專利名稱：一種石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-1β基因、編碼的蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及石斑魚基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β 基因、編碼的蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促炎癥因子白細(xì)胞介素αυ- β，是啟動和調(diào)控免疫反應(yīng)必需的信號分子，對多 種免疫細(xì)胞的分化、生長和活化增殖有重要的調(diào)節(jié)作用。白細(xì)胞介素- β氨基酸序列的特 征是含有兩個必備的保守結(jié)構(gòu)，包括成熟肽所形成的一個三葉草型功能結(jié)構(gòu)域，是IL-I 蛋白與其特異受體結(jié)合并引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號通路的關(guān)鍵位點(diǎn)；其蛋白羧基端含有IL-I家族 保守的標(biāo)識序列。IL-I具有廣泛的生物學(xué)活性。目前已知IL-I不僅對多種免疫細(xì)胞有重要的調(diào)節(jié) 作用，如可以影響胸腺細(xì)胞的增殖，B細(xì)胞的生長和分化以及IL-2、IL-6的生成；而且它也 參與造血、骨代謝、壓力反應(yīng)、睡眠調(diào)節(jié)、攝食、神經(jīng)內(nèi)分泌及抗腫瘤等多種生理過程，并與 發(fā)熱、炎癥以及某些疾病如中風(fēng)、阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥，以及自身免疫性疾病有關(guān)。IL-I可以促進(jìn)胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞的活化、增殖和分化。T細(xì)胞經(jīng)抗原等刺激后表達(dá) IL-I受體，在IL-I作用下活化分泌IL-2、干擾素、(IFNy)等細(xì)胞因子，并表達(dá)IL-2高親 和力受體進(jìn)而令T細(xì)胞發(fā)生增殖和分化。IL-I還可以增加T細(xì)胞表面MHC II類抗原的表 達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的分化。IL-I還能協(xié)同IL-4等細(xì)胞因子刺激B細(xì)胞的 增殖和分化，促進(jìn)免疫球蛋白的合成和分泌。IL-I還作用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)單 核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)，并通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-8介導(dǎo) 對中性粒細(xì)胞的趨化作用，刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥蛋白和介質(zhì)，直接參與炎癥發(fā)生過程， 抑制粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)粒細(xì)胞黏附和遷移。與哺乳動物相似，魚類IL-I β重組蛋白能夠影響刺激免疫細(xì)胞的增殖，增加 IL-I β自身的基因表達(dá)，以及誘導(dǎo)下游免疫基因，如環(huán)氧化物酶-2 (C0X-2)，MHC II基因的 表達(dá)，并能夠作為魚類免疫調(diào)節(jié)劑，加速體內(nèi)特異抗體的生成。重組的IL-Ιβ蛋白并可影 響魚類的神經(jīng)內(nèi)分泌。初步研究的結(jié)果表明，灌流高劑量的重組鯉魚IL-I β會引致其垂 體釋放α-促黑激素和β-內(nèi)啡肽。Holland等以不同劑量的重組IL-I β蛋白和脂多糖 (LPS)分別注射虹鱒，能明顯檢測到血漿中的皮質(zhì)醇以劑量或時間效應(yīng)顯著提高。由于促腎 上腺皮質(zhì)激素(ACTH)可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌相應(yīng)的皮質(zhì)激素，主要以皮質(zhì)醇的形式，因此 利用ACTH的抑制劑——地塞米松可阻斷重組IL-I β或LPS、介導(dǎo)的血漿中皮質(zhì)醇的升高， 這說明IL-I β和LPS調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇分泌是通過下丘腦-垂體軸來實(shí)現(xiàn)的。斜帶石斑魚(orange-spotted grouper, Epinephelus coioides)屬倉盧形 目(Perciformes)、魚旨禾斗(Serranidae)，石斑魚亞禾斗(Epinephelinae)，石斑魚屬 (Epinephelus)。主要分布于沿海近礁水域，是我國華南沿海一帶以及東南亞地區(qū)重要的海 水養(yǎng)殖魚類，肉質(zhì)鮮嫩，味美，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價值高。近年來，石斑魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但普遍采用高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖，因此人工飼養(yǎng)魚群的疾病易感機(jī)率大。目前在石斑魚人工養(yǎng)殖中 還沒有一種能有效促進(jìn)疫苗產(chǎn)生的免疫佐劑和有效增強(qiáng)魚類免疫的飼料添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種石斑魚白細(xì)胞介素 EcIL-I β 基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述基因編碼的蛋白。本發(fā)明再一目的在于提供上述基因編碼的蛋白的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述基因編碼的蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因，其序列如SEQ ID NO :1所示，該基因是通 過同源克隆的方法從斜帶石斑魚脾臟中分離得到的。上述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列SEQ IDNO 3 所示，共邪4個氨基酸，等電點(diǎn)為5. 10，分子量為28. 66千道爾頓，含有一個潛在的N-糖基 化位點(diǎn)Asn8和一個位于羧基端的IL-I家族表示序列(L) -M- (SV) -AH- (P) -NW- (YIST) -AEA DNMP-(V)(中括號表示保守氨基酸)。本發(fā)明石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因所編碼的蛋白可以通過表達(dá)載體在大腸 桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)。具體制備方法包括如下步驟(1)將權(quán)利要求1所述的石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Ιβ基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載 體pET22b上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；(2)將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；(3)對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)；(4)經(jīng)純化，得到石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白。其中，步驟(1)中，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟根據(jù)石斑魚白細(xì)胞介 素EcIL-I β基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含如SEQ ID NO :4所示，含Nde I酶切 位點(diǎn)，下游引物如SEQ ID NO :5所示，含Not I酶切位點(diǎn)；以含石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β 基因全長的PGEM-T fesy載體質(zhì)粒為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克 隆到原核融合表達(dá)載體pET22b上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒含有6XHis親和標(biāo)記位 點(diǎn)。該表達(dá)質(zhì)粒是以T7為啟動子，獲得的蛋白的C端有6XHis結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬 配體親和層析進(jìn)行純化。步驟C3)中，所述培養(yǎng)是將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌單菌落接種至含氨芐青霉素LB加富液 體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；再按1 50體積比接種到37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素LB加富液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6 ；加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L,經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。作為一種優(yōu)選方案，所述用含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的條件是 30°C,250rpmo步驟(4)中，所述純化的方法是將總菌體用PB緩沖液洗滌，再用結(jié)合緩沖液重懸， 超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋 白。作為一種優(yōu)選方案，所述PB緩沖液的濃度為50mmol/L，pH = 6. 8，所述結(jié)合緩沖液是 pH = 7. 4 的，含 20mmol/L PB、500mmol/L NaCl 和 10mmol/L 咪唑的混合溶液。通過對培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)時間和溫度等條件的摸索和優(yōu)化，使得到的融合蛋白的表 達(dá)量較高，大部分處于可溶狀態(tài)；還優(yōu)化了重組蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng) 固定化金屬配體親和層析，得到的蛋白純度在90%以上。本發(fā)明蛋白可用于制備魚類餌料的免疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類疫苗免疫佐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明通過近源物種IL-I β基因⑶S序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了簡并引物，通過PCR擴(kuò)增 得到EcIL-I β基因，并構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中培養(yǎng)，可大量表達(dá)石斑魚白細(xì)胞 介素EcIL-Ιβ基因所編碼的蛋白。本發(fā)明石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因所編碼的蛋白 能有效促進(jìn)疫苗產(chǎn)生的免疫佐劑，還可作為增強(qiáng)魚類免疫的餌料添加劑。


圖1是本發(fā)明石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Ιβ基因編碼的蛋白與部分脊椎動物 IL-I β蛋白序列分不同外顯子的比較結(jié)果，其中，在比較中采用空格以獲得最大的同源性 序列，“——”表示此位置無此氨基酸；圖2是石斑魚脾臟總RNA電泳結(jié)果；圖3中A是EcIL-I β中間片段電泳結(jié)果，其中，1為Ikb DNA Marker，2為EcIL-I β 中間片段；B是EcIL-I β 5' RACE電泳結(jié)果，其中，3為EcIL-I β 5' RACE片段，4為IOObp plus DNA Marker ;C 是 EcIL-I β 3' RACE 電泳結(jié)果，其中，5 為 IOObp DNA Marker，6 為 EcIL-I β 3' RACE 片段；圖4是RT-PCR分析斜帶石斑魚IL-1 β基因在LPS或Poly I :C不同孵育刺激時 間下外周白細(xì)胞中的表達(dá)，其中，“_”為無處理細(xì)胞；LPS為脂多糖；PolyI C為雙鏈RNA類 似物；圖5是基因EcIL-I β的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖6石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE(A)及 Western雜交(B)分析，其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)總菌蛋白；2為誘導(dǎo)后總 菌蛋白；3為經(jīng)純化脫鹽后的蛋白樣品；圖7石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白表達(dá)和LPS對頭腎細(xì)胞增殖程 度的影響，Y軸為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在刺激條件下還原Alamar Blue 染料程度，反映重組蛋白和LPS 的活化能力，數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(η = 3)*ρ< 0. 05 ；圖8石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白對外周血白細(xì)胞(A)和頭腎細(xì) 胞(B) 基因表達(dá)的影響。引入看家基因EF-I α作為內(nèi)部參照。右邊指 出的為PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1石斑魚脾臟總RNA的提取取健康斜帶石斑魚(Epin印helus coioides)，2齡，體重約750g，以MS-222(tricaine methanesulphonate)麻醉約lmin，經(jīng)尾靜脈取血后立即分離出脾臟。采 用1Trizol試劑法提取獲得石斑魚脾臟總RNA，其0D26(1/28(1 = 1.85,電泳結(jié)果顯示，28S rRNA， 18S rRNA條帶清晰，28S條帶亮度為18S的兩倍(圖2)，表明所得總RNA未被蛋白質(zhì)、酚和 基因組DNA污染，純度高。實(shí)施例2 cDNA第一鏈的合成取5 μ g斜帶石斑魚脾臟總RNA樣品進(jìn)行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與 RNA Oligo dT(序列如SEQ ID NO :6所示)混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所的產(chǎn)物置于_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3引物設(shè)計(jì)從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載獲得近源物種，如舌齒鱸(AJ26947》，虹鱒(AJ223954和 AJM5925)，金頭鯛(AJ277166)，金魚(AJ249136)和鯉魚(AB010701)等 IL-I β 同源基因 CDS序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)所確定保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并 引物，擴(kuò)增片段大小約為407bp。引物序列如SEQ ID NO :7 8所示。實(shí)施例4斜帶石斑魚IL-I β基因cDNA全序列的克隆以實(shí)施例2合成的第一鏈cDNA作為模板，以簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn) 物上樣至1. 8wt%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。 將純化后的目的產(chǎn)物連接至pGEM-Τι fesy載體，轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。 Blast同源分析表明，目的產(chǎn)物為EcIL-I β基因的中間片段。根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的 3‘-和 5'-末端進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 按照RACE試劑盒GeneRacer Kit說明書對斜帶石斑魚脾臟總RNA進(jìn)行去磷酸，去 mRNA 5'帽子結(jié)構(gòu)，與RNA Oligo連接，最終通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。用斜帶石斑魚 IL-I^cDNA 的 3'-和 5' -RACE 特異引物(IL1F2，IL1F3 和 IL1R2，IL1R3)和 GeneRacer Kit的通用引物，以GeneRacer Kit反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為第一輪PCR模板，以稀釋 的第一輪PCR產(chǎn)物為第二輪PCR模板，擴(kuò)增IL-I β cDNA 3'端和5'端片段，對所得到的 PCR產(chǎn)物的回收純化、連接T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、陽性克隆鑒定及DNA測序。測序所得序列 再與簡并引物擴(kuò)增所得的序列利用Clustal X軟件進(jìn)行拼接。特異引物序列如SEQ ID NO :9 12所示。實(shí)施例5石斑魚EcIL-I β基因在分裂原活化的外周血白細(xì)胞中的表達(dá)使用不同分裂原刺激石斑魚外周血白細(xì)胞，檢測該基因在離體受到外界刺激時， 是否直接參與應(yīng)激反應(yīng)。從斜帶石斑魚尾靜脈取血，并以肝素抗凝，使用Ficoll分離液分離石斑魚白細(xì) 胞。將所得石斑魚白細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)調(diào)整至合適水平，加入含分裂素Poly I:C和LPS的完全 培養(yǎng)基(RPMI 1640 含 2mM L-glutamine, 10% FBS 和 lwt% penicillin/str印tomycin)至 終濃度分別為50 μ g/ml和10 μ g/ml，另以不含刺激劑的完全培養(yǎng)基作為陰性對照組；將細(xì) 胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育池后收集各孔細(xì)胞，提取總RNA并進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄。EF-Ia作為內(nèi)參基因來調(diào)節(jié)各樣品模板cDNA量，使用EF-I α和IL_1 β特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物上樣于1. 8wt %的瓊脂糖電泳凝膠，進(jìn)行低電壓電泳并拍照。 利用BioRAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)的核酸定量分析軟件Quantity One測定各樣品 中IL-I β及EF-I α PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值，數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(means士S. Ε. M)，取3個獨(dú)立樣品的數(shù)據(jù)平均值(n =幻。所用的引物序列如SEQ ID NO :13 16所7J\ ο從圖4所示的結(jié)果可以看出Poly I C和LPS刺激后，基因在外周血白細(xì)胞中的表 達(dá)量明顯增加。實(shí)施例6重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)EcIL-I β基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含有Nde I切割位點(diǎn)，下 游引物含有》ιοΙ切割位點(diǎn)。所用的引物序列如SEQ ID NO :4 5所示。以含有EcIL-Ιβ基因的pGEM-T fesy質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小在552bp左右。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pET22b上， 得到重組表達(dá)載體(其構(gòu)建過程如圖5所示)。表達(dá)載體中的外源基因序列經(jīng)測序鑒定正 確。實(shí)施例7石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白的表達(dá)將所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨褰?jīng)SDS-PAGE 電泳分析表明，工程菌在受IPTG誘導(dǎo)后與無IPTG誘導(dǎo)的總菌蛋白相比在約22. 5kDa的地 方出現(xiàn)一條蛋白條帶，與軟件估算的EcIL-I β重組蛋白分子量大小相近(圖6)。對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的優(yōu)化得出基因工程菌的最佳培養(yǎng)條件為 接單菌落至5ml的含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜; 按1 50體積比接種到200ml 37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基中，37°C， 250rpm,培養(yǎng)至0D600達(dá)到0. 6 ；在30°C，加入IPTG至終濃度0. 5mM,對EcIL-I β蛋白表達(dá) 工程菌誘導(dǎo)4h，可獲得最大的可溶性重組蛋白表達(dá)量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在此條 件下蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的42 %以上。實(shí)施例8重組石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白的純化將總菌體用50mM PB (PH6. 8)洗滌，再用結(jié)合緩沖液(20mM PB, 500mMNaCl, IOmM咪 唑，pH 7.4)重懸，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)固定化鎳金屬配體親和層析純化，SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)和層析的結(jié)果。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出6XHis-石斑魚白細(xì)胞 介素EcIL-I β基因編碼的蛋白能被固定化鎳金屬親和層析柱所吸附，用洗脫緩沖液OOmM PB,500mM NaCl，150mM咪唑，pH 6.0)洗鎳層析柱時，能把目的蛋白洗下(圖6)。重組蛋白 的洗脫峰經(jīng)過G25凝膠柱更換緩沖液，去除所含咪唑。實(shí)施例9重組石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因編碼的蛋白刺激石斑魚頭腎細(xì)胞 增殖活性分析對實(shí)驗(yàn)魚實(shí)施尾靜脈取血后，隨即切斷其頸椎骨致死，剪取頭腎組織，用烘好的磨 砂玻片磨砂面進(jìn)行研磨，磨至末狀；將磨好的細(xì)胞與培養(yǎng)基一起過細(xì)胞濾網(wǎng)(BD Falcon, 70 μ m,Nylon)轉(zhuǎn)移至50ml離心管中；洗滌、離心后使用實(shí)施例5中的完全培養(yǎng)基2ml重懸 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1 X 105/ml，分別向96孔培養(yǎng)板各孔中加入100 μ 1上述細(xì)胞 懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為lng/ml，10ng/ml和lOOng/ml重組蛋白或10 μ g/ ml LPS的完全培養(yǎng)基100 μ 1，并設(shè)置背景組(只加200 μ 1完全培養(yǎng)基)，陰性對照組(細(xì)胞懸浮液和完全培養(yǎng)基100 μ 1)以及染料空白校正組(只加200 μ 1完全培養(yǎng)基，用于染 料讀數(shù)校正)，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個獨(dú)立樣本；將細(xì)胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24h后，分別向每孔加入20 μ 1 Alamar Blue 后，繼續(xù)培養(yǎng)7h ；分別讀取每孔0D630和 0D570讀數(shù)，并按照染料說明書計(jì)算各組細(xì)胞中染料還原程度，數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn) 誤差(η = ； )。圖7顯示不同濃度的斜帶石斑魚EcIL-I β重組蛋白均能提高Alamar blue 的還原程度，并存在一定的劑量依存關(guān)系。杜凱法分析顯示，10ng/ml和lOOng/ml的重組蛋 白以及10 μ g/ml LPS處理的頭腎細(xì)胞還原度顯著高于對照組。實(shí)施例10重組蛋白對免疫相關(guān)基因表達(dá)影響的活性分析外周血白細(xì)胞分離如實(shí)施例5，頭腎細(xì)胞分離如實(shí)施例9。將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至至 lX107ml，分別向6孔培養(yǎng)板各孔中加入2ml上述細(xì)胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終 濃度為lng/ml，10ng/ml和lOOng/ml重組蛋白或10 μ g/ml LPS的完全培養(yǎng)基^il，并設(shè)置 陰性對照組(細(xì)胞懸浮液和完全培養(yǎng)基各anl)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于27°0，5%0)2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，孵育4h后收集各孔細(xì)胞，RT-PCR檢測重組蛋白對C0X-2和IL-I β基因表達(dá)的影響。 結(jié)果表明，無論在外周血白細(xì)胞還是頭腎細(xì)胞中，lOng/ml重組蛋白都能比10 μ g/ml LPS 更強(qiáng)力的誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)。結(jié)果如圖8所示。
權(quán)利要求
1.一種石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因，其序列如SEQ ID Ν0:1所示。
2.權(quán)利要求1所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，等電點(diǎn)為5. 10，分子量為28. 66千道爾頓。
3.權(quán)利要求2所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其特征在 于包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1所述的石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體 pET22b上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；(2)將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)；(3)對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)；(4)經(jīng)純化，得到石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Ιβ基因編碼的蛋白的制備方法， 其特征在于步驟(1)中，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟根據(jù)石斑魚白細(xì)胞介素 EcIL-I β基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含如SEQ IDNO 4所示，下游引物如SEQ ID NO :5所示；以含石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-I β基因全長的pGEM-T fesy載體質(zhì)粒為模板， 利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pET22b上，得到重 組表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有6 XHis親和標(biāo)記位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其特 征在于所述上游引物含Nde I酶切位點(diǎn)，所述下游引物含Not I酶切位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其特 征在于步驟C3)中，所述培養(yǎng)是將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌單菌落接種至含氨芐青霉素LB加富液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；再按1 50體積比接種到37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6 ；加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L,經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其特 征在于所述用含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的條件是30°C，250rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其特 征在于步驟(4)中所述純化的方法是將總菌體用PB緩沖液洗滌，再用結(jié)合緩沖液重懸，超 聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白的制備方法，其 特征在于所述PB緩沖液的濃度為50mmol/L，pH = 6. 8，所述結(jié)合緩沖液是pH = 7. 4的，含 20mmol/L PB、500mmol/L NaCl 和 10mmol/L 咪唑的混合溶液。
10.權(quán)利要求2所述石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-Iβ基因編碼的蛋白在制備魚類餌料的免 疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類疫苗免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石斑魚白細(xì)胞介素EcIL-1β基因、編碼的蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明石斑魚EcIL-1β基因的序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO3所示。本發(fā)明通過同源克隆的方法，從斜帶石斑魚中分離得到EcIL-1β基因，并通過將該基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中，經(jīng)過大腸桿菌以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，經(jīng)分離純化后，得到的蛋白可以作為魚類餌料的免疫調(diào)節(jié)添加劑，還可用于研發(fā)魚類疫苗免疫佐劑。
文檔編號A23K1/16GK102041260SQ20101012592
公開日2011年5月4日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者馮麗娜, 冷婷婷, 盧丹琪, 姚謐, 張旭, 林浩然, 貝錦新 申請人:中山大學(xué)