本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種中藥組合物聯(lián)合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用。

技術(shù)背景

研究發(fā)現(xiàn)，感染和炎癥發(fā)生時，患者體內(nèi)血漿內(nèi)毒素、血漿一氧化氮、血漿腫瘤壞死因子大量產(chǎn)生，水平高于正常值。腫瘤壞死因子(TNF-α)是活化單核-巨噬細胞產(chǎn)生的一種重要細胞因子，在感染性疾病和炎癥方面，能刺激血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子、刺激單核-巨噬細胞和其他細胞分泌趨化性細胞因子，引起白細胞在炎癥部位聚集，促進炎癥反應，過度反應的過量TNF-α，則產(chǎn)生劇烈免疫反應，呈現(xiàn)毒性作用，對機體造成損害。一氧化氮(nitricoxide，NO)由巨噬細胞分泌，能和超氧陰離子反應形成過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，它再分解為毒性更大的OH-和NO2，后者進入靶細胞或鄰近細胞，引起細胞毒作用或損傷組織。內(nèi)毒素(LPS):淋巴細胞作為機體重要的免疫細胞，其可能是通過Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)及核因子κB(NuclearFactorKappaB，NF-κB)途徑，合成并釋放包括TNF-α及IL-6在內(nèi)的多種促炎因子，加強炎癥反應，使得促炎/抑炎失衡，導致炎癥反應擴大化及免疫紊亂。在上述反應途徑中，TLR4為內(nèi)毒素有效成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的特異性配體，可以與LPS結(jié)合，啟動炎癥反應，而NF-κB作為TLR4反應鏈下游的主要因子，可以與多種促炎因子的基因啟動序列相結(jié)合，合成和釋放相應的炎癥因子。

目前未見中藥組合物與抗生素聯(lián)合應用于制備抑制炎癥因子的相關(guān)技術(shù)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是填補現(xiàn)有中藥組合物聯(lián)合阿奇霉素的應用技術(shù)不足，提供一種中藥組合物聯(lián)合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

提供中藥組合物聯(lián)合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用，所述炎癥因子包括血漿內(nèi)毒素、血漿一氧化氮和/或血漿腫瘤壞死因子；所述抗生素為阿奇霉素；所述中藥組合物的活性成分由千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤和黨參組成。

優(yōu)選地，所述中藥組合物聯(lián)合阿奇霉素可以很好地應用于制備治療慢性盆腔炎、子宮炎癥和/或卵巢炎癥的藥物方面。

優(yōu)選地，所述中藥組合物中，黨參、穿心蓮和單面針的摻入量各為藥材總重量的9％；金櫻根、雞血藤、功勞木和千斤拔的摻入量各為藥材總重量的16％。

優(yōu)選地，所述應用是將中藥組合物聯(lián)合阿奇霉素應用于制備靶向抑制血漿內(nèi)毒素、血漿一氧化氮和血漿腫瘤壞死因子藥物方面。

本發(fā)明的有益效果是：

阿奇霉素適用于敏感細菌所引起的感染，包括支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮膚和軟組織感染，急性中耳炎，鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。本發(fā)明將其與由千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤和黨參組成七味藥組成的中藥組合物聯(lián)合應用，在抑制炎癥因子方面具有良好的應用效果，并通過大量動物實驗證明中藥組合物和阿奇霉素發(fā)揮協(xié)同作用，實現(xiàn)靶向治療感染和炎癥，為中藥組合物和阿奇霉素的新領(lǐng)域聯(lián)合應用提供了有力技術(shù)支持。

附圖說明

圖1藥物聯(lián)合治療前后血漿內(nèi)毒素變化情況。

圖2藥物聯(lián)合治療前后血漿一氧化氮變化情況。

圖3藥物聯(lián)合治療前后血漿腫瘤壞死因子變化情況。

圖4檢測NO用的NaNO₂標準液的稀釋步驟示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明。下述實施例僅用于示例性說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。

實施例1

1.實驗菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，大腸埃希菌(ATCC25922)購買于中國國家菌種庫。受試菌株凍干粉用無菌M-H(B)培養(yǎng)基混懸后均勻鋪于無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜復活，18h后平板表面生長出菌苔，選取其中長勢良好的單一菌團，重新涂抹于M-H(A)斜面，相同條件下孵育18h，密封，4℃條件下冷藏保存；試驗前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育過夜，即可使用。所有操作均在超凈工作臺完成。

2.菌液制備方法

方法一：(高濃度菌液制備)

挑3～4個單菌落于40毫升的M-H(B)培養(yǎng)基中。受試菌隔夜增菌培養(yǎng)16小時(37℃，水浴搖床振搖16小時)，次日取出原菌液用全波長多功能讀數(shù)議測OD值(細菌生長飽和期)；取20mL，分裝于離心管中，每管2mL，離心10000-15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理鹽水混勻后，再離心15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液中的生理鹽水，收集細菌細胞菌體2mL。將相同方法培養(yǎng)的金色葡萄球菌和大腸埃希菌按1：1混合即獲得4mL混合菌液。將該菌液為100菌液濃度，用生理鹽水進行10倍稀釋，稀釋至0.1×100，0.01×100，備用(共3個劑量)。

方法二：(低濃度菌液制備)

挑單一菌落(包括金色葡萄球菌和大腸埃希菌)于2毫升的生理鹽水中，分別配制成為0.5麥氏濃度(約1×108CFU·mL^－1)細菌混懸液，將金色葡萄球菌和大腸埃希菌混懸液混合，即得到混合菌液4mL。將該菌液設(shè)置成為10A菌液濃度，用生理鹽水進行對倍稀釋，稀釋至0.5×10^A，0.25×10^A，備用(共3個劑量)。

3.藥品與試劑：M-H(A)培養(yǎng)基(OXOID公司，生產(chǎn)批號：CM0337A)；M-H(B)培養(yǎng)基(OXOID公司，生產(chǎn)批號：CM0405B)；烏拉坦溶液(20％)；生理鹽水(四川科倫藥液股份有限公司，生產(chǎn)批號：M12012004)；其他試劑和耗材均由成都雅榮生化設(shè)備經(jīng)營部購買提供。

4.儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司，BPH-9162)；優(yōu)普系列超純水機(成都超純科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加樣器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)，HZQ-C)；自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-40BI)；全波長多功能讀數(shù)議(美國Thermo)；菌落計數(shù)儀。

5.LPS(內(nèi)毒素)、NO(一氧化氮)的檢測方法

參照試劑盒使用說明書，進行相關(guān)檢測。

(1)LPS

1、加樣：分別設(shè)標準孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標準孔5孔，依次加入50μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)。空白孔加50μL(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加檢測溶液A工作液50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。

2、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。

3、每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。

4、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟2。

5、每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的后面3孔有明顯的梯度藍色，前3孔梯度不明顯時，即可終止)。

6、每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

7、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。

(4)NO檢測

1、NaNO₂標準液的稀釋：

取試管7支，依次標號1～7。用滴定管1號依次向2～7號試管加入雙蒸水1ml，用滴定管2號向1號試管加入NaNO₂標準液2ml，再用滴定管2號從1號試管吸出1ml液體加入2號試管，混勻，再吸出1ml液體加入3號試管，混勻。重復此步驟。當從6號試管吸出1ml液體時棄去。稀釋步驟見圖4。

2、用滴定管3號依次向1～7號試管加入1％磺胺0.5ml。

3、用滴定管4號依次向1～7號試管加入0.1％N-1-萘基乙二胺鹽酸0.5ml。

4、依次混勻1～7號試管內(nèi)液體，于常溫下孵育20分鐘。

5、用7號試管內(nèi)液體作為對照組，用分光光度計分別測定1～6號試管內(nèi)液體的吸光度值并記錄。

6、用滴定管滴加液體時應注意每一只滴定管只能用于每一種試劑，切忌混用。

6.模型制備

具體操作方法：大鼠稱重標記，腹部常規(guī)消毒，20％烏拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取預先制備的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去針頭尖，于陰道底部的子宮頸分叉處小心進入一側(cè)宮腔內(nèi)，針頭在宮腔內(nèi)來回抽拉2次以機械性損傷子宮內(nèi)膜組織，然后朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同樣操作步驟將0.1mL菌液注入另一側(cè)子宮，注射完畢后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分別于24h，48h觀察記錄各組大鼠感染情況，以大鼠無死亡，于造模后24h、72h、96h后分別陰道刮片，進行菌落培養(yǎng)，選擇菌落計數(shù)≥30，≤100的感染菌量作為最佳感染菌量。將該菌量作為體內(nèi)感染的菌量。受試大鼠感染菌量為：

表1

所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規(guī)消毒腹部，用無菌棉簽伸入宮口，來回抽拉2次后，將棉簽放入含2mL生理鹽水的試管中，獲得含測試品混懸液，取出棉簽，再用新的無菌棉簽充分蘸取混合液均勻涂抹于無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜，18h后進行菌落計數(shù)。240h犧牲動物，觀察子宮感染情況。各組典型鼠感染菌落計數(shù)，結(jié)果如下表2：

表2受試大鼠感染菌量

所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規(guī)消毒腹部，用無菌落計數(shù)結(jié)果顯示，3組鼠所感染菌量符合實驗要求。同時，解剖后可見子宮等直觀可見炎性充血與炎性水腫。

7.試驗過程

模型及分組150只大鼠(雌性SPF級SD大鼠，220g±20g，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2008-24)。16只用于空白，另行飼養(yǎng)。其余均采用造模方法麻醉后注射混合菌液。觀察5日，每日均隨機抽取6只及空白組2只麻醉后采集陰道分泌物用于細菌涂片。5日后存活大鼠隨機分為3組，即model、AZM、AZMDG(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇霉素組、阿奇霉素中藥組合物合并組)。

Model：不予治療的模型組。

AZM：阿奇霉素治療模型組。

AZMDG：阿奇霉素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法制得組合物聯(lián)合治療模型組。

1.受試劑量

(1)AZM劑量：本實施例對阿奇霉素(AZM)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用后作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合并用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發(fā)現(xiàn)原設(shè)定劑量過高，最終采用10mg/kg.d。

(2)受試藥物劑量：

根據(jù)研究結(jié)果，原設(shè)定中藥組合物的劑量為2.058g/kg.d，但預試發(fā)現(xiàn)，此劑量采用最大給容積配制的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。調(diào)整本發(fā)明中藥組合物AMZDG為1.41g/kg.d。

2.給藥時間

除空白和模型外，造模后第六日開始給予相應藥物。AZM與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的AZM，兩個小時后開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。

3.樣本收集

第1日給予AZM兩小時后，經(jīng)尾靜脈采集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次采血，于給予阿奇前和給予中藥前各經(jīng)尾靜脈采集一次，每次采集血量約0.3mL，取樣時間誤差約30min。于給藥第2、4、6、8日給予AZM兩小時后，各組麻醉后犧牲約2～4只大鼠，采集下腔動脈抗凝全血。

4.送樣測試

所有時間點0.3mL及末次全血，取約0.2mL血漿用于末次抗凝全血送檢血細胞計數(shù)、血流變。末次血漿用于檢測LPS、TNF-α、NO。

實驗結(jié)果見圖1至圖3所示。結(jié)果顯示，實驗動物造模后，3種炎癥因子水平與正常組比較均明顯升高，給予不同的藥物組合治療后，各系數(shù)都降低，趨向于回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，血漿內(nèi)毒素：AZMDG>AZM；血漿一氧化氮：AZMDG>AZM。

以上結(jié)果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠血漿內(nèi)毒素、血漿一氧化氮由于感染和炎癥的發(fā)生，導致這兩種炎癥因子大量產(chǎn)生，使其水平高于正常值；在給予藥物治療后，炎癥因子水平均趨于恢復正常水平，藥物之間的作于強度為：AZMDG>>AZM。

實施例2試驗研究

1.研究對象：選擇門診自愿2014年6月至2015年2月，因月經(jīng)失調(diào)、陰道不規(guī)則出血、下腹墜痛或白帶增多，經(jīng)過診斷為盆腔炎患者30例，年齡35～52歲。

2.所有患者在治療前均常規(guī)檢查血常規(guī)、肝和腎功能，取末次血漿用于檢測LPS、NO。LPS、NO明顯升高患者給予本發(fā)明中藥組合物(以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法制得組合物，湯劑或片劑)和阿奇霉素(參照阿奇霉素規(guī)定劑量)，阿奇霉素與本發(fā)明中藥組合物分開服用，相差時間約2小時。連續(xù)服藥2周。治療期間每周復診1次，復查血常規(guī)、LPS、NO指標、肝和腎功能，了解用藥后不良反應及月經(jīng)情況。無失訪病例。

3.臨床癥狀：有陰道出血者均在用藥后3～5天內(nèi)血止，下腹墜痛或白帶增多情況消失或減輕，檢測LPS、NO回復正常水平。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，30例中，顯效10例，占33.3％；有效16例，53.4％；無效4例，占13.3％；總有效率為86.7％。