專利名稱：用于評估突發(fā)性大腦放電的免疫吸附劑血液測試的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及臨床的體外診斷測試，特別是用于診斷和評估與神經(jīng)和精神疾病相關風險的免疫和蛋白質組學測試。該測試檢測神經(jīng)毒性的特異腦標記，評估毒理學和神經(jīng)病學腦損傷，并且?guī)椭X病癥的診斷、治療和處理。
背景技術：
癲癇是以癲癇發(fā)作為特征的疾病----一般定義為起因于涉及神經(jīng)細胞中暫時異常電活動的腦功能短暫破壞的癲癇發(fā)作。這種破壞在腦中的位置決定了癲癇發(fā)作的類型。癲癇與暈厥形成對照，盡管兩者都經(jīng)常導致不省人事，暈厥是指由于腦血流量的暫時損傷而導致的失去知覺。
癲癇發(fā)作的兩個主要類型是局部的和全身性的。局部的癲癇發(fā)作涉及腦的一部分，而全身性的癲癇發(fā)作涉及全部腦。如果該癲癇活動波及至全部腦，局部的癲癇發(fā)作可變成全身性的癲癇發(fā)作。
許多人生來就有癲癇。在其它情況下，癲癇是來自其他病癥的腦損傷的發(fā)展結果。例如，腦腫瘤、顱腦損傷、酒精中毒和阿爾茨海默氏病經(jīng)常導致癲癇，因為它們改變了腦的正常工作。有時候中風、心力衰竭、及剝奪腦氧的其他狀況也可導致癲癇。在上了年紀的人中所有新近發(fā)展的癲癇的大約32％似乎是由于腦血管疾病。腦膜炎、AIDS、病毒性腦炎、及其他感染性的疾病可導致癲癇，如同腦積水----過量的液體積聚在腦中的狀況----也可導致癲癇。
癲癇狀活動通常在體內開始，伴有過度的AMPA受體活化；當癲癇發(fā)作活動加劇，觀察到NMDA受體的涉及增加(Dingledine，McBain，Basic Neurochenzistry.Philadelphia，PALippincott-Raven；1998，315-333)。NMDA和AMPA受體的過活化容許過量的Ca2+流進入細胞，導致許多酶和蛋白酶的活化，這開始破壞細胞膜的組成。其包括不同的Ca++活化的酶，包括調鈣蛋白-依賴的蛋白激酶、神經(jīng)鈣蛋白、鈣蛋白酶PKS、磷脂酶和大量核酸內切酶(Whetsell J.Neuropathol.Exp.Neurol.1996；551-13)。
來自癲癇的發(fā)作可采取許多形式。一般的癲癇發(fā)作包括“強直的-陣攣”、“失神”、“張力缺乏”和“肌強直”癲癇發(fā)作。強直的-陣攣癲癇發(fā)作是與癲癇有關的經(jīng)典和最明顯類型的癲癇發(fā)作，且是指其中患者喪失知覺、機體變硬的癲癇發(fā)作，該患者開始并經(jīng)歷痙攣動作；“失神”癲癇發(fā)作一般以暫時的不省人事為特征；“張力缺乏的”癲癇發(fā)作特征為導致人跌落地上的肌肉控制突然喪失；以及“肌強直”癲癇發(fā)作的特點在于通過全身或其局部的暫時有力的抽搐。局部的癲癇發(fā)作一般被分類為“簡單的局部”(癥狀包括抽搐；麻木；出汗；眩暈；惡心；聽力、視力、嗅覺或味覺障礙；déjàvu的強烈知覺)、或“復雜的局部”(該個體顯得有意識而當時他/她實際上并沒有意識)。在臨床中經(jīng)常難以區(qū)別這類癲癇發(fā)作，因為這種癲癇發(fā)作很少在醫(yī)生的辦公室中發(fā)生，并且該患者通常完全忘記該癲癇發(fā)作。
單次癲癇發(fā)作乃至多次癲癇發(fā)作并不意味著該個體患有癲癇。許多年幼的兒童具有學術上并不是由癲癇所引起的癲癇發(fā)作，例如來自發(fā)燒的驚厥。其他類型的非癲癇發(fā)作起因于體液的不平衡或化學上的、產(chǎn)前的腦損傷，或與其他疾病狀態(tài)，例如心臟狀況和糖尿病有關。這些非癲癇的發(fā)作經(jīng)常被認為是“假-癲癇”。它們經(jīng)常難以從癲癇的發(fā)作區(qū)別開來，因為癲癇發(fā)作可采取許多形式。癲癇發(fā)作還可能經(jīng)常起因于被稱為非癲癇發(fā)作病癥(“NEAD”)的狀況。發(fā)生在這種狀況下的癲癇發(fā)作本質上是精神性的，而不具有物理起源。
存在許多不同的方法，包括腦電圖(EEG)和腦部掃描(即計算機斷層分析)來確定個體是否患有癲癇，并且倘若如此，確定該個體患有何種癲癇發(fā)作。即使伴有這些先進的方法，經(jīng)常很難精確地把癲癇和非癲癇區(qū)分開，或很難區(qū)別不同種類的癲癇發(fā)作?；技侔d癇的個體經(jīng)常根據(jù)EEG檢測和檢測期間在這些患者中觀察到的突發(fā)性放電被診斷為患有癲癇。在檢測期間顯示異常突發(fā)性放電的癲癇發(fā)作患者當中，需要方法區(qū)別癲癇和非癲癇。
迄今為止，對從假癲癇辨別癲癇的體外診斷測試的診斷需要尚未得到滿足。而對評估個體發(fā)展癲癇風險，以及改善靶向、監(jiān)測和調整治療方式，例如直接針對癲癇的抗驚厥藥物和神經(jīng)外科術的診斷需要也未得到滿足。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的目的是提供血液檢查的臨床應用，并且以用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，例如突發(fā)性的大腦放電和癲癇的免疫吸附劑和免疫化學方法和試劑盒為基礎。
本發(fā)明的另一個目的是改進用于診斷突發(fā)性的大腦放電和癲癇的現(xiàn)行方法的準確度，并且提高排除非癲癇發(fā)作的腦相關癲癇發(fā)作的診斷可靠性。
另一目的是提供用于檢測生物樣品中未結合免疫球蛋白復合物的游離GluR1肽片段的測定。
本發(fā)明的另一個目的是提供利用區(qū)別癲癇和假癲癇的腦標記物診斷突發(fā)性大腦放電和癲癇的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供突發(fā)性大腦放電和癲癇、或起因于腦損傷的癲癇發(fā)作的風險和進展的免疫測定和免疫化學血液分析。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于診斷突發(fā)性大腦放電和癲癇的快速免疫測定和試劑盒，以提供容許有效治療介入的腦相關癲癇發(fā)作的實時評估。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于診斷突發(fā)性大腦放電和癲癇的快速和便宜的免疫測定和試劑盒，其可以頻繁的間隔進行以監(jiān)測腦相關癲癇發(fā)作的進展，或抗驚厥劑治療的有效性。
發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的用于評估顯示異常突發(fā)性放電的患者中癲癇發(fā)作起源和病因的方法是基于已經(jīng)經(jīng)歷癲癇發(fā)作的個體的生物液體中GluR1肽和片段的存在和數(shù)量。迄今為止突發(fā)性放電的EEG測量值，與患者的臨床評估相結合，已經(jīng)組成用于評估個體中癲癇發(fā)作起因的“黃金標準”。由于突發(fā)性放電和癲癇之間已證實的關系，具有異常突發(fā)性波峰的癲癇發(fā)作患者通常(并且經(jīng)常錯誤地)被診斷為癲癇患者，并且經(jīng)常開出抗驚厥劑藥物的處方，甚至進行不必要的手術，而實際上該癲癇發(fā)作的起因不是突發(fā)性的。
本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了以GluR1為基礎的方法、組合物和試劑，其可用于確定異常的突發(fā)性活動是否確實是癲癇發(fā)作的起源，并且可用于更準確地診斷和治療經(jīng)受盡管存在異常的突發(fā)性放電但不具有突發(fā)性起源的癲癇發(fā)作的患者，即，“假癲癇”狀況，例如暈厥、偏頭痛、失去知覺或健忘癥和發(fā)熱性或發(fā)燒癲癇發(fā)作(在兒童中)。因此，在本發(fā)明的第一個實施方案中，提供了用于確定被診斷為具有突發(fā)性放電的患者中癲癇發(fā)作起源的方法，包括直接或間接測定所述患者的生物液體中GluR1或其免疫原性片段的存在和數(shù)量。
本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于治療起因于異常突發(fā)性波峰的癲癇發(fā)作病癥的改善方法。特別地，本發(fā)明人已經(jīng)確定可根據(jù)在用給定藥物治療的患者中觀察到的GluR1變化(或其缺乏)來調整藥物類型、劑量和頻率。本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)當減少或停止所述的藥物時觀察到的GluR1變化來評估減少或停止抗驚厥劑用藥的方法。盡管傳統(tǒng)上已經(jīng)根據(jù)受試個體在藥物變化后是否經(jīng)歷癲癇發(fā)作或顯示異常的EEG活動來以反復試驗的方式調節(jié)藥物劑量，本發(fā)明提供用于測量應答藥物調整的體外試驗，并且用于評估起因于該藥物調整的癲癇發(fā)作風險。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供治療癲癇患者的方法，包括(a)直接或間接測定患者中的生物液體中GluR1或片段或其類似物應答初始劑量的抗癲癇藥物或停止或減少抗癲癇藥物的劑量在生物液體中的數(shù)量變化；以及(b)根據(jù)所述的變化改變或保持所述的劑量。
本發(fā)明人已經(jīng)更進一步發(fā)現(xiàn)用于預測以突發(fā)性的放電作為其起源的未來癲癇發(fā)作風險的方法。這些方法特別適用于處于這種癲癇發(fā)作高風險的患者，例如新生兒，已經(jīng)經(jīng)歷外傷性腦損傷的個體，和患有精神運動性癲癇的個體，當其經(jīng)受癲癇發(fā)作時，可能遭受極大的痛苦，但是由于與這種治療相關的風險，對于他們一般慎重地給予抗驚厥劑治療。具有出生檢測，例如同性質的心臟缺陷的新生兒特別需要根據(jù)本發(fā)明的方法進行監(jiān)測，因為這些患者經(jīng)常不能利用EEG加以評估，并且因為已知在嬰兒期期間的心臟外科手術導致表現(xiàn)為癲癇發(fā)作、發(fā)育延遲和運動異常的腦損傷(Bellinger等人，Circulation1999，100526-32)。中風患者是另一個特別合適的風險小組，因為已知腦血管疾病是生活后期中常見癲癇的主要誘因(Cleary等人，Lancet2004，3631184-6)。因此在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷處于癲癇危險中患者的癲癇概率的方法，包括直接或間接地分析所述患者的生物液體中GluR1或其片段的存在和數(shù)量。
這些方法大多特別地在利用特異GluR1序列和針對這些序列產(chǎn)生的抗體的免疫測定中進行。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷和/或治療人患者中的癲癇或突發(fā)性放電的方法，包括直接或間接分析來自所述患者的生物液體中SEQ ID NO5或6(如下所述)的GluR1或其免疫原性片段或同系物的存在和數(shù)量。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供以所述的肽序列和針對其的抗體為基礎的組合物、試劑盒、反應劑、校準物和標準物。
本發(fā)明的另外優(yōu)點將在下文的說明中部分地闡述，隨后部分將從該描述中顯而易見，或可從本發(fā)明的實施中學習到。本發(fā)明的優(yōu)點將通過在所附的權利要求中特別指出的要素和組合物而得以實現(xiàn)和獲得。將理解上文的概述及其后的詳述只是例證性和解釋性的，而并不限制所要求保護的本發(fā)明。
討論可參考本發(fā)明優(yōu)選實施方案的下列詳細說明和其中包括的實施例更容易地理解本發(fā)明。在公開和描述本方法和技術前，將理解本發(fā)明不限于特定的分解或綜合方法，同樣地其當然可有變化。也理解在此使用的術語學只是為了描述特定實施方案的目的而不是為了進行限制。
定義和術語的使用生物樣品是血液、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、汗液或腦組織。更優(yōu)選的，該生物樣品是生物液體。該生物液體是血清和血漿。
蛋白質、肽或多肽的類似物是指包含一個或多個氨基酸取代、缺失、添加或重排的蛋白質、肽或多肽。例如，蛋白質生物化學領域中已知屬于一組具有特定大小或特征(例如，電荷、疏水性和親水性)氨基酸的氨基酸可經(jīng)常被另一個氨基酸取代而不改變該蛋白質的活性，特別是在不直接與生物活性相關的蛋白質區(qū)域中的取代。因此，如果它在位點包括氨基酸取代、缺失、添加或重排以使得針對該類似物產(chǎn)生的抗體仍然特異地針對AMPA受體或片段，GluR1受體或其片段的類似物在本發(fā)明中是有用的。
優(yōu)選地，GluR1重組類似物與天然存在的AMPA受體具有至少80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性。通過重組類似物和天然存在的AMPA受體之間的類似物比較來定義氨基酸同一性。通過使沿著序列長度的共有氨基酸數(shù)目最大化來排列兩個氨基酸序列；在構成序列排列時容許在任一或兩個序列中的缺口以便使共有氨基酸的數(shù)目最大化。氨基酸同一性的百分比是下列兩個數(shù)目中的較高值(1)兩個多肽在序列排列中共有的氨基酸的數(shù)目，除以GluR1類似物類似物或其片段中的氨基酸數(shù)目，乘以100，或(2)兩個多肽在序列排列中共有的氨基酸的數(shù)目，除以天然存在的AMPA受體或其片段中的氨基酸數(shù)目，乘以100。
GluR1衍生物和GluR1片段的衍生物在本發(fā)明中也是有用的，并且包括天然存在的AMPA和在一個或多個組成氨基酸被化學或酶促衍生化的AMPA受體類似物及其片段，其中包括側鏈修飾、主鏈修飾和N-和C-末端修飾，例如乙?；⒘u基化、甲基化、酰胺化、磷酸化或糖基化。該術語也包括GluR1鹽，例如鋅GluR1和銨GluR1。
“直接”測量蛋白質或肽的意義是指在生物樣品中測量該蛋白質或肽本身，這與該蛋白質或肽，例如該蛋白質或肽的抗原片段、類似物或衍生物、或該蛋白質或肽的抗體的其它間接測量相對照。
“抗原”是激發(fā)免疫應答的蛋白質或肽。
術語“抗體”和“免疫球蛋白”同義，并且包括天然存在的人抗體、多克隆抗體和單克隆抗體。術語“抗體”是指包括天然的抗體和抗體的生物學上活化和合成的衍生物，例如Fab′、F(ab’)2或Fv，以及單結構域和單鏈的抗體?？贵w的生物學上活化的衍生物保持結合抗原的能力。
術語“免疫測定”是通過利用抗原和抗體間的免疫反應直接或間接檢測生物液體中的蛋白質或肽的實驗室方法。
就測量GluR1抗體的免疫測定而言在此使用術語“校準物”是指包含已知量的GluR1抗體并且用于定量未知生物液體中抗體濃度的校準曲線的GluR1抗體溶液。
就測量GluR1抗體的免疫測定而言在此使用術語“標準物”是指分離和純化自人生物液體的合適數(shù)量形式的GluR1抗體溶液以控制包含在本發(fā)明免疫測定試劑盒中的反應劑的質量。
關于測量直接在生物液體中的GluR1肽或片段的免疫測定而在此使用的“陰性對照”是指合適數(shù)量形式的GluR1合成肽或其片段，以用作來自健康個體的生物液體中GluR1濃度的指示物。
關于測量直接在生物液體中的GluR1肽或片段的免疫測定而在此使用的“陽性對照”是指合適數(shù)量形式的GluR1合成肽或其片段，以用作來自有癲癇突發(fā)性放電的個體的生物液體中GluR1濃度的指示物。
一般討論本發(fā)明獲得自腦中AMPA受體或GluR1表達的遺傳或偶然增加可與突發(fā)性的大腦放電有關以診斷腦相關的癲癇發(fā)作、非腦相關的癲癇發(fā)作和精神性相關癲癇發(fā)作，以及區(qū)別起因于突發(fā)性放電和不起因于突發(fā)性放電的腦相關癲癇發(fā)作的實現(xiàn)。在腦中異常表達的重組GluR1受體被快速代謝，隨后穿透血腦屏障，這些代謝破壞產(chǎn)品進入循環(huán)系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)識別這些肽和蛋白質片段為外來的抗原并且通過產(chǎn)生針對它們的抗體而發(fā)生應答。當診斷突發(fā)性的大腦放電和癲癇時，個體中這些腦生物標志物的快速評估可大大地增加醫(yī)師的信心，并且顯著提高腦相關癲癇發(fā)作的診斷可靠性以及追蹤可施用的抗驚厥劑治療。該數(shù)據(jù)可獨立于其他診斷策略進行使用，但優(yōu)選形成使用常規(guī)診斷技術的廣泛診斷策略的不可分割的部分。
從GluR1生物標志物獲得的數(shù)據(jù)，特別是與EEG或腦掃描數(shù)據(jù)結合的數(shù)據(jù)還可用于監(jiān)測治療方式的效力。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，它們的GluR1肽和抗體提供神經(jīng)毒性的實時證據(jù)，并且循環(huán)GluR1肽或抗體水平的降低與神經(jīng)毒機制中的降低一致。通過利用快速實驗室技術，例如乳膠凝聚或側向流動在合適的間隔獲得數(shù)據(jù)，就能夠監(jiān)測應答該抗驚厥劑治療方法的急性癲癇發(fā)作的進展。
一般優(yōu)選如在此更詳細論述的免疫測定技術用于測量本發(fā)明的蛋白質或肽，盡管其他的分析技術也是本領域技術人員已知的可利用技術，例如HPLC。優(yōu)選GluR1亞基及其抗原片段的氨基酸序列如SEQID NO 5和6所述，并且這些序列的任何片段、類似物或衍生物可用于直接檢測該受體的方法，只要保持足夠的抗原性。然而，當利用免疫測定時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗原決定簇集中在GluR1、GluR2、GluR3和GluR4受體亞基的N-末端結構域，并且將使用針對其N-末端結構域和片段產(chǎn)生的抗體來獲得最佳的試驗結果。本發(fā)明人已經(jīng)測序了這些受體的N-末端結構域的氨基酸鏈，并且分別表明為如在本文結尾處SEQ IDNOS.1、2、3和4的序列所述。
可使用常規(guī)的方法來制備抗體。例如，通過利用GluR1蛋白質的肽，利用標準方法產(chǎn)生多克隆的抗血清或單克隆抗體?？捎迷诓溉閯游镏幸l(fā)抗體反應的免疫原形式的肽(優(yōu)選GluR1受體、GluR1受體的抗原決定簇、或其類似物或衍生物)免疫哺乳動物(例如，小鼠、倉鼠或兔)。賦予肽免疫原性的技術包括連接至載體或本領域已知的其他技術。例如，可在存在佐劑時施用該肽?？赏ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)測免疫接種的進展。可伴隨作為評估抗體水平的抗原的免疫原來使用標準的ELISA或其他的免疫測定方法。免疫接種后，可施用抗血清，如果需要，可施用分離自血清的多克隆抗體。
為了生產(chǎn)單克隆抗體，可從免疫動物收獲抗體產(chǎn)生細胞(淋巴細胞)，并通過標準的體細胞融合方法與骨髓瘤細胞融合，來使這些細胞永生而產(chǎn)生雜交瘤細胞。這種技術在本領域中眾所周知，(例如，最初由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(Nature256，495-497(1975))以及其他的技術，例如人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，Immunol.Today4，72(1983))、生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等人Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，p77-96)、和篩選組合的抗體文庫(Huse等人，Science246，1275(1989))?？擅庖呋瘜W地篩選雜交瘤細胞來產(chǎn)生特異地與該肽起反應的抗體并且可分離該單克隆抗體。因此，本發(fā)明也預期分泌具有特異于在此所描述的GluR1蛋白質或其片段的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
待測試所述受體或片段的生物樣品可源自于血液、尿、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、汗液或腦組織。在優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品是血樣。在更優(yōu)選的實施方案中，該生物樣品是稀釋至大約1∶2到大約1∶32(v∶v)比例的血樣。
本發(fā)明也涉及用于測量重組GluR1(GluR1)肽或其片段水平的間接方法。因此，分析技術可用于評估GluR1肽或其片段的間接測量值，例如特異于該重組肽的抗體、或編碼這種肽的cDNA。在一個實施方案中，同時測量GluR1肽和抗體以獲得癲癇發(fā)作發(fā)病可能性的讀數(shù)。高于50或100pg/mL的GluR1濃度(在嬰兒中高于50pg/mL)，特別是當結合GluR1抗體濃度，男子高于1.5ng/ml，女子高于1.8ng/ml，兒童高于1.0ng/ml時，明顯地預示了突發(fā)性大腦放電和癲癇的發(fā)生，以及特別當通過EEG測量在經(jīng)受突發(fā)性波峰的患者中觀察到時，一般調整抗驚厥的治療。
在最近過去的七年期間，對超過2300名患者的血清樣品進行基于GluR1免疫吸附抗體的建議的血液檢查，該診斷如下癲癇(1650)、腦突發(fā)性活動，包括急性缺血性中風(187)、帕金森病(148)、精神分裂癥(躁狂抑郁癥，循環(huán)性精神病)(147)、阿爾茨海默氏病(44)、濫用藥物(嗎啡、柯卡因、大麻)(117)，以及2150名健康個體，包括交叉分析。
治療方法當與直接針對癲癇發(fā)作的治療方法連接起來使用時，本發(fā)明的診斷方法是特別有用的。當開始抗驚厥治療，減少或停止該治療或考慮神經(jīng)外科術時，該方法是有用的。該方法優(yōu)選可與附加的診斷方法，例如EEG一起進行。
因此，例如可利用組合的EEG和GluR1監(jiān)測診斷批準神經(jīng)外科術的難治癲癇。神經(jīng)外科術可例如根據(jù)突發(fā)性波峰的存在和未能應答一種或多種抗驚厥藥物服法的異常高分布濃度的GluR1或其片段而被批準。
可根據(jù)給定藥物服法減少GluR1水平，或減少該水平至基于群體標準的指定標準以下的能力來類似地評估對變化抗驚厥藥物，或增加處方藥物劑量的需要。優(yōu)選的指定標準對于成人是100、75或50pg/ml的GluR1片段，和/或2.0、1.8、1.5或1.0ng/ml的GluR1抗體，而對于兒童是75、50或35pg/ml的GluR1片段，和/或1.5、1.0或0.8ng/ml的GluR1抗體。
在另一個實施方案中，與停止或減少抗驚厥劑治療一起實施本發(fā)明的方法。根據(jù)停止或減少檢測GluR1水平，如果GluR1水平增加或增至高于上述指定標準則恢復所述的治療。
本發(fā)明的新試劑盒在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，例如突發(fā)性大腦放電和癲癇的試劑盒。重組GluR1抗體或抗原可根據(jù)是否正在測量抗體或GluR1而被合并入免疫測定診斷試劑盒。試劑盒可包括包含抗原或抗體制品的組合物。優(yōu)選提供合適數(shù)量形式的抗體和抗原制品，其中給出的抗原和/或抗體濃度便于校準定量應用。
該試劑盒也可包括免疫檢測反應劑或用于檢測視情況而定所提供的抗原和/或抗體與診斷樣品之間特異免疫反應的標記。合適的檢測反應劑是本領域眾所周知的，例如放射性的、酶促的或相反的顯色試劑，其一般用于與抗原和/或抗體締合，或與對第一抗體具有特異性的第二抗體締合。因此，通過檢測或定量該標記來檢測或定量該反應。適于與本發(fā)明的新方法相關的應用的免疫反應劑和過程一般是本領域已知的。
該反應劑也可包括輔助試劑，例如緩沖劑和蛋白質穩(wěn)定劑，例如多糖等。必要時該診斷試劑盒可進一步包括用于減少測試中背景干擾的試劑，增加信號的試劑、實施測試的儀器、標定曲線和圖表、校準曲線和圖表等。
在更特別的方面，本發(fā)明涉及包含GluR1抗體或合成肽GluR1的以ELISA或乳膠凝聚形式存在的免疫吸附劑。因此，在一個實施方案中，該試劑盒包含包括GluR1或其片段或GluR1抗體以及人或合成的校準器的微量滴定板。該反應劑也可包括輔助試劑，例如緩沖劑和蛋白質穩(wěn)定劑，例如多糖等。必要時該診斷試劑盒可進一步包括信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其他成員，該系統(tǒng)中可檢測組是成員(例如，酶和非酶底物)、用于減少測試中背景干擾的試劑、增加信號的試劑、實施測試的儀器、校準和標準化信息或指令等。
一般通過從樣品已知值的測量產(chǎn)生標準曲線來實現(xiàn)校準。然后測量未知分析物水平的樣品并與利用數(shù)學導出關系式的標準曲線相比?？筛鶕?jù)測定的穩(wěn)定性和可重復性在樣品標本分析前或同時確定標準曲線。在一個實施方案中，用試劑盒實施本發(fā)明，該試劑盒包括校準物或對照，針對SEQ ID NO5或6的GluR1片段產(chǎn)生的抗體、或其免疫原性片段、同系物或衍生物。在另一實施方案中，針對包括純化自人血液的免疫球蛋白G的特異部分的抗體標準物制造該試劑盒，任選地特異結合GluR1肽的95％純度的免疫球蛋白與其他的谷氨酸受體片段或其他的神經(jīng)受體(例如D1、D2、D3、NMDAR、麻醉劑等)沒有顯著的交叉反應。
乳膠凝聚也已經(jīng)開發(fā)了乳膠凝聚技術或側向流動形式，其顯著地增加通過本發(fā)明方法獲得診斷的速度，并由此提高診斷的可靠性。乳膠凝聚測定在Beltz，G.A.等人，in Molecular ProbesTechniques and MedicalApplications，A.Albertini等人，eds.，Raven Press，New York，1989中已經(jīng)有描述，其在此引入作為參考。在乳膠凝聚測定中，針對特定生物標記物產(chǎn)生的抗體被固定在乳膠顆粒上。將一滴乳膠顆粒加入適當稀釋的待檢測血清并通過卡片的溫和搖擺混合。對于缺乏足夠水平的生物標記物的樣品，乳膠顆粒保持在懸浮液中并且保持平滑的、乳狀的外觀。然而，如果存在與抗體反應的生物標記物，該乳膠顆粒凝塊成為可見的可檢測的聚集物。
凝聚作用測定也可用于檢測生物標記物，其中相應的抗體被固定在除了乳膠珠的合適顆粒上，例如明膠、紅細胞、尼龍、脂質體、金顆粒等。測定中抗體的存在導致類似于沉淀反應的凝聚，然后可通過例如比濁法、混濁度、紅外光譜法、目測檢查、比色法等檢測。
在此一般使用的術語乳膠凝聚是指基于可檢測凝聚形成的任何方法，并且不限于使用乳膠作為免疫吸附劑底物。雖然用于凝聚的優(yōu)選底物是乳膠基底的，例如聚苯乙烯和聚丙烯，特別是聚苯乙烯，其他眾所周知的底物包括由玻璃、紙、葡聚糖和尼龍形成的珠子。該固定的抗體可以是通過例如借助于酰胺或酯鍵、離子吸引的技術或通過吸附共價地、離子地或物理地結合固相免疫吸附劑。本領域的技術人員已知結合抗體的許多其他的合適載體，或將能夠利用常規(guī)實驗確定這種載體。
可改進該技術用于檢測GluR1受體、抗體、或針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥的任何其他的合適生物標記物。利用該乳膠凝聚技術，能夠提供對患有癲癇的患者的實時生化診斷和監(jiān)測(大約10分鐘內)，并且由此顯著改善后續(xù)的抗驚厥劑治療。這是令人驚訝的，因為這些生物標記物是天然存在的，并且與最初開發(fā)乳膠凝聚方法來用于病毒相反，顯示與其相應抗體結合的強度低很多。
因此在一個實施方案中，測量GluR1受體、其片段或其他生物標記物的方法是通過乳膠凝聚，包括(i)使生物樣品接觸包括GluR1抗體或GluR1的抗原決定簇的凝聚載體足夠的時間段，并且處于促進凝聚的條件下；和(ii)讀取從該凝聚產(chǎn)生的信號；其中檢測信號的數(shù)值與存在于樣品中的生物標記物的滴定度相關。
該反應優(yōu)選相對于黑暗背景目視讀取足夠的時間段。該該方法優(yōu)選在大約30分鐘或更少時間內產(chǎn)生臨床有用的讀數(shù)。實驗上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有大約0.25至大約0.4微米平均直徑的乳膠珠在本發(fā)明的實施中是特別優(yōu)選的。一般可通過將目標生物標記物的抗體加入包含1％濃度(按重量計算)乳膠珠的載體溶液直到載體溶液中該抗體的濃度達到大約2mg/ml，并提供該成分足夠的時間共價連接，一般為在存在連接試劑，例如戊二醛下大約1小時來制備乳膠珠。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供乳膠凝聚試劑盒，其包括(1)包括GluR1或其片段或GluR1抗體的乳膠珠，和(2)陽性和陰性對照。
本發(fā)明的新組合物本發(fā)明的方法依賴一系列其本身形成本發(fā)明一部分的新組合物。因此，在一系列的實施方案中，本發(fā)明提供AMPA受體的GluR1、GluR2、GluR3和GluR4亞基的重組多肽片段，包括1.GluR1的N-末端結構域，SEQ ID NO.1；2.GluR2的N-末端結構域，SEQ ID NO.2；3.GluR3的N-末端結構域，SEQ ID NO.3；4.GluR4的N-末端結構域，SEQ ID NO.4；5.重組GluR1，SEQ ID NO.5和6，或其抗原片段、類似物或衍生物。在另一系列的實施方案中，本發(fā)明提供共價連接至不同抗原決定簇，例如人血清白蛋白的任何上述多肽。在另一系列的實施方案中，本發(fā)明提供連接至上述討論到的任何免疫吸附劑材料的任何上述多肽。該免疫吸附劑可以是用于乳膠凝聚的珠子形式，在上述討論到的尺寸范圍中，或是用于常規(guī)免疫測定分析的合成平板形式。該多肽可利用任何傳統(tǒng)方式的鍵，包括共價鍵、離子鍵和吸附來連接至免疫吸附劑。
在另一系列的實施方案中，本發(fā)明涉及特異于和/或針對上述多肽，包括與獨特的抗原決定簇連接的上述多肽產(chǎn)生的新的單克隆和多克隆抗體。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供針對任何上述肽或多肽或其抗原片段、類似物或衍生物的非人抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供可連接這種抗體的免疫吸附劑。
序列表的簡述論及下列序列表，將更好地理解本發(fā)明的特性、方面和優(yōu)點，其中在該序列中，所述氨基酸位置編號反映了本文中自始至終所使用的編號。
SEQ ID NO1.顯示GluR1受體亞基的成熟N-末端結構域的氨基酸序列，如下序列表肽智人谷氨酸受體離子移變的，GluR1Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887557-7561(1991)19 AN FPNNIQIGGL FPNQQSQEHA AFRFALSQLTEPPKLLPQID 6061 IVNISDSFEM TYRFCSQFSK GVYAIFGFYE RRTVNMLTSF CGALHVCFITPSFPVDTSNQ 120121 FVLQLRPELQ DALISIIDHY KWQKFVYIYD ADRGLSVLQKVLDTAAEKNW QVTAVNILTT 180181 TEEGYRMLFQ DLEKKKERLV VVDCESERLN AILGQIIKLE KNGIGYHYILANLGFMDIDL 240241 NKFKESGANV TGFQLVNYTD TIPAKIMQQW KNSDARDHTRVDWKRPKYTS ALTYDGVKVM 300301 AEAFQSLRRQ RIDISRRGNA GDCLANPAVP WGQGIDIQRA LQQVRFEGLTGNVQFNEKGR 360361 RTNYTLHVIE MKHDSIRKIG YWNEDDKFVP AATDAQAGGDNSSVQNRTYI VTTILEDPYV 420421 MLKKNANQFE GNDRYEGYCV ELAAEIAKHV GYSYRLEIVSDGKYGARDPD TKAWNGMVGE 480481 LVYGRADVAV APLTITLVRE EVIDFSKPFM SLGISIMIKK PQKSKPGVFSFLDPLASEQ ID NO2.顯示GluR2亞基的成熟N-末端結構域的氨基酸序列，如下SEQ ID NO2肽智人谷氨酸受體離子移變的，GluR2
NeuroReport 5441-444(1994)22 VSSNSIQIG GLFPRGADQE YSAFRVGMVQFSTSEFRLTP 6061 HIDNLEVANS FAVTNAFCSQ FSRGVYAIFG FYDKKSVNTI TSFCGTLHVSFITPSFPTDG 120121 THPFVIQMRP DLKGALLSLI EYYQWDKFAY LYDSDRGLSTLQAVLDSAAE KKWQVTAINV 180181 GNINNDKKDE MYRSLFQDLE LKKERRVILD CERDKVNDIV DQVITIGKHVKGYHYIIANL 240241 GFTDGDLLKI QFGGANVSGF QIVDYDDSLV SKFIERWSTL EEKEYPGAHTTTIKYTSALT 300301 YDAVQVMTEA FRNLRKQRIE ISRRGNAGDC LANPAVPWGQGVEIERALKQ VQVEGLSGNI 360361 KFDQNGKRIN YTINIMELKT NGPRKIGYWS EVDKMVVTLTELPSGNDTSG LENKTVVVTT 420421 ILESPYVMMK KNHEMLEGNE RYEGYCVDLA AEIAKHCGFKYKLTIVGDGK YGARDADTKI 480481 WNGMSEQ ID NO3；顯示GluR3亞基的成熟N-末端結構域的氨基酸序列，如下SEQ ID NO3肽智人谷氨酸受體離子移變的，GluR3Biochim.Biophys.Acta 1219563-566(1994)
29 GF PNTISIGGLF MRNTVQEHSAFRFAVQLYNT 6061 NQNTTEKPFH LNYHVDHLDS SNSFSVTNAF CSQFSRGVYA IFGFYDQMSMNTLTSFCGAL 120121 HTSFVTPSFP TDADVQFVIQ MRPALKGAIL SLLGHYKWEK FVYLYDTERGFSILQAIMEA 180181 AVQNNWQVTA RSVGNIKDVQ EFRRIIEEMD RRQEKRYLID CEVERINTILEQVVILGKHS 240241 RGYHYMLANL GFTDILLERV MHGGANITGF QIVNNENPMVQQFIQRWVRL DEREFPEAKN 300301 APLKYTSALT HDAILVIAEA FRYLRRQRVD VSRRGSAGDCLANPAVPWSQ GIDIERALKM 360361 VQVQGMTGNI QFDTYGRRTN YTIDVYEMKV SGSRKAGYWNEYERFVPFSD QQISNDSASS 420421 ENRTIVVTTI LESPYVMYKK NHEQLGNER YEGYCVDLAY EIAKHVRIKYKLSIVGDGKY 480481 GARDPETKIW NGMVGELVYG RADIAVAPLT ITLVREEVID FSKPLMSLGISIMIKKPQKS 540541 KPGVFSFLDP LASEQ ID NO4；顯示GluR4亞基的成熟N-末端結構域的氨基酸序列，如下SEQ ID NO4肽智人谷氨酸受體離子移變的，GluR4Recept.Channels321-31(1995)
21 GAFPSSVQIG GLFIRNTDQE YTAFRLAIFLHNTAPNASEA 6061 PFNLVPHVDN IETANSFAVT NAFCSQYSRG VFAIFGLYDK RSVHTLTSFCSALHISLITP 120121 SFPTEGESQF VLQLRPSLRG ALLSLLDHYE WNCFVFLYDT DRGYSILQAIMEKAGQNGWH 180181 VSAICVENFN DVSYRQLLEE LDRRQEKKFV IDCEIERLQN ILEQIVSVGKHVKGYHYILA 240241 NLGFKDISLE RFIHGGANVT GFQLVDFNTP MVTKLMDRWKKLDQREYPGS ETPPKYTSAL 300301 TYDGVLVMAE TFRSLRRQKI DISRRGKSGD CLANPAAPWGQGIDMERTLK QVRIQGLTGN 360361 VQFDHYGRRVNYTMDVFELK STGPRKVGYW NDMDKLVLIQDVPTLGNDTA AIENRTVVVT 420421 TIMESPYVMY KKNHEMFEGN DKYEGYCVDL ASEIAKHIGI KYKIAIVPDGKYGARDADTK 480481 IWNGMVGELV YGKAEIAIAP LTITLVREEV IDFSKPFMSL GISIMIKKPQKSKPGVFSFL 540541 DPLAYESEQ ID NO5；顯示重組GluR1的氨基酸序列，如下SEQ ID NO5肽重組GluR1LANLGFMDIDLNSGAVYGRAEIAGYCVSEQ ID NO6；顯示重組GluR1，另一個這種肽的氨基酸序列(來源于GluR1序列的27個氨基酸和用于附著至載體蛋白的N-末端Cys)，如下SEQ ID NO6肽人工序列CN LANLGFMDIDLNSGAVYGRAEIAGYCV實施例實施例1-兒童中癲癇的臨床評估從1995年1月至1999年12月在莫斯科和圣彼得堡(俄羅斯)的4個兒童癲癇中心進行這個隨機和雙盲試驗(blinded test)。雖然我們的研究不嚴格基于種群，我們征募個體以獲得代表該國家西部中癲癇兒童特征的群體。
適于該試驗的患者是至少4個月-14歲大，并且已經(jīng)通過四個兒科癲癇專家，根據(jù)國際癲癇聯(lián)盟(ILAE)的原則被診斷患有癲癇綜合征和根據(jù)診斷時可得到的全部信息而分類的癲癇發(fā)作。這些包括相關的局部和全身性的自發(fā)綜合征(例如，良性羅朗多(rolandic)的和兒童失神癲癇)，以及起因不明有征兆的全身性綜合征。該有征兆的和起因不明的相關局部化癲癇表現(xiàn)了定義為導致和局部化至已知程度的廣譜綜合征。這些組的結果是混合的。
從綜合征單獨分類病因學，雖然其部分地取決于該綜合征。遠離癥狀是指存在與癲癇風險增加有關的基本神經(jīng)病學狀況或損傷(例如，細菌性腦膜炎、中風、腦性麻痹的病史)。自發(fā)的綜合征通常歸因于自發(fā)的病源學。偶而地，神經(jīng)病學異常地與自發(fā)的綜合征同時存在(例如，伴隨有智力遲鈍的兒童失神癲癇)，在這種情況下分類病源學作為遠離癥狀而不管自發(fā)的綜合征。在分類病源學中使用神經(jīng)成像研究的結果。起因不明的病源學是指不符合自發(fā)綜合征標準的癲癇，并且對于其沒有可鑒別的顯著基本神經(jīng)異?；驙顩r。換句話說這種個體似乎是神經(jīng)病學正常的。
最初的癲癇發(fā)作頻率被定義為從癲癇診斷以來無謂癲癇發(fā)作總數(shù)除以第一次無謂癲癇發(fā)作和正式診斷日期之間時間的比率。癲癇發(fā)作頻率表現(xiàn)為每日1次癲癇發(fā)作至每年1-2次癲癇發(fā)作。隨后的呼叫和GluR1 aAb水平的觀測對比癲癇發(fā)作發(fā)生進行7天和6個月(任選的)。
癲癇的確定診斷是根據(jù)兩個見證且很好描述的癲癇發(fā)作發(fā)病或一個見證且很好描述的癲癇發(fā)作加具有符合局部化相關癲癇的焦點異常證明的EEG示蹤或MRI/CT掃描。
從該試驗排除非癲癇發(fā)作(例如，假癲癇發(fā)作)或可治療病因癲癇發(fā)作；進行性或退化性病癥；需要藥物、自殺企圖的精神病學或情緒病癥的患者。
患有非癲癇的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的兒童和健康個體表示為年齡和性別匹配組而在其中用作對照。
根據(jù)優(yōu)良臨床實踐的國際規(guī)則進行該試驗。在開始試驗相關步驟前，從每位患者的父母或法定監(jiān)護人獲得書面通知的首肯。
使用卡方和t檢驗進行雙變量比較。必要時使用對數(shù)變換來標準化高度偏斜分布。對于一些連續(xù)變量，構建類別以便于數(shù)據(jù)的表述和假定線性的檢驗。
該研究中總共征募了605名兒童(年齡為4個月-14歲，302名女孩和303名男孩)。發(fā)病的起始年齡是1-2歲。中值后續(xù)是1.0年。
在該臨床研究中，健康兒童和患有非癲癇神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的兒童血液樣品中GluR1 aAb濃度取決于年齡并且隨著兒童從新生兒到青少年的成長而穩(wěn)定增加(

圖1)。這可能是由于成熟期間免疫系統(tǒng)發(fā)育和天然循環(huán)自身抗體的增加。對于健康的對照和患有非癲癇病癥的兒童，GluR1 aAb的數(shù)值其差別無關重要(圖8)。在獨立的、年齡和性別匹配組中GluR1 aAb平均值的比較證明健康兒童和患有其他神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的患者的aAb值屬于平均值為0.9-1.1ng/mL的相同分布。
來自患有癲癇和癲癇綜合征患者的血液標本中GluR1 aAb濃度的檢測表明與對照相比較來自同一年齡組的全部兒童獨立地具有顯著升高數(shù)量的GluR1 aAb(圖9)。當大多數(shù)具有第一次無謂癲癇發(fā)作并且被診斷為患有癲癇或癲癇綜合征時，對于年齡為4個月-3歲的兒童，自身抗體水平是更高的。年齡為3-14歲的小兒患者證明與更小年齡的患者相比較GluR1 aAb水平降低(圖2)。
對于具有全身性癲癇發(fā)作類型的患者，與局部癲癇發(fā)作的患者相比較，GluR1 aAb的水平顯著是更高的(圖3)。在全部的研究中心中證明了EEG上波峰活動和GluR1 aAb濃度的顯著相關性(Spearman′s系數(shù)0.89，p＜0.01)。已經(jīng)證實兒童中GluR1 aAb的測量具有兩個潛在用途1)癲癇風險評估；和2)幫助更好地臨床診斷具有′癲癇樣′癥狀的患者。通過該測試分辨患有癲癇和癲癇綜合征的高預示值來支持這個前提(在1.0ng/mL界限為84％)。
GluR1 aAb的臨床預先確定界限容許我們根據(jù)癲癇發(fā)作頻率區(qū)分患者。醫(yī)院許可的1個月內對41位癲癇患者中GluR1 aAb的監(jiān)測表明每日或每星期癲癇發(fā)作1次頻率的GluR1 aAb水平(2.6-2.7ng/mL)比每月1次癲癇發(fā)作頻率的(2.2ng/mL)高。對于來自年齡和癲癇發(fā)作類型的癲癇和癲癇綜合征患者該趨勢獨立地保持相同。
已經(jīng)建立了通過神經(jīng)放射學家解釋的、從CT和MRI掃描獲得的GluR1 aAb數(shù)據(jù)與為神經(jīng)外科學而確定患有難治療癲癇發(fā)作的兒童的盲試驗結果的相關性。檢測到具有右半球局部化癲癇焦點的患者的GluR1 aAb濃度最大(Iatsuk等人，Zh.Nevropat.Psikhiat.Im.SSKorsakova.1999，9934-6)。疾病的病源學對GluR1 aAb水平的增加表觀有影響產(chǎn)前創(chuàng)傷(100％病例)、細菌性腦膜炎病史(85.8％病例)和腫瘤(55.6％病例)。
19名具有混合類型癲癇發(fā)作的兒童中抗癲癇治療、癲癇發(fā)作頻率、EEG和GluR1 aAb變化的追蹤研究(6個月)產(chǎn)生了檢測參數(shù)的良好相關性。84％的病例中，患者狀態(tài)(減少或沒有癲癇發(fā)作)的改善伴有GluR1下調達到對照水平。在這個研究中，EEG數(shù)據(jù)與GluR1aAb值的相關性是大約95％。
實施例2-成人癲癇的臨床評估從1994年2月至1997年12月在圣彼得堡(俄羅斯)的精神病學和神經(jīng)病學V.M Bechterev′s研究所的癲癇科和俄羅斯軍醫(yī)學院的神經(jīng)病學科進行雙盲試驗。由于癲癇發(fā)作頻率增加而被許可進入上述機構醫(yī)院的年齡為18至40歲的237位連續(xù)癲癇患者(女130，男107)被考慮參加該研究。根據(jù)ILAE原則分類癲癇，該方案中隨后的包含標準考慮病癥持續(xù)時間為1年至20年；癲癇發(fā)作頻率為每日1次到每年1次；癲癇發(fā)作類型局部簡單的、局部復合的、全身性失神、全身性強直-陣攣的不同病源學(例如，細菌性腦膜炎病史、中風、腦性麻痹、產(chǎn)前創(chuàng)傷等)。癲癇的確定診斷是根據(jù)很好描述的癲癇發(fā)作病史加具有符合局部化相關癲癇的焦點異常證明的EEG或MRI/CT掃描。從試驗中排除進行性或退化病癥；需要藥物、自殺企圖的精神病學或情緒病癥的患者。
具有非癲癇神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(沒有癲癇發(fā)作、腰背痛、arachnoidid的腦外傷)的患者(n＝193，女79，男114)、非癲癇發(fā)作((例如，假癲癇發(fā)作)和健康的個體(n＝93)表示為對癲癇患者用作對照的年齡和性別匹配組。
通過使用PA-ELISA試驗測量的健康患者中GluR1 aAb的水平是1.5±0.3ng/ml，而對于具有非癲癇神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(NED)的患者是1.7±0.2ng/ml(圖4)。在獨立的、年齡和性別的匹配組中GluR1 aAb平均值的比較證明對照和患有非癲癇神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的患者的aAb值屬于相同的分布?；加邪d癇的GluR1 aAb-陽性患者具有3.02±0.4ng/L(范圍2.1-4.1)的平均濃度。顯示了全部對照組以及癲癇患者中女子(1.8±0.1ng/mL)和男子(1.5±0.1ng/mL)的GluR1 aAb的不同對照值(圖5)。
我們的研究證明了在EEG上具有不穩(wěn)定波峰活動的健康志愿者中谷氨酸結合蛋白的自身抗體數(shù)量增加(25％的試驗案例)。這些結果表明谷氨酸受體兩個片段的自身抗體的水平升高可能是通過EEG沒有任何神經(jīng)病學征兆指示的腦血管異常的血液標記。此外，在一些癲癇和中風患者的病例(32％)中顯示了NMDA和AMPA受體的兩個自身抗體的交叉反應(32％)(Dambinova等人J.Neurol.Sci.1997，15293-7)。
證明了疾病持續(xù)時間和GluR1 aAb值之間的負相關(Odinak等人，Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova.1996，9645-48)。癲癇持續(xù)時間少于5年的患者比具有更長疾病時間的患者具有更高水平的GluR1 aAb。
圖6中描繪了不同癲癇發(fā)作類型和頻率的患者中GluR1 aAb值的研究。在多于86％的病例中，在每日有全身性強直-陣攣和部分復合類型癲癇發(fā)作的患者中記錄到最高的GluR1濃度。在少有癲癇發(fā)作，少于每半年1次的患者中，在多于80％的病例中檢測到增至高于界限的aAb值(對于所有的成人為1.5±0.3ng/mL)(Odinak等人ZhNevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova.1996，9645-48；Gromov等人，Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova 1997，9746-9)。不出所料，癲癇發(fā)作頻率單單與GluR1 aAb濃度的相關性不高Spearman′s系數(shù)0.34(p＜0.01)。
來自GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA試驗與EEG上波峰活動外觀的結果比較容許在84％-95％案例的范圍內診斷癲癇，并且支持波峰活動的癲癇特征(Odinak等人，Zh Nevropatol Psikhiatr Im S SKorsakova.1996.9645-48)。
與J.Majkowsky博士(Clinic of Epilepsy，Warsaw，Poland，1994-1995)和P.Wolf博士(Epilepsy Center，Bielefield，Germany，1995-1996)合作進行癲癇發(fā)作發(fā)生之前和之后時間過程的研究。這證明了癲癇發(fā)作表現(xiàn)之前GluR1 aAb的突然增加并且aAb值在隨后的日子期間保持高水平。通過每日EEG說明的波峰活動增加來支持這些結果。
實施例3--GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA試驗進行用于檢測GluR1抗體的GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA試劑盒包括(i)GluR1肽或GluR1抗體的免疫吸附劑；和(ii)包括附著于信號形成化合物的第二抗體的指示物反應劑。該測試旨在用于評估經(jīng)歷突發(fā)性大腦放電和癲癇的個體。
通過利用校準物和來自健康個體的血清標本，在存在和缺少校準物時，控制被GluR1肽或GluR1抗體覆蓋的微平板的質量(Gromovaetal.，Neirokhimiia.1997，123-7)。在各種儲藏條件(溫度、包裝類型、貯存期)進行測定內變異性、批間偏差和ELISA反應對抗體或GluR1校準物的穩(wěn)定性的評估。研究反應的的動力學以達到可變的最佳特性。然后評估根據(jù)已被批準的人研究方案收集的、來自患有神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(中風、帕金森氏和阿爾茨海默氏疾病、麻痹和多發(fā)性硬化)、感染疾病(TB、腦炎、腦膜炎)、非感染病癥(苯丙酮酸尿癥、狼瘡紅細胞增多、糖尿病、濫用藥物)的患者和健康志愿者的血液血清或血漿樣品中GluR1肽或GluR1抗體的濃度。
線性度將來自四個明顯健康個體的血液標本用GluR1抗體強化至最后濃度為200ng/mL(血清)或用GluR肽強化至最后濃度為2.0ng/mL(血漿)。將各個強化樣本用未強化的樣本按重量分析地稀釋以在整個GRACE-神經(jīng)測試-癲癇測定的范圍中獲得GluR1抗體或GluR1肽的值。對于未強化樣品中少量(對于抗體＜0.1ng/mL而對于肽＜10pg/ml)的內源GluR1抗體或GluR1肽進行校正。數(shù)據(jù)的線性回歸分析表明該測定對于GluR1抗體試驗具有0-2.5ng/mL和0-200pg/mL的線性范圍。
分析靈敏度通過在5天中分別使用4批反應劑來試驗零校準物20次而確定GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA的分析靈敏度或從零區(qū)分的最低可檢測濃度。GluR1抗體試驗分析靈敏度的平均95％置信界限小于0.05ng/mL(95％置信區(qū)間為0.01-0.06ng/mL)，而GluR1肽試驗小于5pg/mL(95％置信區(qū)間為0.2-4.9pg/mL)。
干擾物質加入包含GluR1抗體或GluR1肽的血清樣本的血紅蛋白(達到10,000mg/dL)和脂類(膽固醇達到1000mg/dL，以及甘油三酸酯達到1000mg/dL)或膽紅素(達到20mg/dL)不防礙GluR1抗體或GluR1肽的恢復。然而，只要有可能，應避免嚴重溶血的樣本。當樣品似乎是嚴重溶血的時，應獲得和測試另一個樣本(血清或血漿)。
分析特異性抗體評估來自μ-(MOR)或δ-鴉片樣物質受體(DOR)、谷氨酸受體(NR1、GluR4)和多巴胺受體(D2、D3、D4)或其特異抗體(IgG)的免疫活性肽的潛在交叉反應性和在GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA測定中下文表明濃度的干擾與GluR1抗體測量沒有顯著的干擾，也沒有任何顯著的測定交叉反應性。
實施例4--GRACE-神經(jīng)測試-癲癇試驗結果偏差使用ANOVA模型通過測試對照和在接近測定判斷點和貫穿標準曲線范圍具有增加濃度的相應分析物的人樣本庫確定日內和總的不精確性。該研究進行20天，每日試驗各個對照5次。
平均的測定內不精確性
實施例5.沒有癲癇的個體中GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA的期望值測定來自沒有癲癇的214名兒童(年齡為4個月-14歲，111名女孩和103名男孩)和286名個體(126名女子和160名男子)的血液樣本中循環(huán)GluR1肽和GluR1抗體的濃度。這個群體包括具有神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(沒有癲癇發(fā)作的腦外傷、腰背痛、arachnoidid、帕金森氏和阿爾茨海默氏疾病、假癲癇))、感染疾病(TB、腦炎、腦膜炎)、非感染病癥(苯丙酮酸尿癥、狼瘡紅細胞增多、糖尿病、濫用藥物)的個體和健康志愿者。與沒有癲癇發(fā)作的腦外傷、腰背痛、arachnoidid、苯丙酮酸尿癥、狼瘡紅細胞增多、濫用藥物、TB、腦炎和腦膜炎有關的GluR抗體濃度不存在統(tǒng)計上顯著的變化。沒有癲癇的個體中GluR1抗體濃度的描述統(tǒng)計學顯示在下列表格中。該值表示從臨床研究獲得的值。通過不同年齡的非癲癇群體中GluR1抗體濃度的95％置信界限來確定判斷閾。這些值轉化為該測試的綜合特異性對于GluR1抗體為大于89％，對于GluR1為大于92％，即在沒有癲癇的個體中小于10％的預期假陽性。
非癲癇群體中的GluR1抗體濃度(ng/mL)
非癲癇群體中的GluR1肽濃度(pg/mL)
通常根據(jù)EEG和臨床評估，只能部分地預測癲癇的診斷和進展。迄今為止仍然存在對血樣進行實驗室試驗的未滿足的診斷需要。GRACE-神經(jīng)測試-癲癇為這個需要給出了答案。推薦使用支持關于癲癇鑒別診斷的所有神經(jīng)病學考慮事項的這種血液檢查。已經(jīng)評估了GRACE-神經(jīng)測試-癲癇測定并且建議下列臨床指標用于兒童·腦相關癲癇發(fā)作和癲癇中的規(guī)律以增加診斷可靠性的程度·排除假癲癇和癲癇樣病癥。
血液中的參考范圍(Iatsuk等人Zh Nevropat Psikhiat.SSKorsakoVa 1999，9934-6)
已經(jīng)評估了GRACE-神經(jīng)測試-癲癇測定并且建議下列臨床指標用于成人·腦相關癲癇發(fā)作和癲癇中的規(guī)律以增加診斷可靠性的診斷·其他病癥后突發(fā)性大腦放電和癲癇的風險系數(shù)·腦相關癲癇發(fā)作的預后·治療后的后續(xù)措施和合適療法和劑量的調整血清中的參考范圍(Gromov等人Zh Nevropatol Psikhiatr Im SS Korsakova1997，9746-49)
實施例6.患有癲癇的個體中GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA的期望值從患有癲癇和癲癇綜合征的391名兒童(年齡為4個月-14歲，191名女孩和200名男孩)和237名個體(130名女子和107名男子)獲得血樣?；加邪d癇和癲癇綜合征的患者中GluR1 aAb濃度的描述統(tǒng)計學顯示在下列表格中。這些值表示從臨床研究獲得的值。
患有癲癇和癲癇綜合征的患者中的GluR1抗體濃度(ng/mL)
患有癲癇和癲癇綜合征的患者中GluR1肽的濃度(pg/mL)
實施例7.GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA的靈敏度和特異性通過GRACE-神經(jīng)測試-癲癇測定檢測GluR抗體來評估的全部兒童組的2乘2表格
總靈敏度330/391＝84％特異性204/214＝95％通過GRACE-神經(jīng)測試-LA測定檢測檢測GluR肽來評估的全部兒童組的2乘2表格
總靈敏度379/391＝97％特異性203/214＝95％通過GRACE-神經(jīng)測試-癲癇測定檢測GluR抗體來評估的全部成人組的2乘2表格
總靈敏度204/237＝86％特異性260/286＝91％通過GRACE-神經(jīng)測試-LA測定檢測GluR肽評估的全部成人組的2乘2表格
總靈敏度221/237＝93％特異性265/286＝93％實施例8.GRACE-神經(jīng)測試-癲癇ELISA結果的分析GluR1抗體界限對比臨床靈敏度和特異性的接收工作特性曲線(ROC)提供了＞0.95±0.0l的曲線下面積，并且對兒童(年齡＜14歲)的界限為1ng/mL，對男子為1.5ng/mL和對女子為1.8ng/mL。GluR1肽界限對臨床靈敏度和特異性的ROC提供了＞0.97±0.01的曲線下面積，并且對兒童(年齡＜3歲)界限為50pg/mL，對青少年和成人為100pg/mL。在下列表格中描述了對于各個年齡和性別組使用設定界限的GRACE-神經(jīng)測試-癲癇試驗的臨床靈敏度和特異性。
靈敏度和特異性對年齡&性別
臨床特異性測定來自沒有突發(fā)性大腦放電和癲癇的個體的血清樣品中GluR1抗體的存在?？偟奶禺愋詫Τ扇孙@示為91％，對兒童為95％。
臨床靈敏度評估隨機群體中癲癇患者的GluR1抗體測定的臨床靈敏度確定為84-85％。
通過比較來自7組選擇患者確定和未確定患有癲癇；患有意識喪失；昏倒/暈厥；偏頭痛；腦外傷和腦血管疾病的GluR1試驗結果確定癲癇測定的臨床靈敏度。
表格GluR1肽測定的臨床進行實施例9.GRACE-神經(jīng)測試-癲癇LA根據(jù)乳膠凝聚技術用于癲癇評估的GluR1肽的快速測定引導了診斷可靠性能力的改善。
GRACE-神經(jīng)測試-癲癇LA測定使用具有嵌入放大裝置的三聯(lián)凹玻片以可視地檢測反應，提供即刻的“是”或“否”回答。在這個測定中，將血漿樣品與偶聯(lián)于顯色乳膠粒子的抗體混合并在2和5分鐘之間指明凝聚作用。該反應發(fā)生在均相中，并且加以可視檢測抗原+乳膠-抗體→→→{乳膠-抗體←抗原}我們根據(jù)側向流動技術使用包含GluR1抗體的顯色乳膠粒子開發(fā)了GRACE-神經(jīng)測試-癲癇流動微陣列。該血液或血漿“重新構成”乳膠-反應劑并且將其轉運至檢測行。大多數(shù)情況下，進行夾層測定。該試驗是異質的測定；即反應在溶液和固相中發(fā)生。這個檢驗方法如下步驟1.將血液滴到側向流動設備的特異位點。
步驟2.血液重新構成顯色的乳膠反應劑。
步驟3.如果待討論的分析物是在血液中，則發(fā)生第一個反應抗原結合乳膠顆?！鷞抗原→抗體乳膠}-復合物上的抗體。
步驟4.平行于步驟3中的反應，發(fā)生至復合物{抗原→抗體-乳膠}與另一個抗體的檢測行的轉運。然后發(fā)生下列反應{抗原→抗體-乳膠}→→與第二抗體排列對準在檢測行這個復合物的濃度可以是相當高的，并且可通過視覺檢測(即，通過顏色)或通過裝置調節(jié)(熒光測定法)。由于顯色顆粒的濃度-方法(“捕捉原則”)分析靈敏度是很高的。健康人一般具有50pg/mL的GluR1肽濃度。
ELISA和LA形式的GRACE-神經(jīng)測試-癲癇的臨床試驗與臨床觀察和證明其值的EEG數(shù)據(jù)相結合。這可通過比較觀測患者組中預試和試后的癲癇可能性來非常深刻地加以顯示
*陽性概率比，LR＝靈敏度/1-特異性；**試后可能性達到同EEG數(shù)據(jù)相結合的癲癇發(fā)作表現(xiàn)的臨床觀察判定的預試可能性和根據(jù)http:∥www.med.nagoya-cu.ac.jp/psych.dir/graphical.htm；的GluR1自身抗體陽性測試的概率比(LR)；CI-置信區(qū)間乳膠凝聚試驗方法特別適于POC使用，因為在突發(fā)性大腦放電的極早階段GluR1肽水平升高，并因此提供神經(jīng)毒害事件的實時指標。此外，考慮到及時和適當?shù)慕槿肟稍谛∮?0分鐘內加工結果。
這個方法提供可簡單分析格式的可靠數(shù)據(jù)。應用乳膠凝聚技術分析癲癇的腦生物標記物可降低分析成本，提供監(jiān)測治療方法實時進展的時機，并且容許醫(yī)師確定癲癇治療中施用藥物的效力。
權利要求
1.一種用于確定被診斷為患有突發(fā)性放電的患者中癲癇發(fā)作起源的方法，包括直接或間接地分析所述患者的生物液體中GluR1的存在和數(shù)量。
2.權利要求1的方法，其中所述的起源是突發(fā)性的或非突發(fā)性的。
3.權利要求1的方法，其中所述的生物液體是血液、尿、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、汗液或腦組織、或其衍生物。
4.權利要求1的方法，包括a)直接測量GluR1肽或其片段；或b)直接測量GluR1的抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述的癲癇發(fā)作與意識喪失、暈厥、偏頭痛、腦外傷、中風、精神性活動、發(fā)作性睡病、Tourette綜合征、心律失常、藥物濫用或中風有關。
6.權利要求1的方法，進一步包括將所述的GluR1數(shù)量與選自群體標準的基線水平和在所述患者中所測量的在先水平進行比較。
7.權利要求1的方法，其中血液中游離GluR1或其片段的大于50 pg/ml表明所述癲癇發(fā)作的突發(fā)性起源，而血液中GluR1濃度小于50 pg/ml表明所述癲癇發(fā)作的非突發(fā)性起源。
8.權利要求1的方法，進一步包括使用針對SEQ ID NO5或6的GluR1片段、或其免疫原性片段、同系物或衍生物產(chǎn)生的抗體作為對照或校準物。
9.權利要求1的方法，其中a)分析所述生物液體中GluR1自身抗體的存在和數(shù)量，b)利用診斷試劑盒進行所述的方法，以及c)針對包括純化自血液的免疫球蛋白G特異部分的抗體標準物制造所述的試劑盒，任選特異結合GluR1肽而與其他的谷氨酸受體片段或其他神經(jīng)受體沒有顯著交叉反應的95％純度的免疫球蛋白。
10.權利要求1的方法，進一步包括a)分析所述患者的EEG上突發(fā)性的波峰；b)臨床評估所述患者的難以控制的癲癇；c)根據(jù)突發(fā)性波峰的存在、難以控制的癲癇、和異常高分布的GluR1或其片段的濃度，對所述的患者進行神經(jīng)外科術。
11.權利要求1的方法，其中所述的起源是突發(fā)性的，進一步包括a)用初始劑量的抗驚厥藥物療法治療所述的患者；b)直接或間接地分析所述生物液體中GluR1的存在和數(shù)量；以及c)如果GluR1的存在或數(shù)量未能低于指定標準，增加劑量、改變藥物、或用多重藥物治療。
12.權利要求11的方法，其中所述的指定標準是100、75或50pg/ml的GluR1片段，或2.0、1.8、1.5或1.0ng/ml的GluR1抗體。
13.權利要求11的方法，進一步包括使GluR1變化與通過EEG所測量的突發(fā)性波峰活動改變相關。
14.權利要求1的方法，其中所述的起源是突發(fā)性的，進一步包括a)中止或減少初始方式的抗驚厥治療；b)直接或間接分析所述生物液體中GluR1的存在和數(shù)量；以及c)根據(jù)GluR1的增加恢復所述的抗驚厥治療。
15.權利要求14的方法，其中所述的增加高于指定標準，并且所述的指定標準是100、75或50pg/ml的GluR1片段，或2.0、1.8、1.5或1.0ng/ml的GluR1抗體。
16.權利要求1的方法，其通過直接或間接的ELISA、RIA、免疫打點、免疫印跡、乳膠凝聚、側向流動、熒光偏振分析或微陣列進行。
17.權利要求1的方法，包括a)將所述的生物樣品與包括GluR1的多肽或蛋白質片段或GluR1抗體的固相接觸足夠在GluR1或其片段和GluR1之間形成復合物的時間；b)將所述的復合物與附著于產(chǎn)生信號的化合物的指示劑反應物接觸；以及c)測量產(chǎn)生的信號；其中使所檢測的信號的數(shù)值與存在于所述樣品中的所述GluR1或GluR1抗體的數(shù)值相關聯(lián)。
18.權利要求17的方法，其中所述的指示劑反應物包括附著于辣根過氧化酶的雞抗-人IgG。
19.權利要求1的方法，包括a)將所述的生物樣品與包括GluR1的多肽或蛋白質片段或GluR1抗體的凝聚載體接觸足夠在GluR1或其片段和GluR1之間形成復合物的時間；以及b)從該凝聚作用讀取產(chǎn)生的信號；其中使該信號與異常高數(shù)值的GluR1、其片段或GluR1抗體相關聯(lián)。
20.權利要求19的方法，其中該足夠的時限是10分鐘或更少。
21.權利要求1的方法，其中該生物樣品被稀釋至為大約1∶50比例的血漿或血清。
22.用于診斷和/或治療人患者中的癲癇或突發(fā)性放電的方法，包括直接或間接分析來自所述患者的生物液體中SEQ ID NO5或6的GluR1或其免疫原性片段或類似物的存在和數(shù)量。
23.一種用于診斷處于癲癇危險中的患者的癲癇概率的方法，包括直接或間接地分析所述患者的生物液體中GluR1或其片段的存在和數(shù)量。
24.權利要求23的方法，進一步包括一次或多次附加地直接或間接分析所述患者的生物液體中GluR1或其片段的存在和數(shù)量，其中a)所述GluR1的數(shù)量變化是癲癇的證明；以及b)低于指定標準水平的GluR1恒定數(shù)量是假癲癇的證明。
25.權利要求24的方法進一步包括根據(jù)GluR1數(shù)量的變化或高于所述指定標準的GluR1數(shù)量來施用抗驚厥劑治療。
26.用于預后處于神經(jīng)病學后遺癥危險之中的嬰兒的權利要求23的方法。
27.一種用于診斷處癲癇發(fā)作危險中的患者的癲癇概率的方法，包括直接或間接地分析所述患者的生物液體中GluR1或其片段的存在和數(shù)量。
28.一種用于檢測凝聚作用的即時檢驗試劑盒，包括a)GluR1的多-或單克隆抗體或固定在載體上的GluR1肽；b)對照溶液；c)凹玻片；和d)吸量管。
29.權利要求28的即時檢驗試劑盒，包括具有嵌入的或單獨的放大裝置的三聯(lián)凹玻片。
30.權利要求28的即時檢驗試劑盒，包括具有用于血漿分離的嵌入過濾器的雙室吸量管。
31.用于檢測GluR1、其片段或GluR1抗體的實驗室試劑盒，包括a)包括固定在固相上的GluR1或其片段的蛋白質片段或多-或單克隆抗體；和b)特異于所述GluR1、其片段或GluR1抗體的指示劑反應物，包括附著于產(chǎn)生信號化合物的第二抗體。
全文摘要
用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，特別是突發(fā)性大腦放電和癲癇的免疫吸附劑、試劑盒和組合物，包括測量來自人受試個體的生物樣品中GluR1或其片段和/或GluR1抗體的濃度。該方法特別可用于鑒定處于腦相關癲癇發(fā)作和癲癇危險之中的個體，用于辨別癲癇和假－癲癇及癲癇－樣病癥，用于在抗驚厥治療后進行追蹤，以及用于調整合適的治療和劑量。
文檔編號G01N33/543GK1954211SQ200480039951
公開日2007年4月25日 申請日期2004年11月8日 優(yōu)先權日2003年11月6日
發(fā)明者S·A·達姆比諾瓦, G·伊茨克諾瓦 申請人:格雷斯實驗室公司