專(zhuān)利名稱(chēng)：白細(xì)胞介素－10抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及白細(xì)胞介素-10(IL-10)特異性抗體和其用途。更具體地，本發(fā)明涉及人源化的抗體，其識(shí)別人類(lèi)IL-10并調(diào)整其活性，特別是在自體免疫失調(diào)中。
背景技術(shù)：
最初被稱(chēng)為細(xì)胞因子合成抑制因子或CSIF的白細(xì)胞介素-10(IL-10)是造血細(xì)胞、特別是免疫細(xì)胞的有效的免疫調(diào)節(jié)物。一些細(xì)胞，例如活化的Th2細(xì)胞、B細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。參見(jiàn)，例如，Moore等，Anne.Rev.Immunol.11165(1993)。IL-10抑制許多細(xì)胞，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和效應(yīng)物功能。特別地，IL-10抑制細(xì)胞，例如Th1細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子合成，包括IL-1、IFN-γ和TNF的合成。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)iorentino等，J.Exp.Med.，1702081-2095(1989)；Fiorentino等，J.Immunol.1463444(1991)；Hsu等，Int.Immunol.4563(1992)；Hsu等，Int.Immunol.4563(1992)；D′Andrea等，J.Exp.Med.1781041(1993)；de Waal Malefyt等，J.Exp.Med.174915(1991)；Fiorentino等，J.Immunol.1473815(1991)。多種病原體，特別是細(xì)胞內(nèi)病原體，引起IL-10產(chǎn)生來(lái)減慢或完全地停止由免疫反應(yīng)有效地去除病原體。Moore等，Annu.Rev.Immunol.11165(1993)。例如，在來(lái)自患有HIV、麻瘋病或肺結(jié)核的患者的血液淋巴細(xì)胞中，當(dāng)用病原體攻擊時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞在體外一般是無(wú)變應(yīng)性的或非響應(yīng)性的。然而，在這些當(dāng)中IL-10的中和作用表明活性的效應(yīng)物應(yīng)答，即，Th1反應(yīng)性存在于這些細(xì)胞中。因而，相信IL-10被病原體有效地利用來(lái)促進(jìn)其傳染性狀態(tài)。IL-10還與體內(nèi)自身免疫相關(guān)。自身免疫由靶向正常組織的自身抗體、自身反應(yīng)性T細(xì)胞或它們的某些組合的發(fā)展引起。自身免疫性疾病的一個(gè)實(shí)例是全身性紅斑狼瘡(SLE)，一種慢性風(fēng)濕性疾病，在其中全身的結(jié)締組織都成為炎性的。自身抗體攻擊正常的身體組織，好象正常的身體組織是外部侵入的，引起特征性的炎癥。雖然還不完全了解準(zhǔn)確的原因，研究人員相信它兼?zhèn)溥z傳性和環(huán)境性的因素。特別地，B細(xì)胞超活動(dòng)性和各種自身抗體的存在是SLE的特征。一般地，與雙鏈DNA反應(yīng)的IgG自身抗體(IgG抗dsDNA abs)在SLE患者中升高了。60到70％之間的SLE患者產(chǎn)生IgG抗dsDNA abs，其中一些是有腎臟毒性的。SLE在女性中比在男性中高發(fā)十倍，具有的癥狀從面部的皮疹到致殘性和潛在危急生命的器官功能障礙。它可以在任何年齡發(fā)作，但最常見(jiàn)的是在年輕成年人中。大量的研究證明了IL-10在與SLE相關(guān)的病理過(guò)程中的作用。例如，盡管IL-10一般不由未受適當(dāng)刺激的細(xì)胞產(chǎn)生，但是來(lái)自SLE患者的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在體外都自然地產(chǎn)生高水平的IL-10.Llorente等，Arthritis Rheum.40249-60(1997)。在幾項(xiàng)研究中，研究人員證明了IL-10血清水平和疾病活動(dòng)性之間的相關(guān)性。此外，體內(nèi)和體外研究都表明，阻斷IL-10產(chǎn)生可以減輕SLE的臨床表現(xiàn)。參見(jiàn)，例如，Gonzalez-Amaro等，J.Autoimmunity 11395-402(1998)。迄今為止，已經(jīng)通過(guò)使用免疫抑制性治療，例如，糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺，治療了SLE的表現(xiàn)之一，狼瘡腎炎。盡管是有效的，這些治療是非特異性的，并且存在妨礙長(zhǎng)期治療的顯著的毒性。因而，特異性中和抗體可能是IL-10的有效拮抗物，容許除去IL-10的抑制性效果而保持免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的其余部分的完整性。在體內(nèi)使用抗體作為治療劑的最重要限制是抗體的免疫原性。大多數(shù)單克隆抗體來(lái)源于嚙齒動(dòng)物，在人類(lèi)中重復(fù)使用引起針對(duì)治療性抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。這種免疫反應(yīng)最小會(huì)引起治療效力的損失，最大會(huì)引起潛在的致死性過(guò)敏反應(yīng)。降低嚙齒動(dòng)物抗體的免疫原性的最初的努力包括產(chǎn)生嵌合抗體，其中鼠可變區(qū)與人類(lèi)恒定區(qū)融合。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439(1987)。然而，用人類(lèi)可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的雜合體注射的小鼠發(fā)展出針對(duì)人類(lèi)可變區(qū)的強(qiáng)烈的抗抗體反應(yīng)，提示在這種嵌合抗體中保留完整的嚙齒動(dòng)物Fv區(qū)域仍可能在患者中產(chǎn)生不需要的免疫原性。普遍認(rèn)為的是，可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)環(huán)包括抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，嘗試將嚙齒動(dòng)物CDR環(huán)移植到人類(lèi)框架上(即，人源化)來(lái)進(jìn)一步最小化嚙齒動(dòng)物序列。Jones等，Nature321522(1986)；Verhoeyen等，Science2391534(1988)。然而，CDR環(huán)交換仍然不能一致地產(chǎn)生具有與起始抗體相同結(jié)合性質(zhì)的抗體。在人源化抗體中涉及CDR環(huán)支持的框架殘基(FR)的變化也是保存抗原結(jié)合親合性所需的。Kabat等，J.Immunol.1471709(1991)。盡管已經(jīng)報(bào)道了在許多人源化抗體構(gòu)建體中使用CDR移植和框架殘基保留，還是很難預(yù)測(cè)具體的序列是否會(huì)產(chǎn)生具有期望的結(jié)合性質(zhì)、有時(shí)是生物學(xué)性質(zhì)的抗體。參見(jiàn)，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8610029(1989)，Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA884181(1991)，and Hodgson，Bio/Technology9421(1991)。此外，大多數(shù)在先的研究使用了不同的人類(lèi)序列用于動(dòng)物的輕鏈和重鏈可變序列，使得這種研究的預(yù)測(cè)的性質(zhì)是不可靠的。已經(jīng)使用了已知抗體的序列，或更典型地，具有已知X射線(xiàn)結(jié)構(gòu)的那些抗體，抗體NEW和KOL的序列。參見(jiàn)，例如，Jones等，見(jiàn)上文；Verhoeyen等，見(jiàn)上文；和Gorman等，見(jiàn)上文。僅對(duì)少數(shù)的人源化構(gòu)建體報(bào)道了確切的序列信息。本發(fā)明提供了識(shí)別人類(lèi)IL-10并調(diào)整其活性，特別是關(guān)于自體免疫失調(diào)的活性的人源化單克隆抗體。人源化抗體應(yīng)當(dāng)提供沒(méi)有與當(dāng)前的治療相關(guān)的毒性和非特異性的替換性治療選擇。
發(fā)明概述在此提供的是一種結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO1、CDR2的SEQ ID NO2和CDR3的SEQ ID NO3構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自CDR1的SEQ ID NO6、CDR2的SEQ ID NO7和CDR3的SEQ ID NO8的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。在此還提供的是抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO4的可變區(qū)的多肽。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO5的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO9的可變區(qū)的多肽。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO10的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在此進(jìn)一步提供是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO1、CDR2的SEQ ID NO2和CDR3的SEQ ID NO3構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ IDNO6、CDR2的SEQ ID NO7和CDR3的SEQ ID NO8構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。還在此提供的是一種結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO11、CDR2的SEQ ID NO12和CDR3的SEQID NO13構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中所述框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈或其結(jié)合片段，包括具有選自由CDR1的SEQ IDNO15、CDR2的SEQ ID NO16和CDR3的SEQ ID NO17構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中所述框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO14的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在又一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO18的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在此進(jìn)一步提供是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO11、CDR2的SEQ ID NO12和CDR3的SEQID NO13構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO15、CDR2的SEQ ID NO16和CDR3的SEQ ID NO17構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，以上描述的抗體進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含γ1、γ2、γ3或γ4人類(lèi)重鏈恒定區(qū)或其變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述抗體進(jìn)一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。在某些實(shí)施方式中，這些抗體的結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和雙抗體(diabody)構(gòu)成的組的抗體片段。在此進(jìn)一步提供的是在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受試者以有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是在此公開(kāi)的抗體。通過(guò)這種方法抑制的免疫反應(yīng)是體液的或細(xì)胞的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用這種方法治療的受試者患有全身性紅斑狼瘡。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者患有狼瘡腎炎。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述受試者患有HIV。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者患有肝炎C。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法包括向需要其的受試者施用(1)有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量的特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是在此公開(kāi)的抗體，和(2)免疫抑制試劑。在此提供的是一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合，其中所述抗體是以上公開(kāi)的抗體之一。進(jìn)一步提供的是編碼以上公開(kāi)的抗體的多肽的分離的核酸。在此還提供的是表達(dá)載體，包含與控制序列可操作連接的分離的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞識(shí)別。在此提供的是包含所述載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含所述分離的核酸序列。在此進(jìn)一步提供的是生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達(dá)所述核酸序列的條件下培養(yǎng)包含所述載體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細(xì)胞回收所述多肽。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO19的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO20的核酸序列的重鏈。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述輕鏈具有美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)保藏號(hào)PTA-5923，所述重鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5922。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO21的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO22的核酸序列的重鏈。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述輕鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5927，所述重鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5926。在此進(jìn)一步提供的是編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由上述核酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)2構(gòu)成的組的抗體片段。在此提供的是鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，包括步驟a)鑒定具有期望的生物學(xué)活性的非人類(lèi)抗體；b)確定非人類(lèi)抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和c)將非人類(lèi)抗體序列與一組人類(lèi)種系序列進(jìn)行比較，其中所述比較包括子步驟1)給非人類(lèi)VH和VL結(jié)構(gòu)域序列的序列分配殘基編號(hào)；2)描繪序列中的CDR和FR區(qū)域；3)在非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配預(yù)定的數(shù)字分值；和4)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值；和d)將具有最高的總殘基分值的人類(lèi)種系序列鑒定作為接受體種系序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括子步驟5)在子步驟(4)之后，為具有相同總殘基分值的種系序列，對(duì)在子步驟(3)中未計(jì)分的非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配數(shù)字分值1；6)總和所有殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值。在特定的實(shí)施方式中，所述非人類(lèi)抗體特異于IL-10并且抑制IL-10的生物學(xué)活性。在特定的實(shí)施方式中，對(duì)于VH和VL區(qū)分別如表2和3中的將數(shù)字分值分配給殘基。在此進(jìn)一步提供的是通過(guò)上述方法產(chǎn)生的抗體。
附圖
的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[Ag]＝Koff[AbAg]2.抗體和抗原1∶1結(jié)合，總抗體等于抗原抗體復(fù)合物加上游離抗體3.儀器信號(hào)與游離抗體濃度線(xiàn)性相關(guān)。使用的材料針對(duì)重組人類(lèi)IL-10的單克隆的人源化抗體SCH 708980(h12G8)；重組人類(lèi)IL-10(hIL-10)；重組小鼠IL-10(mIL-10)，重組犬IL-10(犬IL-10)；PMMA粒子，98微米(Sapidyne，Cat No.440198)；Neutravidin(Pierce，Cat No.31000)；EZ-link TFPPEO-Biotin (Pierce，Cat No.21219)；生物素化的rhIL-10；和Cy5結(jié)合的山羊抗HuIgG(H+L)(Jackson Immunoresearch LaboratoriesCat.No 109-175-088，lot 49069)。PMMA粒子根據(jù)廠(chǎng)家的方案用生物素化的rhIL5包被。對(duì)于rhIL5的生物素化，根據(jù)廠(chǎng)家的推薦(Pierce bulletin 0874)使用EZ-link TFP PEO-Biotin。所有實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)KinExA 3000手冊(cè)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)條件所有的都一式兩份地進(jìn)行。對(duì)于hIL-10，使用以下條件樣品體積1.5ml樣品流速0.25ml/min標(biāo)記物體積0.5ml標(biāo)記物流速0.25ml/minmAb濃度0.1nM最高Ag(hIL-10)濃度4.0nM最低Ag(hIL-10)濃度3.91pM制備抗原的兩倍連續(xù)稀釋物，并與恒定濃度的抗體混合。將混合物在室溫下(RT)孵化2小時(shí)以達(dá)到平衡。對(duì)于mIL-10，使用以下條件樣品體積0.5ml樣品流速0.25ml/min標(biāo)記物體積0.5ml標(biāo)記物流速0.25ml/minmAb濃度1nM最高Ag(mIL-10)濃度50nM最低Ag(mIL-10)濃度48.8pM制備抗原的兩倍連續(xù)稀釋物，并與恒定濃度的抗體混合。將混合物在RT孵化2小時(shí)以達(dá)到平衡。對(duì)于犬IL-10，使用以下條件樣品體積2ml樣品流速0.25ml/min標(biāo)記物體積1ml標(biāo)記物流速0.25ml/minmAb濃度0.1nM最高Ag(mIL-10)濃度5.0nM最低Ag(mIL-10)濃度4.88pM制備抗原的兩倍連續(xù)稀釋物，并與恒定濃度的抗體混合。將混合物在RT孵化2小時(shí)以達(dá)到平衡。結(jié)果在下表中示出。
表14.使用KinExA技術(shù)的12F8抗體平衡解離常數(shù)(Kd)
實(shí)施例V.應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性電化學(xué)發(fā)光化驗(yàn)(ECLA)來(lái)測(cè)量抗hIL-10單克隆抗體和hIL-10-Ra與不同來(lái)源的重組IL-10的結(jié)合。技術(shù)概述.電化學(xué)發(fā)光技術(shù)是由IGEN，Inc(Gaithersburg，MD)開(kāi)發(fā)的，被應(yīng)用在用于這個(gè)工作的M系列M8/384分析儀中。電化學(xué)發(fā)光技術(shù)使用了穩(wěn)定的釕金屬螯合物(Ori-TAG)，在存在三丙胺(TPA)的情況下，其在施加電壓時(shí)產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。順磁性的球珠，直徑為數(shù)微米，充當(dāng)固相并且便于快速的分析動(dòng)力學(xué)。球珠/復(fù)合物引導(dǎo)經(jīng)過(guò)流動(dòng)細(xì)胞，通過(guò)施加磁性被俘獲在電極上。施加電壓，測(cè)量產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光。使用的材料.96孔聚丙烯平板(Costar，Cat.No.3365，F(xiàn)isher Sci.Cat.No.07200697)；0.1％BSA、0.05％吐溫20、PBS pH7.5的化驗(yàn)緩沖液；順磁性的球珠(Streptavidin-Dynabeads，Igen，Inc.，Cat.No.110029)；重組人類(lèi)IL-10二聚物(hIL-10-dimer)；重組人類(lèi)IL-10單體(hIL-10-mono)；重組小鼠IL-10(mIL-10)；重組犬IL-10(cynoIL-10)；和重組hIL-10Ra(hIL-10Ra)FLAG-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。根據(jù)廠(chǎng)家的方案使用Ori-Tag-NHS酯(Igen，Inc.Cat.No.110034)制備Ori-Tag標(biāo)記的抗FLAG M2單克隆抗體(OriTag標(biāo)記物IgG攻擊比例8∶1)?？笷lag M2單克隆抗體購(gòu)自Sigma(Cat.No.F3165)。使用大鼠抗hIgG單克隆抗體如上制備Ori-Tag標(biāo)記的抗hIgG 1A2單克隆抗體。從多克隆山羊抗大鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoresearchLaboratories，Inc.PA，Cat.No.112-005-143)如上制備Ori-Tag標(biāo)記的抗大鼠IgG抗體。根據(jù)廠(chǎng)家的推薦(Pierce bulletin 0874)使用TFP-PEO-生物素(Pierce，Cat.No.21219)制備生物素化的重組人類(lèi)IL-10(hIL-10-生物素)。如在此描述的制備大鼠抗hIL-10 mAb 12G8(r12G8)JES3.12G8和人源化抗hIL-10mAb 12G8(h12G8-1)。方案.對(duì)所有未標(biāo)記的IL-10制品(mIL-10、犬IL-10、hIL-10二聚物、hIL-10單體)在96孔微量滴定板中進(jìn)行50微升化驗(yàn)緩沖液的1/3連續(xù)稀釋?zhuān)瑥牡谝豢椎?μg/ml開(kāi)始。所有樣品進(jìn)行一式兩份。將25ng/ml的50μl hIL-10-生物素添加到每個(gè)孔中，隨后添加hIL-10Ra(100ng/ml 50μl)或抗hIL-10 mAb(10ng/ml 50μl)。向每個(gè)孔中以500ng/ml的濃度添加50微升Ori-Tag結(jié)合的第二抗體。對(duì)于hIL-10Ra、r12G8和h12G8，相應(yīng)地使用以下的Ori-Tag結(jié)合物抗FLAG M2-OriTag、抗大鼠IgG-OriTag和抗hIgG 1A2-OriTag。最后，向每個(gè)孔添加50μl 0.1mg/ml的鏈霉抗生物素-Dynabeads。在室溫下孵化一小時(shí)以后，用M系列M8/384分析儀處理平板。相對(duì)于對(duì)照樣品，計(jì)算未標(biāo)記IL-10制品的信號(hào)的抑制百分比。為了標(biāo)繪數(shù)據(jù)和計(jì)算IC50，使用GraphPad Prism軟件。結(jié)果在下表中示出。
表15.使用ELCA測(cè)定結(jié)合親合性 在下表中概述大鼠12G8抗體和人源化12G8抗體(SCH708980)的表征的結(jié)果。
表16
實(shí)施例VI.人源化抗人類(lèi)IL-10抗體的體內(nèi)中和效果在小鼠Leishnaania major模型中中評(píng)估SCH 708980和JES.12G8的體內(nèi)中和效力。在這個(gè)模型中，通常對(duì)寄生蟲(chóng)感染有抗性的CB6F1小鼠通過(guò)MHC II類(lèi)啟動(dòng)子控制下的人類(lèi)IL-10轉(zhuǎn)基因的雜合來(lái)變?yōu)橐赘械摹Ｔ谟?5×106靜止期L.major寄生蟲(chóng)進(jìn)行s.c.爪墊攻擊之前的3天，開(kāi)始每周地用SCH 708980或JES.12G8s.c.注射CB6F1或CB6F1-huIL-10Tg小鼠。通過(guò)每周測(cè)量爪墊腫脹來(lái)監(jiān)控疾病發(fā)展。附圖3顯示了SCH708980(人源化12G8)和親本大鼠12G8都以劑量依賴(lài)性的方式中和了IL-10的保護(hù)效應(yīng)?？梢赃M(jìn)行對(duì)本發(fā)明的許多修改和變化而不背離它的精神和范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在此描述的特定實(shí)施方式僅以舉例的方式來(lái)提供，本發(fā)明將由附隨的權(quán)利要求的條目與該權(quán)利要求所享有的等同物的完整范圍一起來(lái)限制；本發(fā)明不被特定的實(shí)施方式限制，所述實(shí)施方式通過(guò)舉例的方式呈現(xiàn)于此。對(duì)上述出版物或文件的引述不意味著認(rèn)可任何上述的內(nèi)容是相關(guān)的先有技術(shù)，其也不構(gòu)成對(duì)這些出版物或文件的內(nèi)容或日期的任何認(rèn)可。在此引用的美國(guó)專(zhuān)利和其他出版物通過(guò)引用合并在此。
序列表<110>Schering Corporation<120>白細(xì)胞介素-10抗體<130>DX06061-RFD<150>US 60/518,999<151>2003-11-10<160>26<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>11<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>1Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn Leu Ala1 5 10<210>2<211>7<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>2Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>3His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr1 5<210>4<211>108<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr85 90 95Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr100 105<210>5<211>213<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr85 90 95Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>6<211>10<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>6Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr His Met Ala1 5 10<210>7<211>17<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>7Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg1 5 10 15Gly<210>8<211>10<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>8His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr1 5 10
<210>9<211>119<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val50 55 60Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>10<211>449<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe115 120 125Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 190Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro195 200 205Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys210 215 220Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser245 250 255Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp260 265 270Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn275 280 285Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys325 330 335Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr340 345 350Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr355 360 365Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu370 375 380Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu385 390 395 400Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys405 410 415Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu420 425 430Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445Lys<210>11<211>15<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>11Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly His Ser Phe Met His1 5 10 15<210>12<211>7<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>12
Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>13Gln Gln Gly Asn Glu Asp Pro Trp Thr1 5<210>14<211>218<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr20 25 30Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn85 90 95Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln115 120 125Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr130 135 140Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr165 170 175Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys180 185 190His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro195 200 205Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215<210>15<211>10<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>15Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His1 5 10<210>16<211>16<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>16Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser1 5 10 15<210>17<211>10<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>17Asn Arg Gly Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>18<211>448<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile50 55 60Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser225 230 235 240Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro260 265 270Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala275 280 285Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val290 295 300Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr305 310 315 320Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr325 330 335Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu340 345 350Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys355 360 365Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser370 375 380Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp385 390 395 400Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser405 410 415Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala420 425 430Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445<210>19<211>639<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgca agacaagtca gaacattttt gagaacttgg cctggtatca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaagccctt tgcaagcggg ggtcccatca180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg caacttacta ctgtcaccag tattatagcg ggtacacgtt tggacctggg300accaagctgg aactgaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct360gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc420agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag480agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg540agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg600agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639<210>20<211>1347<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatcata tggcctgggt ccgccaggct120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaagc attactcttg atgctaccta cacttactat180cgcgactccg tgcgcggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacatcga300ggctttagcg tctggcttga ttactggggc caaggcaccc tggtcaccgt ctcgtcggct360agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc420acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg480aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga540ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac600atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa660tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg720tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag780gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac840gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc900acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag960tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg1200gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag1260caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag1320aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa1347<210>21<211>654<212>DNA<213>Homo sapiens<400>21gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gagccagtga aagtgttgat gattatggcc atagttttat gcactggtac120cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc gtgcatccac cctagaatct180ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc240agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat tactgtcagc aaggtaatga ggatccgtgg300acgttcggtc aaggtaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc360atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg420aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg480ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc540agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc600acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654<210>22<211>1344<212>DNA<213>Homo sapiens<400>22caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggttt ctcattaaca aactatggtg tacactgggt ccgccaggct120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat180gcagctttca tatcccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg240caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aaataggggg300tacgacgtct actttgacta ctggggccaa ggcacccttg tcacagtctc gtcggctagc360accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca420gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc540tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc600tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct660tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca720gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc780acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg840gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg900taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac960aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg l140gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320agcctctccc tgtctccggg taaa 1344<210>23<211>232<212>PRT<213>人工<220>
<223>嵌合12G8<400>23Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala1 5 10 15Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala20 25 30Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile35 40 45Phe Glu Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Arg Glu Pro Pro Lys50 55 60Leu Leu Ile Phe Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Ile Pro Ser Arg65 70 75 80
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<223>嵌合12G8<400>24Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Met Lys Asp1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg20 25 30Pro Gly Gly Ser Lau Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45
Ser Asp Tyr His Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg65 70 75 80Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Thr85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr100 105 110Phe Tyr Cys Thr Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr370<210>25<211>699<212>DNA<213>人工<220>
<223>嵌合12G8<400>25atggctccag ttcaactttt agggcttttg gtgctcttcc tcccagccat gagatgtgac 60atccagatga cccagtctcc ttcactcctg tctgcatctg tgggagacag agtcactctc120aactgcaaga caagtcagaa catttttgag aacttggcct ggtatcagca aaagcttaga180gaacctccca aactcctgat ttttaatgca agccctttgc aagcgggcat cccttcaagg240ttcagtggca gtggatctgg tacagatttc acactcacca tcaccagcct gcagcctgag300gatgttgcca catatttctg ccaccagtat tatagcgggt acacgtttgg acctgggacc360aagctggaac tgaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat420gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga480gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt540gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc600aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc660tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaa 699
<210>26<211>1113<212>DNA<213>人工<220>
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1.結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO1、CDR2的SEQ ID NO2和CDR3的SEQ ID NO3構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQ ID NO6、CDR2的SEQ ID NO7和CDR3的SEQ ID NO8構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的抗體，進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含γ1、γ2、γ3或γ4人類(lèi)重鏈恒定區(qū)或其變體。
3.權(quán)利要求1的抗體，進(jìn)一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO4的可變區(qū)的多肽。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO5的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO9的可變區(qū)的多肽。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO10的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
9.結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自CDR1的SEQ ID NO1、CDR2的SEQ ID NO2和CDR3的SEQ ID NO3的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自CDR1的SEQ ID NO6、CDR2的SEQ ID NO7和CDR3的SEQ ID NO8的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。
10.結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDR1的SEQID NO11、CDR2的SEQ ID NO12和CDR3的SEQ ID NO13構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自CDR1的SEQ IDNO15、CDR2的SEQ ID NO16和CDR3的SEQ ID NO17的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的抗體，進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含γ1、γ2、γ3或γ4人類(lèi)重鏈恒定區(qū)或其變體。
12.權(quán)利要求10的抗體，進(jìn)一步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。
13.權(quán)利要求10的抗體，其中所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。
14.權(quán)利要求10的抗體，其中所述抗體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO14的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
15.權(quán)利要求10的抗體，其中所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO18的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。
16.結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有CDR1的SEQ IDNO11、CDR2的SEQ ID NO12和CDR3的SEQ ID NO13的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體重鏈或其結(jié)合片段，包含具有CDR1的SEQ IDNO15、CDR2的SEQ ID NO16和CDR3的SEQ ID NO17的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。
17.在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受試者以有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是權(quán)利要求1或9的抗體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫反應(yīng)是體液反應(yīng)。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述受試者患有全身性紅斑狼瘡。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述受試者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述受試者患有狼瘡腎炎。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述受試者患有HIV。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述受試者患有肝炎C。
24.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括施用免疫抑制試劑。
25.在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受試者以有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是權(quán)利要求10或16的抗體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫反應(yīng)是體液反應(yīng)。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有全身性紅斑狼瘡。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有狼瘡腎炎。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有HIV。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有肝炎C。
32.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括施用免疫抑制試劑。
33.一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合，其中所述抗體是權(quán)利要求1或9的抗體。
34.權(quán)利要求33的組合物，進(jìn)一步包括免疫抑制試劑。
35.一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合，其中所述抗體是權(quán)利要求10或16的抗體。
36.權(quán)利要求35的組合物，進(jìn)一步包括免疫抑制試劑。
37.編碼權(quán)利要求1或9的多肽的分離的核酸。
38.編碼權(quán)利要求10或16的多肽的分離的核酸。
39.一種表達(dá)載體，包含與控制序列可操作連接的權(quán)利要求37的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞識(shí)別。
40.包含權(quán)利要求38的載體的宿主細(xì)胞。
41.生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達(dá)所述核酸序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細(xì)胞回收所述多肽。
42.一種表達(dá)載體，包含與控制序列可操作連接的權(quán)利要求38的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞識(shí)別。
43.包含權(quán)利要求42的載體的宿主細(xì)胞。
44.生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達(dá)所述核酸序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細(xì)胞回收所述多肽。
45.編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ IDNO21的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO22的核酸序列的重鏈。
46.權(quán)利要求45的核酸，其中所述輕鏈具有美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)保藏號(hào)PTA-5923，所述重鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5922。
47.編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ IDNO23的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO24的核酸序列的重鏈。
48.權(quán)利要求47的核酸，其中所述輕鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5927，所述重鏈具有ATCC保藏號(hào)PTA-5926。
49.編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由權(quán)利要求45的核酸序列編碼。
50.編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由權(quán)利要求47的核酸序列編碼。
51.權(quán)利要求49或50的核酸，其中所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和雙抗體構(gòu)成的組的抗體片段。
52.鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，該方法包括步驟a)鑒定具有期望的生物學(xué)活性的非人類(lèi)抗體；b)確定非人類(lèi)抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和c)將所述非人類(lèi)抗體序列與一組人類(lèi)種系序列進(jìn)行比較，其中所述比較包括子步驟1)給非人類(lèi)VH和VL結(jié)構(gòu)域序列的序列分配殘基編號(hào)；2)描繪序列中的CDR和FR區(qū)域；3)在非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配預(yù)定的數(shù)字分值；和4)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值；和d)將具有最高的總殘基分值的人類(lèi)種系序列鑒定作為接受體種系序列。
53.權(quán)利要求52的方法，進(jìn)一步包括子步驟a)在子步驟(4)之后，為具有相同總殘基分值的種系序列，對(duì)在子步驟(3)中未計(jì)分的非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配數(shù)字分值1；b)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述VH區(qū)域按照表2計(jì)分。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述VL區(qū)域按照表3計(jì)分。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述非人類(lèi)抗體特異于IL-10并抑制IL-10的生物學(xué)活性。
57.權(quán)利要求52的方法產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
在此提供的方法和組合物一般地涉及IL－10特異性抗體和其用途。更具體地說(shuō)，人源化IL－10特異性抗體的組合物和使用這樣的抗體的方法，用于調(diào)整IL－10的生物學(xué)活性，特別是在自體免疫失調(diào)和病原體介導(dǎo)的免疫病理中。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1906213SQ200480040148
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者L·G·普雷斯塔 申請(qǐng)人:先靈公司