度，以吸光度作指標(biāo)來(lái)分析最佳的酶加入量；
3) 膠原蛋白的提純?cè)诖痔崮z原蛋白溶液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的11202溶液混勻 靜置4h ，用檸檬酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH值5-6.5 ，離心后，在剩余的溶液中加入一定 量的氯化鈉，緩慢攪拌，4 'C靜置過(guò)夜保存，在此我們采用了氯化鈉示差沉淀的方法, 即運(yùn)用不同的氯化鈉的濃度對(duì)此蛋白液進(jìn)行處理，(即在pH值4-6.的酸性條件下， NaCL的濃度為0.3mol/L。
然后取出鹽析沉淀物用酸性溶液在4 'C下浸泡24 h ,再將沉淀物裝入透析袋中， 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)不等的乙酸溶液各透析1 d ，再用蒸餾水透析3 d ，每天換透析液2-3次， 然后進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮液上陰離子交換樹脂，在PH6.0，鹽濃度為0.2mol/L進(jìn)行 提純。經(jīng)Akta分析表明，產(chǎn)品純度可達(dá)到98.5%以上。最后得到的是純度較高的膠原 蛋白水液。
濃縮時(shí)，用的是0.25-41Vp的分子量在5-10KD的膜。以壓差為驅(qū)動(dòng)力的膜分離技 術(shù)(屬于超濾和納濾的范疇)。選用不同孔徑的不對(duì)稱性微孔膜，按照截留分子量的 大小，可分離生物大分子物質(zhì)。溶質(zhì)或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質(zhì) 和溶劑一起透過(guò)膜，而較大的物質(zhì)則被截留。在操作過(guò)程中確保無(wú)相變化，不改變產(chǎn) 品的性能和活性；以求適應(yīng)膠原蛋白的分離要求。分離過(guò)程不添加任何化學(xué)藥劑，無(wú) 需加熱，這也符合膠原的特性。在實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)口的壓力在0.2MPA。切向流過(guò)濾 (tangential flow filtration, TFF)是防止?jié)獠顦O化造成速度下降的最有效方法。TFF是指 液體在泵的驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切的方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過(guò)
膜，而另一部分液體切向地流過(guò)膜表面，將被膜截留的粒子和大分子沖走，避免它們 在膜表面上堆積，造成膜堵塞和流速下降。在此，進(jìn)口的壓力、流速、流量等因素均 會(huì)對(duì)分離的效果產(chǎn)生顯著的影響。不同的流量在相同的時(shí)間間隔內(nèi)形成的最大濃度比 照?qǐng)D2。圖2中黑線1代表最大的膜過(guò)濾，藍(lán)線2代表最小的膜過(guò)濾，紅線3代表中 間的膜過(guò)濾。
進(jìn)行陰離子交換樹脂時(shí)，可選擇在不同的離子濃度，不同的PH范圍進(jìn)行?？刂?蛋白的進(jìn)料濃度在0.5g/L-5g/L。采用DEAE樹脂。分別以pH值為6. 0— 8. 0之間做 出若干(如三至五個(gè)點(diǎn))等分點(diǎn)，濃度為20 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制，取 氯化鈉的濃度在0.2mol/L——0.8mol/L。用平衡好的DEAE樹脂進(jìn)行梯度分離。測(cè) 定膠原蛋白的純度以及其回收率，生產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格按照GMP的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
權(quán)利要求
1、膠原蛋白的制備方法，其特征是步驟如下1)原料前處理將新鮮牛腱去除脂肪、筋膜，并經(jīng)0.1±0.05％的碳酸鈉(CP)溶液浸泡4±2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次晾干；2)經(jīng)預(yù)處理的牛腱加入蛋白水解酶，其質(zhì)量配比為0.3±0.1wt％；并加入乙酸(CP)溶液(pH＝2～3)適量，在1-12℃條件下緩慢攪拌3～5d；然后用高速冷凍離心機(jī)離心，取上清溶液，粗提得膠原蛋白溶液；3)膠原蛋白的提純?cè)诖痔崮z原蛋白溶液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1±0.5％的H2O2溶液混勻靜置4±2h，用檸檬酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到5±1，離心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化鈉鹽析，緩慢攪拌，4±2℃靜置過(guò)夜保存，然后取出鹽析沉淀物用酸性溶液在4±2℃下浸泡24±8h，再將沉淀物裝入透析袋中，用乙酸溶液透析1±0.5d，再用蒸餾水透析3±1d，每天換透析液2-3次，最后得到的是純度較高的膠原蛋白水液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是所述鹽析沉淀采用氯 化鈉示差沉淀的方法，即運(yùn)用不同的氯化鈉的濃度對(duì)此蛋白液進(jìn)行處理。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是乙酸溶液透析后進(jìn)行 超濾濃縮，將濃縮液上陰離子交換樹脂，在PH6.0，鹽濃度為0.2mol/L進(jìn)行提純。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是經(jīng)Akta分析表明，產(chǎn) 品純度可達(dá)到98. 5%以上，可溶的膠原蛋白是保持了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)使膠原蛋白。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是膠原蛋白的提取時(shí)酶 解時(shí)在低溫下控溫緩慢攪拌3 5 d，同時(shí)每隔一段時(shí)間用紫外分光光度計(jì)于540 nm 處測(cè)量酶水解的膠原蛋白吸光度，以吸光度作指標(biāo)來(lái)分析最佳的酶加入量。
全文摘要
膠原蛋白的制備方法，步驟如下1)原料前處理將新鮮牛腱去除脂肪、筋膜，并經(jīng)0.1±0.05％的碳酸鈉溶液浸泡4±2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次晾干；2)經(jīng)預(yù)處理的牛腱加入蛋白水解酶，其質(zhì)量配比為0.3±0.1wt％；并加入乙酸溶液，在1-12℃條件下緩慢攪拌3～5d；然后用高速冷凍離心機(jī)離心，取上清溶液，粗提得膠原蛋白溶液；3)膠原蛋白的提純?cè)诖痔崮z原蛋白溶液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1±0.5％的H₂O₂溶液混勻靜置4±2h，用檸檬酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到5±1，離心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化鈉鹽析，再將沉淀物裝入透析袋中，用乙酸溶液透析1±0.5d，再用蒸餾水透析3±1d，每天換透析液2-3次，得到膠原蛋白水液。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101363040SQ200810156070
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者任偉業(yè), 峰 李, 慶 楊 申請(qǐng)人:無(wú)錫貝迪生物工程有限公司