專利名稱：聚丙基醚亞胺的糖樹狀聚體的制作方法
聚丙基醚亞胺的糖樹狀聚體
本申請要求2010年8月24日提交的美國臨時申請US61/344，571和2011年6月2日提交的英國申請?zhí)朑B1109292.1的優(yōu)先權(quán)，將這兩篇文獻的內(nèi)容引入本文參考。
本說明書涉及包含聚丙基醚亞胺芯的糖樹狀聚體(glycodendrimer)、包含它們的藥物制劑及其在治療、特別是治療促炎細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8介導(dǎo)的病癥中的應(yīng)用。本說明書還涉及糖樹狀聚體的生產(chǎn)方法和聚丙基醚亞胺芯在制備所述糖樹狀聚體中的應(yīng)用。
背景
在2009年，Park等人定義了通過TLR4-MD2識別LPS的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1，2]。
簡言之，MD2具有配有帶電荷的親水性入口的疏水性袋。脂質(zhì)A(由兩個彼此通過酯鍵連接的磷酸化葡糖胺分子組成)結(jié)合這種袋的入口。其脂質(zhì)鏈然后進入MD2的疏水性袋。TLR4-MD2-LPS復(fù)合物進行構(gòu)象改變且TLR4 二聚化。隨后發(fā)生胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。
近來強化了 LPS的糖部分和LPS與MD2之間的靜電相互作用的重要性[3，4]。
認(rèn)為最相關(guān)的殘基是Tyrl02,然后是 Lys91、Arg96、Argl06、Asnll4 和 Serll8。已經(jīng)將這些殘基和/或其極為親近性的殘基鑒定為在MD2識別LPS中具有重要作用[1，3，4]。
細(xì)菌感染和手術(shù)組織損傷引起基于TLR4免疫-調(diào)節(jié)的相同細(xì)胞表面受體-配體相互作用。這并不涉及單一受體-配體相互作用。而這些促炎細(xì)胞因子應(yīng)答由細(xì)菌來源的脂多糖(LPS)和/或手術(shù)衍生的透明質(zhì)酸片段與細(xì)胞表面TLR4受體之間的多價受體-配體相互作用介導(dǎo)[5]。這些配體對這種受體的結(jié)合親和力在受體-配體相互作用數(shù)量增加時呈指數(shù)地增加。因此，期望通過制成可以與組織損傷途徑相互作用和調(diào)節(jié)組織損傷途徑的新生物材料使多價的概念適合于新的生物材料設(shè)計。
當(dāng)多價需要多個和協(xié)作性受體-配體相互作用時,藥物介入也需要基于也能夠進行多個和協(xié)作性相互作用的分子的新的藥物。這一目的已經(jīng)使用基于蛋白質(zhì)的藥物實現(xiàn)，所述基于蛋白質(zhì)的藥物以高度親和力與多個細(xì)胞表面受體發(fā)生相互作用。多年來，目的在于實現(xiàn)與合成大分子的類似的協(xié)同性相互作用。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在生物系統(tǒng)中，應(yīng)用線性聚合物的成功率遠低于預(yù)期。使用線性聚合物的嘗試受到如下情況的阻礙:-(1)所用大分子的結(jié)構(gòu)不均勻性；(2)不能控制其大小和分子量特征；和(3)活化補體和凝固觸發(fā)的途徑的毒性副作用。
此外，就展示出糖的線性聚合物而言，它們具有自我締合和形成膠束的趨勢，原因在于許多聚合物-糖組合的兩親特征。就多糖而言，其結(jié)構(gòu)不均勻性和涉及其制備的化學(xué)復(fù)雜性阻礙了具有適合的生物特性的所定義的寡糖-類分子的制備規(guī)模可伸縮性和可再現(xiàn)的合成。一般而言，需要許多合成步驟且化學(xué)中間體和產(chǎn)物的極性使得它們難以純化。這些化合物也難以操控，因為它們傾向于變成吸濕性糖漿狀物，在化學(xué)上不穩(wěn)定，傾向于快速微生物降解和難以加工成藥物。這些基礎(chǔ)問題已經(jīng)阻礙了基于糖的大分子在藥物應(yīng)用中的規(guī)?；苽?。
W003/089010公開了基于PAMAM芯的一些糖樹狀聚體。已經(jīng)廣泛研究了與葡糖胺或硫酸葡糖胺共軛以形成3.5代樹狀聚體(dendrimer)的第3代PAMAM樹狀聚體。已經(jīng)顯示這些分子具有極為有意義的生物活性和低毒性，且特別是具有顯著的抗-細(xì)胞因子和抗-趨化因子特性。
然而，迄今為止，尚未將這些化合物作為藥物產(chǎn)品提出且始終沒有對人體給藥，因為尚無鑒定為可商業(yè)化和有活力地將它們制成適合于對人體給藥的“純度”水平的方式。眾多所謂的“不純物”是與期望的種類極為密切相關(guān)的種類，因此，分離不同的本體極為困難且使用目前可得到的基于色譜和/或過濾的技術(shù)是不可能的。
盡管不希望受到理論約束，但是目前本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為基于PAMAM糖樹狀聚體的化學(xué)自身與提供適合于藥物應(yīng)用的分子不相容。
然而，PAMAM糖樹狀聚體因其生物活性而是特殊的分子。盡管存在可以制備樹狀聚體的許多芯，但是似乎由幾種可選的芯制成的糖樹狀聚體不具有必需的生物學(xué)特性。
本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，令人意外地，本文所述的糖樹狀聚體可以提供一定的生物特性，從而使得它們適合于藥物介入，另外，基于本發(fā)明分子的化學(xué)適合于提供一種分子，其最終可以用作藥物產(chǎn)品。
發(fā)明概述
因此，提供了糖樹狀聚體，其包含:
a)支持16個末端羧酸基團的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和
b)與所述芯共軛的2、3、4或5個葡糖胺分子，
其中每個葡糖胺直接通過O長度的酰胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。
發(fā)明詳述
樹狀聚體是一類聚合物化合物，其不同于常規(guī)的線性聚合物的方面在于其高度分支的、環(huán)狀和對稱結(jié)構(gòu)體系。
第一種樹狀聚體通過分支合成方法由VSgtle在1978年、Allied Corporation的 Denkewalter 在 1981 年、Dow Chemical 的 Donald Tomalia 在 1983 年和在 1985 年及Newkome在1985年制成。在1990年，Jean Fr6chet引入了匯聚合成方法。樹狀聚體的普及性隨后顯著增加，截止到2005年產(chǎn)生了超過5，000篇的科學(xué)論文和專利[6]。
分支合成是主要的，其中分子從中心向外以層疊加。所謂的“代”實際上是指生產(chǎn)樹狀聚體的合成中的疊層步驟的數(shù)量。因此，在分支方法中，樹狀聚體從芯向外生長，典型地存在具有每種新“代”的反應(yīng)官能團的數(shù)量倍增。然而，對術(shù)語“代”需要謹(jǐn)慎地加以采用，因為不同的原料需要不同的合成技術(shù)，這可能意味著在一些方式中，由一種原料制成的某些“代”的樹狀聚體可能不一定直接與由不同原料制備的樹狀聚體比擬，不過，名義上它們以相同的代數(shù)給出。術(shù)語“代”并不等同于樹狀聚體的絕對物理尺寸。
相反，匯聚合成在于其中分子以碎片構(gòu)成并且在合成的最后步驟或后期階段時組裝。因此，匯聚生長方法包括將具有碳水化合物的樹狀楔形物合成為結(jié)構(gòu)成分之一，然后使這些楔形物連接提供分支的其他成分，然后最終使這些樹型單元(dendrons)連接芯成分，得到期望的樹狀聚體。采用這種匯聚合成方案典型地得到較大量的在樹狀聚體表面上展示的糖，特別是可以導(dǎo)致在組裝最終的樹狀聚體時在樹狀聚體上完全糖封端。并不將以匯聚方式制備的樹狀聚體歸為一代。
有利地，樹狀聚體具有可以比對線型聚合物可能的更精確得多定義的分子結(jié)構(gòu)[67]。
如上所述，不同的原料可以用于生成芯。基于聚酰氨基胺(PAMAM)的樹狀聚體已經(jīng)得到廣泛研究。通過分支合成制備PAMAM樹狀聚體。有關(guān)分支合成的陰離子型羧酸封端的PAMAM樹狀聚體的詳細(xì)綜述可以在W003/089010和[8]中找到。通過在芯上遞增添加稱作代的分支層形成PAMAM糖樹狀聚體。典型地，可以得到為胺封端的完整代和羧酸封端的半代的它們。樹狀聚體的代由此代表相關(guān)術(shù)語的其大小(測定為以埃計的其直徑)及其分子量[9]。分支樹狀聚體還可以由聚丙基亞胺(PPI)、聚賴氨酸、三嗪和聚丙基醚亞胺合成。在2010年有關(guān)目前領(lǐng)域中分支合成的樹狀聚體及其應(yīng)用的詳細(xì)綜述可以在10]中找到。有一些證據(jù)表明，與用胺基封端的那些相反，以游離羧酸封端的樹狀聚體已經(jīng)改善了毒理學(xué)特性[11]。樹狀聚體已經(jīng)應(yīng)用于許多領(lǐng)域。在制藥領(lǐng)域中，將它們作為藥物載體研究及在診斷應(yīng)用中研究。因其自身的權(quán)利而極為罕見將樹狀聚體視為治療本體，部分原因在于其大小和復(fù)雜性。在樹狀聚體作為藥物載體或作為診斷工具的應(yīng)用中，該領(lǐng)域顯然被生產(chǎn)越來越大的樹狀聚體所困擾。存在許多有關(guān)該物質(zhì)的合成化學(xué)論文。然而，應(yīng)注意，文獻中已經(jīng)反復(fù)證實高化合價(在這些大分子中)并不相當(dāng)于高生物親和力。實際上，基礎(chǔ)骨架的精確性與糖配體/分子的拷貝數(shù)對具有生物活性的分子而言同樣重要[13]。即芯并非簡單地是氨基糖分子的惰性支持物。W003/089010公開了具有具備免疫-調(diào)節(jié)特性的部分糖基化表面的第3.5代PAMAM樹狀聚體(64個末端羧酸)。約15%或以下的表面末端羧酸通過O長度酰胺鍵與葡糖胺連接。在2004年，Shaunak證實了這種樹狀聚體阻斷促炎細(xì)胞因子應(yīng)答[8，14]，包括通過高度純化的LPS抑制促炎細(xì)胞因 子TNF- a、IL_1 β和IL_6從初級人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中釋放。盡管這種PAMAM糖樹狀聚體具有一些有意義的體外和體內(nèi)生物活性，包括預(yù)防動物模型中的過度瘢痕形成，但是這種分子尚未發(fā)展成治療劑(

圖1)，因為不能使得分子以適合的形式用作藥物。我們對生物活性的糖樹狀聚體與無生物活性的糖樹狀聚體之間的差異的分析導(dǎo)致我們認(rèn)為其與MD2腔的入口處的特定氨基酸殘基的相互作用對它們的生物活性而言是重要的。我們還認(rèn)為MD2上的袋的親水性入口(脂質(zhì)A所結(jié)合的)被本說明書的糖樹狀聚體且特別是樹狀聚體葡糖胺封閉。這防止了 TLR4 二聚化和信號傳導(dǎo)事件。我們的研究已經(jīng)證實生物活性的部分糖基化的樹狀聚體顯示最大數(shù)量和最強的與MD2袋的入口內(nèi)層上的幾個殘基的相互作用。這些殘基中的幾個對LPS結(jié)合MD2而言也是重要的。具有最高標(biāo)準(zhǔn)化相互作用值的殘基是LyS91、Tyrl02、Argl06、ASnll4和Serll8。具有較低相互作用值的幾個其他殘基也顯著地促成了部分糖基化樹狀聚體與人MD2的協(xié)同性結(jié)合；它們是 Arg96、Ser98、Lysl09、Thrl 12 和 Thrll6。因此，在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與一種或多種(例如1、2、3、4或5種)選自Lys91、Tyrl02、Argl06、Asnll4和Serl 18的殘基發(fā)生相互作用。本文所用的相互作用是指非共價鍵合，例如氫鍵、離子鍵、范德華力和/或疏水性相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Lys91發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Tyrl02發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Argl06發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與Asnl 14發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與SerllS發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體與如下的殘基發(fā)生相互作用:Lys91和Tyrl02 ；Lys91和Argl06 ；Lys91 和 Asnll4 ;Lys91 和 Serll8 ;Tyrl02 和 Argl06 ;Tyrl02 和 Asnll4 ;Tyrl02 和 Serll8 ；Argl06 和 Asnll4 ；Argl06 和 Serll8 或 Asnll4 和 Serll8。在一個或多個實施方案中，本說明書的樹狀聚體還具有至少一種(例如2、3、4或5種)與選自Arg96、Ser98、Lysl09、Thrl 12和Thrl 16的殘基的相互作用。此外，部分糖基化樹狀聚 體對人MD2的親和力根據(jù)包括葡糖胺分子和幾個樹狀聚體的周邊羧酸分支的這兩種分子之間緊密接觸(即1.3 A)的數(shù)量增加得以證實。這些靜電相互作用封閉了人MD2疏水袋的入口并且被認(rèn)為封閉了 LPS的脂質(zhì)鏈的入口。推定樹狀聚體表面的生物活性是因存在來自芯樹狀聚體的游離周邊羧酸和氨基糖(或其硫酸鹽)所致。有利地，本說明書的部分糖基化樹狀聚體是靈活性的和動態(tài)的，并且具有親水性邊緣，這意味著構(gòu)象改變可以誘導(dǎo)形狀互補性。因此，本說明書的糖樹狀聚體與生物靶標(biāo)的相互作用可以誘導(dǎo)分子上的“構(gòu)象改變”。認(rèn)為這能夠使樹狀聚體表面的糖例如葡糖胺封閉MD2袋的入口。與一些樹狀聚體的游離羧酸分支的另外的協(xié)同性靜電相互作用隨后發(fā)生。認(rèn)為這些相互作用共同地阻斷LPS的脂質(zhì)鏈進入人MD2袋，并且還防止TLR4-MD2-LPS細(xì)胞表面復(fù)合物形成。生物學(xué)重要的結(jié)果在于促炎細(xì)胞因子級聯(lián)不啟動。因此，在一個實施方案中，本說明書的樹狀聚體具有與例如如上所述的靶標(biāo)中的一種或多種所述氨基酸發(fā)生的密切相互作用。作為本文所用“密切”預(yù)以指2人或以下例如
1.5A或以下、特別是1.3人的相互作用。來自我們的模型化研究和我們的生物學(xué)研究的結(jié)果還共同表明，至少G3.5部分糖基化PAMAM樹狀聚體(和本發(fā)明的有可能更適合的樹狀聚體)與人MD2的相互作用是特異性的，且樹枝狀結(jié)構(gòu)對這種分子的生物活性而言是重要的[15，16，17，18，18a]。我們的結(jié)果還表明需要通過樹狀聚體的臂連接的至少2個葡糖胺分子結(jié)合幾個排列在MD2上腔的入口上的暴露和帶電荷的氨基酸。因此，本說明書的糖樹狀聚體一般包含至少2個葡糖胺分子(葡糖胺)。認(rèn)為20埃范圍內(nèi)的靜電相互作用負(fù)責(zé)樹狀聚體例如樹狀聚體葡糖胺與MD2之間的這種相互作用，而非氫鍵相互作用(這僅可能出現(xiàn)在4埃距離內(nèi))。推定因這種高親和力結(jié)合，2個糖部分例如2個葡糖胺殘基的最佳間隔可能為IO Λ。樹狀聚體例如樹狀聚體葡糖胺與MD2上的袋的親水性入口結(jié)合幾乎完全封閉了 MD2內(nèi)該袋的入口 ；它還誘導(dǎo)了 MD2自身內(nèi)的構(gòu)象改變，使得LPS非常難以作為有效激動劑結(jié)合蛋白質(zhì)。這有利地誘導(dǎo)了促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。這種重要的新機理性觀察結(jié)果顯示樹枝狀分子氨基糖(無任何脂質(zhì)鏈或磷酸基團結(jié)合樹狀聚體)可以作為LPS結(jié)合MD2上疏水袋的帶電荷的親水性入口的部分拮抗劑起作用。盡管不希望受到理論約束，但是認(rèn)為表面特性(外臂靈活性和電荷分布)與分子大小對生物活性而言是極其重要的，特別是氨基糖和游離羧酸和例如群密度例如形成的O長度酰胺鍵的組合是在適合大·小骨架上阻斷靶受體和產(chǎn)生治療結(jié)果所需的。糖樹狀聚體的親水性表面也起重要作用。能夠產(chǎn)生協(xié)同性作用的化合物在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的生物控制機制方面極為重要，更具體地，它們很少在純合成分子中實現(xiàn)。本說明書的樹狀聚體適合于在體外和體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同性作用。盡管從第3.5代陰離子型羧酸封端的PAMAM樹狀聚體的分子中生成的數(shù)據(jù)已經(jīng)極為富有希望和令人激動，但是其缺乏進展的一個原因在于，盡管本領(lǐng)域的許多工作人員作了反復(fù)嘗試，但是迄今尚不能將該分子制備成“單分散體”，即實際上的可以可再現(xiàn)性地制備令藥物許可部門滿意的特征化分子群體。迄今，沒有方法產(chǎn)生PAMAM樹狀聚體，其作為可以可再現(xiàn)性地制備令藥物許可部門滿意的特征化分子群體?？梢哉J(rèn)為化學(xué)自身存在缺陷的方面在于不能在這種分子的合成過程中防止副反應(yīng)發(fā)生。內(nèi)在問題因反應(yīng)不完全導(dǎo)致，且使用PAMAM化學(xué)的環(huán)化反應(yīng)意味著始終存在明顯程度的最終PAMAM產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不均勻性。因此，發(fā)明人已經(jīng)在尋找與第3.5代PAMAM樹狀聚體的分子共有特征的替代分子。然而，結(jié)果是提供期望的生物特性的表面特征、大小、靈活性和親水性并非如此易于替代。發(fā)明人目前已經(jīng)鑒定了極為有限數(shù)量的糖樹狀聚體，其具有期望的生物特性和基于不同化學(xué)的芯，因非常謹(jǐn)慎，所以它們可以用于制備具有規(guī)模化制備的純度和可再現(xiàn)性以及藥物所需的分析化學(xué)表征程度的分子，例如生成單分散體，它是基本上單一的化學(xué)本體。這種芯基于聚丙基醚亞胺，且令人意外地，使用這種芯制備的糖樹狀聚體似乎至少共有PAMAM糖樹狀聚體的有利的生物特性，且在一個或多個領(lǐng)域中可以顯示超過PAMAM糖樹狀聚體的改善。術(shù)語“單分散體”作為樹狀聚體化學(xué)領(lǐng)域中一般所理解的含義使用。這意味著樹狀聚體具有窄的分子量分布，其中主要存在一種定義分子量的具體種類。更具體地，一種具體種類以90%或以上，例如91、92、93、94、95、96、97、98%或以上存在。在一個實施方案中，本發(fā)明的糖樹狀聚體是少量充分定義的化學(xué)本體的混合物，它們是無害的或基本上與主要樹狀聚體種類相似和例如具有相似的生物活性。因此，在一個實施方案中，提供了作為分子群體的本說明書的分子。該群體可以包含大量離散的分子，其中一些可以包含多于或少于2個的葡糖胺。一般而言，具有少于2個葡糖胺的分子數(shù)量低，例如小于3%，例如2%，1%或以下，特別是0.5%或0.1%w/w。在一個實施方案中，具有多于4個葡糖胺的分子的總數(shù)低，例如小于3%，例如2%，1%或以下，特別是0.5%或0.l%w/wo在一個實施方案中，具有3或4個葡糖胺的分子的數(shù)量是50%w/w或以下，例如 40%、30%、20%、10% 或 5%w/w 以下。在本說明書上下文中的“無害”預(yù)以指不導(dǎo)致有害效應(yīng)且在生物環(huán)境中基本上無害的不純。例如，有害作用可以涉及組織毒性或催化作用或降解或任意其他可以被視為藥物缺點的特性。本文所述的“基本上與相似”預(yù)以指其中分子包含與期望的種類相同的成分，但它們以不同比例存在，例如基本上相似一般是指包含相同的芯和糖的糖樹狀聚體，但芯上的羧酸的數(shù)和/或糖或與芯共軛的糖的數(shù)量與期望的不同。在一個實施方案中，以分支方式制備樹狀聚體芯，因此，可以將得到的樹狀聚體指定為一代。在一個實施方案中，芯樹狀聚體的代是第3代。本文所用的樹狀聚體芯預(yù)以指分支樹狀聚體聚合物，此后表面通過“氨基糖”與其共軛而得到修飾。一般而言，如果考慮最終的芯，則它以游離羧酸封端。然而，如果芯位于中間階段，則它可以被非羧酸的官能團封端。本文所用的末端羧酸基團預(yù)以指位于樹狀聚體的一個表面分支末端上的游離羧酸基團-C(O)OH和任意羧酸殘基。本文所用的末端羧酸殘基預(yù)以指與另一種本體例如氨基糖發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后遺留的末端羧酸部分，例如-C(O)-。游離羧酸基團預(yù)以指未反應(yīng)(非共軛羧酸)的_C(0)0H。

本文所用的糖樹狀聚體預(yù)以指樹狀聚體芯上由葡糖胺與一些末端羧酸共軛產(chǎn)生的本體。葡糖胺與樹狀聚體芯通過葡糖胺上的氮與來自末端羧酸基團的羰基形成的酰胺鍵連接。這是直接的酰胺鍵，也稱作O長度酰胺鍵。就指定分子群體而言，存在的羧酸的數(shù)量可以計算為在整個群體中的平均值。在一個實施方案中，對群體的定義在于不包括具有低于定義的下限閾值和高于定義的上限閾值的羧酸的分子，例如，如果需要分子包含16個羧酸，則下限值可以是12，而上限值可以是20，乃至18。在一個實施方案中，糖樹狀聚體包含與起始時(共軛前)游離羧酸總數(shù)相當(dāng)?shù)哪┒唆人岷汪人釟埢?。即末端羧酸和羧酸殘基的合并?shù)量相當(dāng)于起始芯中羧酸的數(shù)量。在本說明書的糖樹狀聚體的分子中，存在至少一個且一般是一個以上游離羧酸，例如，其中游離羧酸的數(shù)量=X-Y,其中X是12 — 20范圍的數(shù)值(且相當(dāng)于樹狀聚體芯的羧酸數(shù)量)，Y是1- 5范圍的數(shù)值(且相當(dāng)于表面共軛糖分子的數(shù)量)。在一個實施方案中，在指定分子中共軛后游離羧酸的數(shù)量為11、12、13或14，例如14。本發(fā)明還擴展至包含具有11、12、13或14個游離羧酸的分子的糖樹狀聚體群體。這些游離羧酸可以在促進糖樹狀聚體與靶受體增強的多價結(jié)合中起作用，且由此與分子的生物活性相關(guān)。 本說明書的糖樹狀聚體可以作為可表征的分子的離散群體提供。有利地，羧酸封端的陰離子型聚丙基醚亞胺樹狀聚體與陽離子型聚丙基醚亞胺樹狀聚體相比在體外明顯不具有毒性[19]。這種較高代陽離子型樹狀聚體的內(nèi)在毒性是指它們對作為藥物對人反復(fù)靜脈內(nèi)給藥而言可能不適合或不安全[11]。因此，認(rèn)為本說明書的糖樹狀聚體具有低毒性，使得它們適合于用作藥物。在一個實施方案中，2、3、4或5個葡糖胺與樹狀聚體芯例如平均包含16個羧酸例如2、3或4例如2或3個羧酸的芯共軛。在一個實施方案中，2個葡糖胺與樹狀聚體芯共軛。在一個實施方案中，提供了一種分子群體，其平均有2、3、4或5個葡糖胺與樹狀聚體芯例如平均包含16個羧酸例如2、3或4例如2或3個羧酸的芯共軛。
在一個實施方案中，平均2、3、4或5個葡糖胺與樹狀聚體芯共軛。該群體可以包含I 一 8個與其共軛的葡糖胺。然而，后者一般的數(shù)量最小，例如小于10%w/w或5%w/w或以下，例如3%、2%或1%或以下。在一個實施方案中，糖樹狀聚體的主要種類包含2個葡糖胺，但例如群體還可以包含具有1、3、4和/或5個葡糖胺、例如I或3個葡糖胺的本體。甚至在具有與之共軛的相同數(shù)量的葡糖胺的分子的樹狀聚體群體中，分子也可以作為區(qū)域異構(gòu)體存在。即葡糖胺、特別是糖樹狀聚體的相對位置可變。即葡糖胺的空間排列在該群體的一個分子與另一個分子比較時是不同的。在一個實施方案中，使主要糖樹狀聚體種類的區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)量最小化，特別是對指定具有與之共軛的相同數(shù)量的葡糖胺的糖樹狀聚體群體而言，至少50%的所述群體是期望的區(qū)域異構(gòu)體，特別是75%是期望的區(qū)域異構(gòu)體?？梢杂绊憛^(qū)域異構(gòu)體分布以通過優(yōu)化共軛過程中的合成化學(xué)條件提供期望的結(jié)
果O在一個實施方案中，33%或以下的樹狀聚體羧酸與葡糖胺共軛，例如共軛了 29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、I1%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或以下的樹狀聚體羧酸，例如18.75或12.5%。在一個實施方案中，共軛羧酸的數(shù)量為3% - 14%，例如6% - 13%，特別是12.5%。然而，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為在每個分子中至少需要2個葡糖胺以有效地阻斷靶受體。此外，在一個方面中，提供了包含2個葡糖胺和14個其余的游離羧酸的高度優(yōu)化的糖樹狀聚體。在一個實施方案中，該樹狀聚體是樹狀聚體群體，其中后面的本體是主要成分，例如為單分散體。這種分子(即第3代陰離子羧酸封端的聚丙基醚亞胺樹狀聚體葡糖胺)在外形上小于本領(lǐng)域在先描述的第3.5代PAMAM樹狀聚體葡糖胺。第3.5代PAMAM樹狀聚體葡糖胺在芯中具有64個末端羧酸。令人意外地，這種小的聚丙基醚亞胺樹狀聚體在芯內(nèi)僅具有16個末端羧酸。在相同濃度(基于mg/ml)下，認(rèn)為聚丙基醚亞胺芯在制備所述糖樹狀聚體中的應(yīng)用可以減少一些促炎細(xì)胞因子，其程度等于或大于G3.5代PAMAM樹狀聚體葡糖胺，正如下表I中所概述的。表1:來自所示的幾個圖的結(jié)果的概述表。當(dāng)與G3.5PAMAM樹狀聚體葡糖胺比較時，量化了使用G3聚丙基醚亞胺樹狀聚體葡糖胺在促炎細(xì)胞因子中的減少倍數(shù)。100%對照=從用25ng/ml LPS刺激的細(xì)胞中釋放細(xì)胞因子的刺激。

權(quán)利要求
1.糖樹狀聚體，包含: a)支持16個末端羧酸基團的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和 b)與所述芯共軛的2、3、4或5個葡糖胺分子， 其中每個葡糖胺直接通過O長度的酰胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。
2.權(quán)利要求1的糖樹狀聚體，包含2、3或4個葡萄糖胺分子，例如2或3個，例如2個。
3.權(quán)利要求1一 2任一項的糖樹狀聚體，其中糖樹狀聚體是一代樹狀聚體。
4.權(quán)利要求3的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯是第3代。
5.權(quán)利要求1一 4任一項的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯具有是氧的中心原子。
6.權(quán)利要求1一 4任一項的糖樹狀聚體，其中樹狀聚體芯具有是氮的中心原子。
7.糖樹狀聚體群體,其中該群體的平均特性如權(quán)利要求1一 5任一項所定義。
8.藥物制劑，包含權(quán)利要求1一 6任一項所定義的糖樹狀聚體或如權(quán)利要求7所定義的群體及藥學(xué)可接受的賦形劑。
9.權(quán)利要求8的制劑，用于局部給藥。
10.權(quán)利要求8的制劑，用于輸注或直接注射。
11.權(quán)利要求8的制劑，用于口服給藥。
12.權(quán)利要求8 — 11任一項的制劑，其中I個劑量包含10μ g — Ig的如權(quán)利要求1 一6任一項所定義的糖樹狀聚體或如權(quán)利要求7所定義的群體。
13.如權(quán)利要求1一 6任一項所定義的糖樹狀聚體或如權(quán)利要求7所定義的群體或如權(quán)利要求8 — 12任一項所定義的藥物制劑，用于治療。
14.權(quán)利要求13的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防與宿主/患者過度促炎細(xì)胞因子應(yīng)答相關(guān)的疾病。
15.權(quán)利要求14的糖樹狀聚體、群體或制劑，其中炎癥應(yīng)答由一種或多種細(xì)胞因子水平增加介導(dǎo)，所述的細(xì)胞因子選自IL-6、TNF-a、IL-8、IL-1 β和MIP-1 β。
16.權(quán)利要求14或15的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防與革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌導(dǎo)致的感染相關(guān)的促炎細(xì)胞因子應(yīng)答。
17.權(quán)利要求16的糖樹狀聚體、群體或制劑，其中革蘭氏陰性菌感染與腹瀉相關(guān)，例如志賀菌屬或沙門氏菌屬所導(dǎo)致的那些感染。
18.權(quán)利要求16的糖樹狀聚體、群體或制劑，其中感染由大腸桿菌、Klebsiellaaeruginosa、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和/或任意其他感染性生物體導(dǎo)致。
19.權(quán)利要求16的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防牙齦炎導(dǎo)致。
20.權(quán)利要求13— 15任一項的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防炎性腸病，例如克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎。
21.權(quán)利要求13- 15任一項的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防炎癥呼吸應(yīng)答，例如過敏反應(yīng)和/或哮喘。
22.權(quán)利要求13- 15任一項的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防傷口愈合過程中的過度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、濕疹和銀屑病。
23.權(quán)利要求22的糖樹狀聚體、群體或制劑，用于治療或預(yù)防移植、例如角膜和/或皮膚移植。
24.治療或預(yù)防的方法，包含對有此需要的患者給予治療有效量的權(quán)利要求1一 6任一項的糖樹狀聚體或權(quán)利要求7的群體或權(quán)利要求8 - 12任一項的制劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、群體或制劑是為了治療或預(yù)防與患者過度促炎細(xì)胞因子應(yīng)答相關(guān)的疾病或病癥。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述應(yīng)答由一種或多種細(xì)胞因子水平增加介導(dǎo)，所述細(xì)胞因子選自 IL-6、TNF- a、IL-8、IL-1 β 和 ΜΙΡ-1 α 和 β。
27.權(quán)利要求25的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、群體或制劑是為了治療或預(yù)防與革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌感染相關(guān)的促炎細(xì)胞因子應(yīng)答。
28.權(quán)利要求27的方法，其中革蘭氏陰性菌感染與腹瀉相關(guān)，例如由造成炎性腹瀉的志賀氏菌屬或沙門氏菌屬或彎曲桿菌屬或難辨梭菌或任意類型的大腸桿菌導(dǎo)致的那些感染。
29.權(quán)利要求27的糖樹狀聚體、群體或制劑，其中感染由大腸桿菌、Klebsiellaaeruginosa、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和/或任意其他感染性生物體導(dǎo)致。
30.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是為了治療或預(yù)防炎性腸病，例如克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎。
31.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是為了治療或預(yù)防那些腸易激疾病的形式，例如與腸細(xì)菌過度刺激Toll樣受體相關(guān)的那些腸易激疾病的形式。
32.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是為了治療或預(yù)防炎癥呼吸應(yīng)答，例如過敏反應(yīng)和/或哮喘。
33.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是為了治療或預(yù)防傷口愈合過程中的過度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、濕疹和銀屑病。
34.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是為了治療或預(yù)防移植，例如角膜和/或皮膚移植。
35.權(quán)利要求24- 26任一項的方法，其中給予所述的糖樹狀聚體、其群體或制劑是治療或預(yù)防牙齦炎。
全文摘要
糖樹狀聚體，包含a)支持16個末端羧酸基團的無毒性樹狀聚體聚丙基醚亞胺芯；和b)與所述芯共軛的2、3、4或5個葡糖胺分子，其中每個葡糖胺直接通過0長度的酰胺鍵與末端羧酸基團的殘基連接。本發(fā)明還擴展至包含所述糖樹狀聚體的定義的群體、包含所述分子或群體的藥物組合物、所述分子和制劑的制備方法和所述分子、群體和組合物的治療應(yīng)用。
文檔編號C08G73/00GK103154012SQ201180047852
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者蘇尼爾·肖那克, 伊恩·阿瑟·泰奧 申請人:英皇創(chuàng)新有限公司