專利名稱：人糖尿病介導(dǎo)蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括地講，本發(fā)明涉及人糖尿病介導(dǎo)蛋白、鑒定糖尿病介導(dǎo)蛋白的方法、篩選影響糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達的藥物的方法、以及治療和預(yù)防糖尿病的治療性化合物。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)和人疾病的動物模型內(nèi)的胰島素依賴型的糖尿病(IDDM)的發(fā)展表征為朗格罕氏島內(nèi)單核細胞滲透和β細胞的破壞(胰島炎)。β細胞破壞的機制還不清楚。積累的證據(jù)表明細胞因子，如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)或干擾素-γ(IFN-γ)或其結(jié)合物，主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的，可能是胰島β細胞破壞的媒介物[Mandrup-Poulsen T，Nerup J.New concepts in the pathogenesis ofinsulin-dependent diabetes mellitus Contrib Nephrol.1989；731-14；discussion 14-5]。
人糖尿病的動物模型包括有糖尿病傾向的BB(BB-DP)大鼠和非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠。構(gòu)建大鼠胰島蛋白的二維(2D)凝膠圖，并用它測定在體外將大鼠胰島細胞與IL-1β接觸后蛋白質(zhì)合成中的定性和定量的變化(Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Dieabetes.(2000)491879-29.Christensen等人Autoimmunity.(2000)；321-15和Mose Larsen等人，Diabetes.(2001)501056-63)。PCT/IB97/01627記載了通過二維凝膠分析鑒定的大鼠糖尿病介導(dǎo)蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明部分建立于人糖尿病介導(dǎo)(DM)蛋白的發(fā)現(xiàn)和鑒定。DM蛋白是一種涉及糖尿病發(fā)展或預(yù)防有發(fā)展糖尿病危險的受試者的糖尿病發(fā)展的蛋白，并可通過在有疾病發(fā)展和無疾病發(fā)展期間的差異表達而鑒別的這類蛋白。糖尿病的發(fā)展包括臨床前可檢測的所有階段。
因此，一方面本發(fā)明基本上以純化的人蛋白為特點，其中該蛋白存在于人胰島細胞內(nèi)，并在糖尿病的發(fā)展期間呈現(xiàn)出與沒有糖尿病發(fā)展時的不同的表達。純化的糖尿病介導(dǎo)蛋白選自表中列舉的蛋白(包括其所有的修飾體(如生化或化學(xué)修飾的蛋白)、變異體或降解產(chǎn)物)，尤其是表6、7和8中列舉的蛋白。在相關(guān)的一方面，本發(fā)明的特點是選自下列的分離的蛋白IEF斑點8，370，473，524，535，551，651，656，909，1013，1186，1353，1400，1477，1549，1629，1685，1689，1707，1715，1766，1800，1902，1935，2041，2079，2354，2382，2408，2411，13652，和14098(表6中所列的)，NEPHGE斑點26，35，60，76，85，128，130，171，187，188，195，243，270，421，449，508，509，532，558，560，609，719，729，829，836，837，3879，和6600(表7中所列的)和IEF斑點122SPI，123SPI，126SPI，130SPI，135SPI，140SPI，160SPI，218SPI，248SPI，277SPI，304SPI，314SPI，和338SPI(表8中所列的)。這些蛋白中一種或多種蛋白(包括其所有的修飾體、變異體或降解產(chǎn)物)的表達可被用來評估受試者發(fā)展糖尿病的危險性，評估方法包括獲取受試者的生物樣品，并測定上面列舉的一種或多種蛋白的表達水平，其中上面列舉的一種或多種蛋白表達的改變可能表示有疾病發(fā)展的危險。
另一方面本發(fā)明的特點為人胰島細胞蛋白的數(shù)據(jù)庫，這些蛋白被鑒定為當(dāng)與一種或多種細胞因子的組合接觸時顯示出相對于未與這些細胞因子接觸的人胰島細胞的改變的蛋白表達的人胰島細胞蛋白。在一個的實施方案中，這些細胞與IL-1β接觸；在另一實施方案中，細胞與包括(i)IFNγ和TNFα(ii)IFNγ和TNFα，以及(ii)IL-1β、IFNγ和TNFα之一的細胞因子混合物接觸。在具體的實施方案中，人糖尿病介導(dǎo)蛋白的數(shù)據(jù)庫通過將細胞與IL-1β、IFNγ和TNFα的混合物接觸而產(chǎn)生。在更具體的實施方案中，本發(fā)明的特點為這樣一些蛋白的數(shù)據(jù)庫被鑒定為當(dāng)人胰島細胞與150pg/ml的IL-1β，1000U/ml的IFNγ，和5000U/ml的TNFα接觸時顯示出改變的表達的人胰島細胞蛋白。在整個說明書和表中稱這為‘細胞因子混合物’。
顯示出相對于對照細胞表達改變的蛋白包括表1、2和3中所列的和

圖1、2和3中所示的蛋白的數(shù)據(jù)庫。在更具體的實施方案中，本發(fā)明提供包括表1、2和3中所列蛋白的數(shù)據(jù)庫的蛋白數(shù)據(jù)庫子集。該數(shù)據(jù)庫子集包括在預(yù)測和/或評估受試者發(fā)展糖尿病的危險性中有診斷作用的標記。因此，一方面本發(fā)明提供選自表1和/或表2和/或表3中所列蛋白的標記蛋白子集，包括它們的所有變異體、翻譯后的修飾體、降解產(chǎn)物和由其衍生的肽以及同源蛋白。在更具體的實施方案中，數(shù)據(jù)庫包括表1、表2和表3所列的5種或更多種、10種或更多種、15種或更多種或25種或更多種的蛋白。
在與此相關(guān)的一方面，本發(fā)明的特點是分泌型人胰島細胞蛋白，包括當(dāng)與IL-lβ、IFNγ和TNFα接觸時顯示出相對于未與這些細胞因子接觸時改變的蛋白表達的分泌型人胰島細胞蛋白。在具體的實施方案中，蛋白數(shù)據(jù)庫由表3所列和圖3所示的蛋白構(gòu)成。這些蛋白包括鑒定為12SPI，63SPI，79SPI，81SPI，82SPI，83SPI，122SPI，123SPI，126SPI，130SPI，135SPI，140SPI，160SPI，168SPI，213SPI，215SPI，215SPI，218SPI，248SPI，258SPI，258SPI，259SPI，277SPI，304SPI，314SPI，320SPI，338SPI，和1157SPI的蛋白。在更具體的實施方案中，該數(shù)據(jù)庫包括表3所列分泌蛋白的子集。在更具體的實施方案中，該數(shù)據(jù)庫包括15種或更多、10種或更多和5種或更多的所述蛋白。
另一相關(guān)的方面，蛋白質(zhì)組合可以是細胞蛋白(表1和2所列)和分泌型蛋白(表3所列)的組合。
如表1、2和3及圖1、2和3所示，許多糖尿病介導(dǎo)蛋白用質(zhì)譜通過與先前已鑒定的蛋白相對應(yīng)而進行鑒定。與先前鑒定過的蛋白沒有對應(yīng)的蛋白在本文中通過其質(zhì)譜表征。新的非分泌的人糖尿病介導(dǎo)蛋白以分子量、PI、和質(zhì)譜特征表征，在IEF凝膠上鑒定的蛋白收集在表6中和在NEPHGE凝膠上鑒定的蛋白收集在表7中。對于一些蛋白，不可能得到質(zhì)譜，所以只能用其等電點和分子量和在凝膠電泳圖上的位置表征(圖1、2和3)。
如表3中所示的分泌型糖尿病介導(dǎo)蛋白，許多分泌型糖尿病介導(dǎo)蛋白通過與先前鑒定過的蛋白相對應(yīng)(PI和分子量一致)而鑒定。不與已鑒定蛋白相對應(yīng)的新的分泌型蛋白以質(zhì)譜特征表征(表8)。
本發(fā)明的糖尿病介導(dǎo)蛋白用于藥物篩選試驗以鑒定能調(diào)節(jié)糖尿病發(fā)展的化合物，所述化合物通過調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達用作治療或預(yù)防糖尿病的治療劑和用作能預(yù)防或改善糖尿病的治療劑的目標。
特定的DM蛋白的表達變化在診斷上用作糖尿病發(fā)展的指示并用于預(yù)測其發(fā)展過程(預(yù)后)。因此，一方面本發(fā)明的特點是一種診斷糖尿病發(fā)展的方法，該方法是通過測量一種或多種選自表1-3中所列的非分泌和/或分泌型糖尿病介導(dǎo)蛋白在蛋白質(zhì)表達方面的增加或減少。測量懷疑有糖尿病或有發(fā)展成糖尿病危險的受試者體內(nèi)蛋白質(zhì)表達的變化，蛋白質(zhì)表達的變化是相對于正常的非糖尿病的對照組體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達而言的。在優(yōu)選的實施方案中，表1-3中的一種或多種蛋白質(zhì)的組合的變化表示糖尿病的發(fā)展。在更優(yōu)選的實施方案中，表1-3中的至少5種蛋白的組合的變化表示糖尿病的發(fā)展。在進一步優(yōu)選的實施方案中，表1-3中的至少10種蛋白的組合的變化表示糖尿病的發(fā)展。
本發(fā)明提供已鑒定的糖尿病介導(dǎo)蛋白，所述蛋白可被進一步表征為保護性的或有害的蛋白，在PCT/IB97/01627有記載，該申請在此全文引入作為參考。保護性的蛋白是一種阻止、抑制或減緩有發(fā)展糖尿病危險的受試者體內(nèi)糖尿病發(fā)展的蛋白，有害的蛋白是一種引起糖尿病發(fā)展、增加糖尿病發(fā)展的危險或減少有發(fā)展糖尿病危險的受試者發(fā)展糖尿病所需時間的蛋白。有害的蛋白也包括阻止或干擾保護性蛋白表達的蛋白。
本發(fā)明包括基本純的保護性或有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白和編碼本發(fā)明的糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸序列。
一方面，本發(fā)明的特點是一種篩選影響一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達的化合物的試驗方法。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定能夠誘導(dǎo)或增強內(nèi)源的保護性蛋白表達的試驗方法。在另一具體的實施方案中，本發(fā)明的試驗方法用于鑒定能抑制有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達因而抑制糖尿病的發(fā)展。
在與此相關(guān)的一方面，本發(fā)明提供一種鑒定能調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的化合物，例如激動劑、拮抗劑或通過阻斷糖尿病介導(dǎo)蛋白的活化所需的翻譯后的步驟調(diào)節(jié)其活性的。特定DM蛋白在表達上的變化用于鑒定能調(diào)節(jié)DM蛋白表達的化合物的篩選方法中。能調(diào)節(jié)一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達的化合物可用作潛在的治療或預(yù)防糖尿病的治療劑。因此，一方面本發(fā)明的特點是鑒定能調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的化合物的試驗方法，該方法包括將試驗化合物與表達一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白的細胞或組織接觸，并測定試驗化合物對一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的作用。測定化合物的作用可通過本領(lǐng)域已知的各種方法進行，包括雜交進行探查或其它的寡核苷酸、抗體識別，例如，免疫擴散法、熒光免疫檢驗法、ELISA，RIA，印跡、免疫沉淀反應(yīng)法、免疫電泳法或色譜法以及電泳法。能增加選自表1、2和3的糖尿病介導(dǎo)蛋白中一種或多種蛋白的表達和減少選自表1、2和3的糖尿病介導(dǎo)蛋白中一種或多種蛋白的表達的化合物為預(yù)防或治療糖尿病的候補治療性物質(zhì)。蛋白表達的變化是相對于沒有試驗化合物時的表達來測定的。
另一方面，本發(fā)明提供一種通過施用治療有效量的保護性的糖尿病介導(dǎo)蛋白來預(yù)防有糖尿病危險的受試者的糖尿病或改善糖尿病受試者的糖尿病癥狀的治療方法。優(yōu)選受試者為人。提供編碼保護性的糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸的基因治療也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明進一步包括一種通過施用有效量的多核苷酸來預(yù)防和/或治療糖尿病的治療方法，其中所述的多核苷酸在體內(nèi)抑制有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達。候選治療性化合物選自表1、2和3中的蛋白、其同源物和衍生物及其模擬物。
在與此相關(guān)的方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防和/或治療有糖尿病危險的受試者的糖尿病的治療方法，該方法是通過施用治療有效量的能抑制或減少內(nèi)源的有害糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的化合物進行的。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)防和/或治療有糖尿病危險的受試者的糖尿病的治療方法，該方法是通過施用治療有效量的能誘導(dǎo)或增強內(nèi)源的保護性糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的化合物進行的。在與此相關(guān)的方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防和/或治療有糖尿病危險的受試者糖尿病的治療方法，該方法是通過施用治療有效量的能調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的化合物，例如激動劑、拮抗劑，或是通過阻止糖尿病介導(dǎo)蛋白的激活而進行的。本發(fā)明的治療方法包括本領(lǐng)域已知的用于給有需要的受試者提供治療劑的離體方法。
本發(fā)明的目的之一是鑒定介導(dǎo)糖尿病發(fā)病的人蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供人糖尿病介導(dǎo)蛋白，該蛋白用于鑒定能預(yù)防、延遲或改善受試者糖尿病的試驗化合物的試驗中。
本發(fā)明的另一目的是提供人糖尿病介導(dǎo)蛋白，該蛋白用于鑒定能引起、加速或惡化受試者糖尿病的試驗化合物的分析中，表明該試驗化合物將不適于作為藥物化合物。
本發(fā)明的上述和其它目的、優(yōu)點和特點對于閱讀了介導(dǎo)糖尿病的基因和蛋白、分析方法的詳述和權(quán)利要求后的本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面涉及一種診斷人糖尿病的方法，該方法包括測定人的生物樣品中至少一種標記蛋白表達的存在或其水平，其中所述標記蛋白選自表1、2和3及圖1、2和3中公開的任何一種蛋白和表1、2和3中標記蛋白的修飾體和衍生物，所述修飾體和衍生物與表1、2和3中的標記蛋白有至少80％的同源性，其中pI為以等電聚焦法測定的標記蛋白的等電點，向上的箭頭表示在接觸的細胞內(nèi)該蛋白增量調(diào)節(jié)，向下的箭頭表示在接觸的細胞內(nèi)該蛋白減量調(diào)節(jié)，并在聚丙烯酰胺凝膠上測定分子量(分子量以kDa為單位)。
進一步地，所述方法的應(yīng)用優(yōu)選包括至少2種、至少5種或甚至更優(yōu)選至少10種所述的蛋白，因為對于這些標記物的應(yīng)用2種或更多種、5種或更多種或10種或更多種蛋白的表達變化從統(tǒng)計學(xué)上是更加可靠的指示。
本發(fā)明進一步的方面涉及一種診斷人糖尿病的方法，該方法包括測定人的生物樣品中的至少一種標記蛋白表達的存在或水平，還包括確定至少一種標記蛋白增加的表達(增量調(diào)節(jié)的標記蛋白)或確定至少一種標記蛋白減少的表達(減量調(diào)節(jié)的標記蛋白)，這些蛋白選自增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)的標記蛋白或增量和減量調(diào)節(jié)的標記蛋白的組合。
本發(fā)明進一步涉及一種治療糖尿病的方法，該方法包括上調(diào)一種減量調(diào)節(jié)的蛋白、下調(diào)一種增量調(diào)節(jié)的蛋白或兩種手段相結(jié)合。也就是說本發(fā)明涉及一種治療人糖尿病的方法，該方法包括改變表1、2或3以及圖1、2和3中標記蛋白的表達。此外，本發(fā)明涉及治療人糖尿病的方法，該方法包括對所述的人施用表1、2或3中的標記蛋白、編碼表1、2或3的標記蛋白的核苷酸序列、表1、2或3蛋白的抗體、能結(jié)合表1、2或3的標記蛋白的核酸片段或能結(jié)合表1、2或3中標記蛋白的化合物。
在鑒定作為糖尿病標記蛋白的標記蛋白的過程中，所述的標記蛋白要么是先前不清楚與糖尿病有關(guān)的蛋白，要么在糖尿病中它們的表達水平不清楚(增量或減量調(diào)節(jié))，本發(fā)明的研究者目前已分離出先前未被鑒定且的確未與糖尿病相關(guān)的蛋白。與這些新蛋白相關(guān)的是，本發(fā)明還涉及選自表1、2和3中蛋白以及與其有至少80％同源性的蛋白。
本發(fā)明進一步的方面涉及新蛋白和表1、2和3中的蛋白作為糖尿病標記物或指示物的用途以及雖已知但其存在與否或普遍性先前被認為與糖尿病無關(guān)的蛋白的用途。蛋白質(zhì)表達和蛋白質(zhì)表達模式的變化對于診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用以及靶標是重要的。
本發(fā)明的方法可被進一步用來測定人患糖尿病的傾向，該方法包括在人的生物樣品內(nèi)測定至少一種標記蛋白的存在或相對水平，其中所述指示有患糖尿病傾向的標記蛋白選自表1、2和3中公開的蛋白和表1、2或3中標記蛋白的修飾體和衍生物，所述的修飾體和衍生物與表1、2或3中的標記蛋白有至少80％的同源性。
一種診斷人有患糖尿病傾向的方法，可包括在人的生物樣品內(nèi)測定至少一種標記蛋白增加的表達，所述的標記蛋白選自表1、2和3的蛋白，確定人生物樣品內(nèi)至少一種標記蛋白的減少的表達(減量調(diào)節(jié)的標記蛋白)，確定至少一種標記蛋白的增加的表達，或確定標記蛋白的增加的表達與減少的表達的組合。因此，確定測定一種蛋白是受增量調(diào)節(jié)還是減量調(diào)節(jié)可作為易患糖尿病的指示。增量和減量調(diào)節(jié)的模式也可作為指示。也就是說確定一種以上的蛋白的表達水平并一組蛋白的表達模式作為指示。
在合適的實施方案中，至少一種標記蛋白選自所述生物樣品的蛋白在聚丙烯酰胺凝膠上顯示出比對照品明顯低或明顯高的一種或多種的蛋白、在所述生物樣品的蛋白聚丙烯酰胺凝膠上顯示而在對照品聚丙烯酰胺凝膠上不顯示的一種或多種蛋白、在所述生物樣品的蛋白聚丙烯酰胺凝膠上沒有顯示而在對照品聚丙烯酰胺凝膠上顯示的一種或多種蛋白。
類似地，關(guān)于治療糖尿病的方法，可將一種單一的蛋白作為治療的目標或可將一組的蛋白作為目標。這類目標蛋白的表達水平可被改變或可干擾這類蛋白本身以改變其活性。因此，治療人糖尿病方法的一個有價值的實施方案包括改變表1、2或3中的至少一種標記蛋白的表達。
因此，本發(fā)明進一步涉及一種治療人糖尿病的方法，包括對所述的人施用表1、2或3中至少一種標記蛋白、其衍生物、同源物或其模仿物、編碼表1、2或3中的標記蛋白的核苷酸序列、表1、2或3中的抗體、能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白(或其對應(yīng)的基因)的核酸片段、或能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白(或其對應(yīng)的基因)的化合物。
本發(fā)明的阻止或延遲人糖尿病發(fā)作的方法可包括對所述的人施用表1、2或3中的一種標記蛋白、其衍生物、同源物或其模仿物、編碼表1、2或3中的標記蛋白的核苷酸序列(如DNA、cDNA、RNA、其PNA同源物或模仿物)、表1、2或3中的抗體、能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白的核酸片段(如DNA、cDNA、RNA、PNA、其同源物或模仿物)、或能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白(或其對應(yīng)的基因)的化合物。
因此，本發(fā)明的一個特別有價值的方面涉及一種藥物組合物，該組合物包括能調(diào)節(jié)編碼表1、2或3中蛋白的至少部分的核酸片段表達的物質(zhì)、或表1、2或3中至少一種標記蛋白、表1、2或3中的抗體、能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白的核酸片段、或能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白的化合物。
本發(fā)明進一步涉及一種測定一種物質(zhì)具有治療糖尿病的治療作用的可能性的方法，該方法包括在將實驗?zāi)Ｐ团c所述試劑接觸之前和之后測定表1、2或3中的一種或多種蛋白的表達水平并比較該表達水平。
在化合物的測試中，有關(guān)試劑的活性或靶的知識對于理解所述試劑的治療活性是有用的并有助于改進所需的治療效果。本發(fā)明研究者的進展允許實現(xiàn)一種測定化合物在治療糖尿病中的效果的方法，該方法包括測定表1、2或3中的一種或多種蛋白的蛋白質(zhì)表達水平，本發(fā)明涉及到一種測定治療糖尿病的化合物的效果水平或活性水平的方法，該方法包括測定在將實驗?zāi)Ｐ团c所述試劑接觸之前和之后測定表1、2或3中一種或多種蛋白的表達水平。
因此，本發(fā)明進一步涉及一種測定物質(zhì)生理作用的方法，該方法包括使用已確定為有較大可能患糖尿病和具有患糖尿病遺傳傾向的哺乳動物以本發(fā)明的方法進行測定，該方法包括對所述的個體施用所述的物質(zhì)并測定該物質(zhì)的效果。本發(fā)明的研究者預(yù)見到測定患糖尿病或易患所述疾病的人的糖尿病特征和病因，包括確定表1、2或3中的蛋白相對模型的表達水平，用來了解所述的疾病和可能的治療方法。
本發(fā)明的每種方法涉及表1、2或3中的蛋白或與其有至少80％的同源性的蛋白和/或是其翻譯后的修飾體的用途。類似地，表1、2或3中的新鑒定的蛋白進一步包括與之有至少80％同源性的蛋白，其是或不是這類蛋白的修飾產(chǎn)品。
本發(fā)明進一步涉及一種包括編碼表1、2或3中定義的肽的核苷酸序列的核酸片段，以及涉及與上述核酸片段或其部分雜交的核酸片段?？墒褂盟龊怂崞螜z測表1、2或3中肽的存在。
本發(fā)明進一步涉及能結(jié)合表1、2或3中定義的蛋白(或其翻譯后修飾體的任何部分)的抗體。該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體?？墒褂每贵w檢測表1、2或3中顯示的肽的存在。
本發(fā)明有價值的一方面涉及一種用于診斷哺乳動物糖尿病或有糖尿病遺傳傾向的試劑盒，它包括a)一種結(jié)合工具，該結(jié)合工具特異性地結(jié)合至少一種表1、2或3中所示的標記蛋白(或其翻譯后的修飾體的任何部分)或表1、2或3中的蛋白的抗體、能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白的核酸片段(或其翻譯后的修飾體的任何部分)、或能結(jié)合表1、2或3中的標記蛋白的化合物(或其翻譯后的修飾體的任何部分)。
b)檢測結(jié)合工具與至少一種標記蛋白或至少一種肽或至少一種核酸片段的結(jié)合(假如有結(jié)合的話)、或結(jié)合的水平的工具，和c)將與結(jié)合工具的結(jié)合(如果有的話)、或結(jié)合的水平、是否表明個體哺乳動物有較大可能患糖尿病或有患糖尿病的遺傳傾向相關(guān)聯(lián)起來的工具。
須知可以預(yù)料一種以上的標記物相結(jié)合的檢測將使得該分析成為糖尿病相關(guān)疾病的更可靠的指示。因此，診斷或測定至少一種糖尿病相關(guān)疾病的傾向的方法優(yōu)選包括測定兩種標記物的存在、活性、濃度和/或表達水平，三種或更多種的標記物(例如至少4、5、6或7種標記物)將是更優(yōu)選的。類似地暗示用一種以上的本發(fā)明化合物(一種以上選自多肽、核酸片段或本發(fā)明的抗體)，例如至少2、3、4、5、6或7種化合物進行治療將使疾病的治療更加有效，其中所述化合物能有效地影響一種以上的標記蛋白的水平。
在描述本發(fā)明的人糖尿病介導(dǎo)蛋白和基因和所用的試驗方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體的試驗方法、糖尿病介導(dǎo)蛋白和基因、所述的試驗化合物，因為所述的方法、基因及其制備當(dāng)然可以變化。也應(yīng)理解本文中的術(shù)語只是為了描述具體的實施方案而不是用來限制本發(fā)明，因為本發(fā)明只受所附的權(quán)利要求的限制。
如說明書和權(quán)利要求述中所使用的，單數(shù)形式的″一種″和″所述″包括其復(fù)數(shù)名詞，除非上下文另外清楚地加以說明。因此，例如“糖尿病介導(dǎo)蛋白”或“一種糖尿病介導(dǎo)蛋白”包括這類蛋白的混合物，“該制劑”或“該方法”包括本文描述的和/或?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員來說在閱讀了本發(fā)明公開文本等后是顯而易見的一種或多種的這類制劑、方法和/或步驟。
除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。雖然任何與本文中描述的方法和材料相似的或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但優(yōu)選的方法和材料為本文描述的方法和材料。本文中所提到的出版物在此引入作為參考以公開和描述與此相關(guān)的被出版物引用的方法和/或材料。
術(shù)語“糖尿病”包括胰島素依賴型的糖尿病(IDDM，青少年糖尿病或T1D)和II型糖尿病(成年發(fā)作的糖尿病T2D)。術(shù)語“與糖尿病相關(guān)的疾病”包括肥胖、循環(huán)不足、胰島素抗性(insulin-resistance)、X綜合癥、糖尿病性的視網(wǎng)膜病、糖尿病性的神經(jīng)病變以及神經(jīng)病變和動脈硬化癥中的深度糖化終產(chǎn)物的作用(the involvement of advancedglycation end products(AGE))。
術(shù)語“蛋白”包括氨基酸鏈的蛋白質(zhì)、多肽和肽，包括所有的翻譯后的修飾(例如處理和切斷、糖基化或磷酸化)，這種修飾通常在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能中起決定作用。該術(shù)語還包括天然的蛋白質(zhì)以及合成的或重組的蛋白質(zhì)、多肽和肽。術(shù)語“糖尿病介導(dǎo)蛋白”是指與糖尿病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)。糖尿病介導(dǎo)蛋白是在糖尿病的發(fā)病期間顯示出變化的表達的蛋白，即與無糖尿病發(fā)病相比在糖尿病發(fā)病期間受增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)的蛋白或其表達受增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)的蛋白。在本發(fā)明中，糖尿病介導(dǎo)蛋白被鑒定為當(dāng)人胰島細胞與一種或多種細胞因子接觸時顯示出改變的表達的人胰島細胞蛋白，其中所述的改變的表達是相對于沒有與一或多種細胞因子接觸的對照細胞的表達而言的。
可將蛋白以化學(xué)方法或生物方法進行修飾，包括磷酸化、甲基化、硫酸化(sulphylated)、糖基化或加入任何形式的脂質(zhì)或脂肪酸、泛素或任何其它的大基團或含額外的氨基酸或任何其它形式的修飾(其中有200多種修飾形式是已知的)。這些修飾發(fā)生在蛋白質(zhì)的特定位置并且在一個位置上的特定的修飾可能與在同一蛋白質(zhì)上的不同位置上相同的修飾具有不同的效果。它們在細胞內(nèi)可以是可逆的，例如它們可被用來開啟和關(guān)閉酶，所以這些蛋白質(zhì)可以各種形式存在-每種形式具有與這些蛋白質(zhì)功能相關(guān)的活性。而且多肽可被裂解，例如通過處理其N-端或C-端以移除信號肽或?qū)⑵淦唇右猿?nèi)部的序列。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫如EXPASY可找到許多這類例子，有越來越多的手段預(yù)測這些修飾及其功能(參見http//www.expasy.ch/)。因為據(jù)估計人體內(nèi)的每種蛋白平均被修飾了10次，所以可預(yù)料本文中已鑒定過的大多數(shù)蛋白都是以某種方式或另外的方式修飾過的。因此在表1、2和3中給出了它們的表觀等電點和分子量以便與理論值相比較以顯示該修飾對蛋白質(zhì)具有什么效果。
對多肽而言，術(shù)語“基本純”是指重量比至少60％，無與其自然相關(guān)的其他蛋白質(zhì)和天然存在的有機分子?；炯兊奶悄虿〗閷?dǎo)蛋白為重量比至少75％的糖尿病介導(dǎo)蛋白，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少99％?；炯兊奶悄虿〗閷?dǎo)蛋白可從下列方法獲得由天然來源提??；編碼糖尿病介導(dǎo)蛋白的重組核酸的表達；在對天然或重組細胞或表達系統(tǒng)電泳后回收或以化學(xué)方法合成該蛋白質(zhì)。純度可用任何合適的方法如柱色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析進行測定。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包括上述多肽的衍生物、相似物和模擬物。這類衍生物、相似物和模擬物優(yōu)選地與衍生前的多肽具有相同的活性，例如同一種酶活性。該衍生物、相似物和模擬物可具有比母體多肽低的活性、相同的活性或優(yōu)選地具有比母多肽高的活性。
術(shù)語“至少一種”(例如至少一種化合物或至少一種標記蛋白)包括整數(shù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19等。應(yīng)理解可用單一的蛋白，但在本發(fā)明的方法中使用一種以上的標記蛋白更有利。也就是說確定一種以上的蛋白的表達水平并用一組蛋白的表達模式作為指示。顯然糖尿病鑒定的可靠性隨組中蛋白的數(shù)量增加而增加。
“肽模擬物”是模擬肽的生物活性但在化學(xué)特性方面不再具有肽的性質(zhì)的分子。按嚴格的定義，肽模擬物是不再含任何肽鍵(即氨基酸之間的酰胺鍵)的分子。然而術(shù)語肽模擬物有時用來描述在特性上不再完全是肽的分子，如偽肽、半肽和類肽。無論是完全的非肽或部分的非肽，本發(fā)明的肽模擬物具有非常類似于肽的活性基團的三維空間排列的反應(yīng)性化學(xué)基團的空間排列，模擬肽以肽的這種空間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。因為這種相似的活性部位的幾何結(jié)構(gòu)，模擬肽對生物系統(tǒng)具有作用，該作用類似于肽的生物活性。本發(fā)明包括肽模擬物的組合物，其為模擬本發(fā)明的生物活性肽的活性的相似物，即本發(fā)明的模擬肽可被用來治療與糖尿病相關(guān)的疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽模擬物在三維形狀和生物活性方面都與肽基本上相似或與如上述的活性部位基本上相似。
另外，模擬物可以是‘抗模擬物’。換而言之，是能適合和阻斷蛋白質(zhì)的活性部位、或與結(jié)合部位或跟其它生物活性分子相互作用的部位相結(jié)合以干擾蛋白質(zhì)的功能的分子。目前大多數(shù)藥物屬于這種類型。本發(fā)明包括這類能與本發(fā)明的多肽相互作應(yīng)的抗模擬物。
使用特定的肽的模擬物或抗模擬物比使用肽本身具有明顯的優(yōu)點，因為肽通常顯示出兩種不利的性質(zhì)(1)低的生物利用度；和(2)短的作用持續(xù)時間。肽模擬物或抗模擬物提供了解決這兩個主要障礙的明顯的途徑，因為其分子足夠小以致口服時具有活性且作用的持續(xù)時間長。還能節(jié)約相當(dāng)可觀的成本并有改進的與肽模擬物有關(guān)的受試者的依從性，因為與胃腸外給藥和經(jīng)粘膜給藥的肽比較，它們能口服給藥。而且生產(chǎn)肽模擬物比生產(chǎn)肽廉價。最后，對于肽而言有與穩(wěn)定性、貯藏和免疫反應(yīng)有關(guān)的問題，而肽模擬物沒有這些問題。
因此上述肽可應(yīng)用于具有相似的生物活性因而具有相似的治療用途的這類小化合物。開發(fā)肽模擬物的技術(shù)為常規(guī)技術(shù)。所以肽鍵可被非肽鍵替換，允許肽模擬物采用相似的結(jié)構(gòu)，因而具有與原始的肽相似的活性。此外還可通過以其它相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團替換氨基酸基團來作進一步的修飾。通過NMR光譜、結(jié)晶學(xué)和/或計算機輔助的分子模擬來測定原始肽的三級結(jié)構(gòu)有助于模擬肽的發(fā)展。這些技術(shù)有助于開發(fā)具有比原始肽更高效力和/或更高生物利用度和/或更高穩(wěn)定性的新組合物[Dean(1994)，BioEssays，16683-687；Cohen和Shatzmiller(1993)，J.Mol.Graph.11166-173；Wiley和Rich(1993)，Med.Res.Rev.，13327-384；Moore(1994)，Trends Pharmacol.Sci.，15124-129；Hruby(1993)，Biopolymers，331073-1082；Bugg等(1993)，Sci.Am.，26992-98，上述所有文獻在此引入作為參考]。一旦一種可能的肽模擬物被鑒定，就可合成它并用本文中描述的診斷分析方法或合適的疾病抑制劑分析方法對其進行分析以估計其活性(見Finlay等人(1983)，Cell，571083-1093及Fujiwara等人1993，Cancer Res.534129-4133，全部引用作為參考)。
因此，通過利用上述的方法，本發(fā)明提供具有比上述多肽增強的治療活性的化合物。本發(fā)明包括能通過上述方法獲得的具有上述肽的生物活性和相似的三維結(jié)構(gòu)的肽模擬物。肽模擬物可從任何前面描述的修飾肽產(chǎn)生或從帶有一種以上的前述修飾的肽產(chǎn)生，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。更顯而易見的是，本發(fā)明的肽模擬物除用作治療化合物外可被進一步地用于開發(fā)更有效的肽模擬物。
術(shù)語“表達”的意思不僅包括蛋白質(zhì)的物理表達，也包括表達的蛋白質(zhì)的活性測量。例如蛋白質(zhì)可以一種非活性的形式表達，通過磷酸化活化。盡管蛋白質(zhì)的實際表達不變，但其有效的表達(活性)可被修飾。在凝膠上活性的變化可隨蛋白質(zhì)修飾形式的表達變化測量?！案淖兊牡鞍踪|(zhì)”或“改變的蛋白質(zhì)表達”是指在糖尿病發(fā)病期間其表達增加(“增量調(diào)節(jié)”)、減少(“減量調(diào)節(jié)”)、被抑制(即關(guān)閉)或被誘導(dǎo)(即開啟)的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“介導(dǎo)糖尿病的基因或多核苷酸”是指編碼蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)片段的遺傳物質(zhì)，它編碼完整的糖尿病介導(dǎo)蛋白或其片段。該術(shù)語源自任何物種的編碼糖尿病介導(dǎo)蛋白的任何基因。介導(dǎo)糖尿病的基因或多核苷酸可以是天然存在的或部分或完全合成的。
術(shù)語“核酸片段”“多核苷酸”、“核酸序列”等應(yīng)理解為包括DNA，RNA，LNA(閉合的核酸)，PNA，RNA，dsRNA和RNA-DNA雜交體的核酸分子。也包括含非天然核苷的核酸分子。該術(shù)語包括任何長度的，例如10-10000的核苷酸的核酸分子，這由其用途決定。當(dāng)核酸分子用作例如在DNA治療中的藥物，或用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法中時，優(yōu)選使用編碼至少部分多肽的分子，該分子具有約18至約1000核苷酸的長度，任選地將該分子嵌入載體中。當(dāng)核酸用作探測物、引物或用于反義治療中時，優(yōu)選使用長度為10-100的分子。按照本發(fā)明，可使用其它的分子長度，例如至少有12、15、21、24，27，30，33，36，39，42，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500或1000個核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)，或最多有10000，5000，4000，3000，2000，1000，700，500，400，300，200，100，50，40，30或20個核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)。應(yīng)理解可將這些數(shù)值自由組合以產(chǎn)生一定的范圍。
本文中所用的“分離的”多核苷酸是指不直接與在獲取該多核苷酸的生物體天然基因組中直接與之相鄰的(即5’末端和3’末端處的序列)任何一個編碼序列相鄰近(即共價鍵連接)。因此該術(shù)語包括重組的多核苷酸，例如并入載體中的、并入到自發(fā)復(fù)制的質(zhì)?；虿《局械幕虿⑷氲皆松锘蛘婧松锏幕蚪M的DNA中的、或以獨立于其它序列的單獨的分子形式存在的重組的多核苷酸。它還包括編碼額外的多肽序列的雜交基因的部分。本發(fā)明分離純化的多肽序列還包括在嚴格的條件下與本文詳細說明的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。
術(shù)語“嚴格的條件”是指保證雜交的多核苷酸序列之間的特異性的雜交條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇雜交后洗滌條件，包括溫度和鹽的濃度，該條件能減少非特異性的雜交以致于只有高互補性的序列才能被識別(Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning，2d ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，在此特別引入作為參考)。例如這樣的條件是在具體的條件下雜交的，例如，包括在5xSSC中預(yù)浸和在20％的甲酰胺、5xDenhardt′s溶液、50mM磷酸鈉、pH6.8、50μg變性的超聲處理過的小牛胸腺DNA的溶液中于約40℃下預(yù)雜交1小時，接著在補充了100μM ATP的相同溶液中在約40℃下雜交18小時(Sambrook等(1989)op cit.)。本發(fā)明分離和純化的多核苷酸序列還包括與編碼糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸序列互補的序列(反義序列)和核糖酶。在本申請中多核苷酸序列之間的雜交優(yōu)選在嚴格的條件下進行。
術(shù)語“序列同一性”(或“序列同源性”)是指對同等長度的兩組氨基酸序列或同等長度的兩組核苷酸序列同源性程度的測量。如果被比較的兩組序列的長度不等，那么必須通過插入缺口或在蛋白質(zhì)序列末端截斷來將它們比對至盡可能最佳的配合。序列的同一性可用 計算，其中Ndif為兩組序列比對時不相同的殘基的總數(shù)，Nref為其中序列之一的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC有75％的序列同一性(Ndif＝2且Nref＝8)。缺口當(dāng)作非同一性的具體殘基進行計算，即DNA序列AGTGTC與DNA序列AGTCAGTC有75％的序列同源性(Ndif＝2且Nref＝8)。另外序列同源性可用BLAST程序例如BLASTP程序進行計算(Pearson W.R和D.J.Lipman(1988)PNAS USA 852444-2448)(www.ncbi.nim.nih.gov/cgi-bin/BLAST)。在本發(fā)明的一方面，用序列比對的方法ClustalW以默認的參數(shù)進行比對，該方法記載在Thompson J.，等Nucleic Acids Res 1994 224673-4680，從http//www2.ebi.ac.uk/clustalw/可獲取該方法。另外，兩組核酸序列的同源性程度可用GCG程序組件的第8版的GAP進行測定，使用對于DNAGAP標準罰分權(quán)重5.00，長度權(quán)重0.300，Gribskov和Burgess在Nucl.Acids Res.14(16)；6745-6763(1986)中描述的矩陣，并且兩組氨基酸序列的同源性程度可用GCG程序組件的第8版的GAP(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.53711，USA)進行測定，使用對于蛋白質(zhì)GAP標準罰分權(quán)重3.00，長度權(quán)重0.100，Gribskov和Burgess在Nucl.Acids Res.14(16)；6745-6763(1986)中描述的矩陣。
優(yōu)選的序列同源性的最小百分數(shù)為至少70％，如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和至少99.5％。
術(shù)語蛋白質(zhì)“數(shù)據(jù)庫”是指由具有至少一種共有的特征而選擇的蛋白質(zhì)集合。術(shù)語“數(shù)據(jù)庫”可被其它表示蛋白質(zhì)集合的術(shù)語替代，這些術(shù)語包括“庫”或“族”。本發(fā)明提供人胰島細胞蛋白的數(shù)據(jù)庫，在一實施方案中當(dāng)與特定的細胞因子組合接觸時這些蛋白顯示出改變的表達為其共有的特征。
整個說明書中，除非上下文另有所指，詞語“包括”應(yīng)理解為包括所述的元素或整數(shù)或元素或整數(shù)形成的集合，但不排除任何其它的元素或或整數(shù)或元素或整數(shù)形成的集合。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽或核酸用作治療的疫苗的用途，這在文獻如Lowry，D.B.等1999，Nature 400269-71中有記載。
在免疫檢測中與本發(fā)明的多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體、或所述抗體的特異性結(jié)合片段也屬于本發(fā)明的一部分。所述抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。多克隆抗體可在哺乳動物內(nèi)產(chǎn)生，例如通過注射一種或多種本發(fā)明的多肽制備，需要時可加入佐劑。例如，本發(fā)明的單克隆抗體可通過雜交瘤方法生產(chǎn)，該方法最早在Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)中公開，或者通過重組DNA方法，例如美國專利4,816,567中描述的方法生產(chǎn)。單克隆抗體也可從例如用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中描述的方法產(chǎn)生的噬菌體庫中分離得到。其它生產(chǎn)抗體的方法在文獻例如US 6,136,958中有記載。
在診斷、治療或測試中，本發(fā)明的抗體、核酸片段和/或多肽可單獨使用，或作為組合物中的成分使用。這類組合物為本領(lǐng)域所已知，包括這樣的組合物其中本發(fā)明的抗體、核酸片段或多肽與至少一種其它的分子例如標記物(例如放射性或熒光物質(zhì))偶聯(lián)，優(yōu)選以共價鍵的方式偶聯(lián)。
本發(fā)明進一步涉及利用上述化合物治療和/或預(yù)防受試者的糖尿病相關(guān)疾病的方法。
本發(fā)明的方法包括這些步驟a)將本發(fā)明的一種或多種化合物與合適的藥物載體結(jié)合；和b)給受試者施用與載體結(jié)合的治療有效量的或預(yù)防有效量的化合物。
術(shù)語“合適的藥物載體”是指任何藥學(xué)領(lǐng)域已知的用于化合物給藥的載體。按照本發(fā)明可使用任何合適的藥物載體，只要不存在相容性的問題。
將有效的劑量施用于受試者可通過胃腸外注射來實現(xiàn)，如靜脈注射、鞘內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或動脈內(nèi)注射?；衔镆部煽诜蚪?jīng)皮給藥，或通過任何其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式例如通過氣霧劑或鼻內(nèi)噴霧的方式給藥。本發(fā)明優(yōu)選口服給藥。
本文中所用的術(shù)語“治療有效量”是指治療性治療受試者所需的一種或多種本發(fā)明的化合物的量。這種治療對于患有確診為糖尿病相關(guān)疾病的受試者是適當(dāng)?shù)?。類似地，術(shù)語“預(yù)防有效量”是指預(yù)防受試者所需的一種或多種本發(fā)明的化合物的量。這種預(yù)防對于受試者，例如，還沒有確診為有任何糖尿病相關(guān)疾病癥狀的受試者是適當(dāng)?shù)?。?dāng)確定受試者有患糖尿病相關(guān)疾病的危險(例如，通過以具有標記物的改變的水平來確定糖尿病的傾向)時就開始預(yù)防性治療是有益的。已知某些IDDM的標記物(例如GAD65和其它自身抗體)能在糖尿病發(fā)作前至少8年檢測到。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，所給定的化合物的劑量、給藥途徑和治療持續(xù)的時間不僅取決于化合物的類型和其治療疾病的效力，也取決于受治療的個體，要考慮這樣一些因素，如受試者的體重、對受試者進行的其它治療和受試者的病情、臨床反應(yīng)和耐受性。劑量、給藥途徑和治療持續(xù)的時間可由本領(lǐng)域技術(shù)人員對這些因素和其它相關(guān)因素進行評估后決定。
本發(fā)明的各個方面人的糖尿病介導(dǎo)蛋白和多核苷酸本發(fā)明提供人的糖尿病介導(dǎo)蛋白，即被鑒定為在糖尿病發(fā)病期間相關(guān)的或受影響的蛋白。糖尿病介導(dǎo)蛋白表征為在糖尿病發(fā)病期間相對于沒有糖尿病發(fā)病時其表達被改變的蛋白。本發(fā)明的公開從人胰島細胞蛋白的二維凝膠數(shù)據(jù)庫中鑒定出糖尿病介導(dǎo)的蛋白。糖尿病介導(dǎo)蛋白包括保護性的糖尿病介導(dǎo)蛋白和有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白。通過將人胰島細胞與細胞因子接觸來鑒定糖尿病介導(dǎo)蛋白，其中細胞因子為已知或公認為在糖尿病最終發(fā)病之前選擇性地破壞胰島細胞的細胞因子。本發(fā)明提供通過下述方法鑒定的糖尿病介導(dǎo)蛋白使用二維凝膠比較對照品和用細胞因子刺激的胰島從而鑒定哪些蛋白有反應(yīng)，鑒定在細胞反應(yīng)中起作用的蛋白。可用連環(huán)分析確定蛋白質(zhì)的官能團及其調(diào)節(jié)(例如通過激酶磷酸化或其它的翻譯后的修飾)。
保護性的糖尿病介導(dǎo)蛋白本發(fā)明提供基本純的保護性糖尿病介導(dǎo)蛋白(“保護性蛋白”)，其特征為能防止有糖尿病發(fā)病危險的受試者的糖尿病發(fā)病，或能改善或減輕糖尿病受試者的糖尿病癥狀。本發(fā)明的保護性蛋白可直接用于防止糖尿病發(fā)病，或通過誘導(dǎo)或增強第二保護性蛋白的合成或者通過減少或抑制有害蛋白的合成而間接作用。本發(fā)明進一步包括與人的糖尿病介導(dǎo)蛋白的整個氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％和最優(yōu)選至少98％的同一性。同源性或同一性的百分數(shù)可以測定，例如通過使用GAP計算機程序(第6版，購自University ofWisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))對序列信息比較而測定。GAP程序運用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443中的比對方法，該方法在Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482中進行了修正。簡而言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為比對的符號(即核苷酸或氨基酸)中相似的數(shù)目除兩個序列中較短序列的符號的總數(shù)。GAP程序默認的參數(shù)包括(1)一元比較矩陣(unitary comparison matrix)(包含同一性的值1和非同一性的值0)和Gribskov和Burgess(1986)Nucl.Acids Res.146745中權(quán)重的比較矩陣(the weighted comparisonmatrix)，這在Schwartz和Dayhoff，eds.(1979)Atlas Of蛋白Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358中有記載。(2)每個缺口罰分3.0而對每個缺口的每個符號另外罰分0.10；和(3)對于末端缺口無罰分。
本發(fā)明進一步包括編碼本發(fā)明的糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸序列，包括DNA，cDNA，PNA和RNA序列。還應(yīng)當(dāng)理解編碼全部的或部分的糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們編碼具有介導(dǎo)糖尿病活性的多肽。這類多核苷酸包括天然存在的、合成和有意操縱的多核苷酸。例如，這類多核苷酸可經(jīng)歷定點突變形成。本發(fā)明的多核苷酸序列還包括反義序列。反義序列包括用修飾的寡核苷酸合成的序列。本發(fā)明的多核苷酸包括由遺傳密碼簡并生成的序列。有20種天然的氨基酸，其中大多數(shù)由一種以上的密碼子指定。因此，所有簡并的核苷酸序列都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要由核苷酸序列編碼的介導(dǎo)糖尿病的多肽氨基酸序列功能上沒有變化。
有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白(“有害蛋白”)的特征為增強糖尿病的發(fā)病或增加受試者糖尿病發(fā)病危險。
鑒定糖尿病介導(dǎo)蛋白的方法二維凝膠電泳(2-DGE)是分離蛋白質(zhì)混合物特別有效的手段(例如Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Diabetes.(2000)；491819-29.Christensen等，Autoimmunity.(2000)；321-15和Mose Larsen等，Diabetes.(2001)；501056-63)。將細胞蛋白提取物加到凝膠上，各蛋白首先依電荷分離，然后依大小分離。結(jié)果是有1000-5000個斑點的特征圖譜，每個斑點通常為單一的蛋白質(zhì)。通過增加凝膠的尺寸和通過使用放射性同位素示蹤法、銀染和將凝膠的厚度減至1.5mm和更低以增加靈敏度可提高分辨率。通過使二維凝膠處于狹窄的pH范圍內(nèi)(例如1.5、1pH單位或更小)而獲得分辨率的顯著進一步改善。如下面的實施例所述，從2D凝膠上回收的單一的蛋白可通過質(zhì)譜鑒定以得到胰蛋白酶的裂解模式和各個肽的精確分子量。然后用這些觀測到的值在DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行檢索以確定是否存在與先前鑒定過的蛋白相匹配的蛋白。根據(jù)已知的蛋白可以測定同一性或從與已知蛋白的高同源性可推算出同一性。當(dāng)用2D凝膠電泳分離和鑒定出在糖尿病的發(fā)病期間顯示出合成改變的蛋白斑點時，將鑒定的蛋白從凝膠上切離并用胰蛋白酶消化產(chǎn)生肽。從凝膠上回收肽并進行質(zhì)譜分離(matrix assisted laser desorption/離子化的質(zhì)譜)(MALDI)，并將所得到的MS圖譜與公共的序列數(shù)據(jù)庫中所有序列的計算機化的MS圖譜和合適的序列信息對照進行分析。如果得到任何與先前克隆的序列的匹配，就將有關(guān)相應(yīng)的基因和編碼的蛋白質(zhì)的信息收集起來。當(dāng)所鑒定的糖尿病介導(dǎo)蛋白不能與先前克隆的蛋白質(zhì)匹配時，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將蛋白質(zhì)微序列化以獲得部分氨基酸序列信息。也可將蛋白質(zhì)(當(dāng)能以足夠的量獲得時)部分序列化，例如通過nanoelectrospraytandem質(zhì)譜部分序列化，在該過程中使特定的肽在氣相中成碎片并用所得碎片的分子量推導(dǎo)出部分氨基酸序列。一旦獲得部分序列的信息就可能在cDNA或EST(表達的序列標簽)數(shù)據(jù)庫中以及前面提到的數(shù)據(jù)庫中進行檢索。
在從數(shù)據(jù)庫檢索或氨基酸序列化獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建具體的或簡并的引物并用于篩選大鼠和人胰島庫，或用PCR的第一鏈cDNA克隆相應(yīng)的cDNA的部分序列。然后用所得到的序列通過5′-race PCR或通過常規(guī)的雜交篩選技術(shù)，然后通過重組蛋白質(zhì)的表達獲得全長編碼的區(qū)域(Karlsen等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888337-8341；Karlsen等(1994)inInsulin secretion and pancreatic beta-cellresearch，F(xiàn)latt，P.R.，ed.，Smith-Gordon，USA；Chapter 64，pp.1-9；Karlsen等(1995)Diabetes 44757-758)。
糖尿病介導(dǎo)蛋白可以本領(lǐng)域已知的各種方法進行分離，包括從生物材料純化、由重組DNA表達(見上面)。常規(guī)的方法步驟包括提取、沉淀、色譜、親和色譜和電泳。例如，細胞表達糖尿病介導(dǎo)蛋白可通過離心法或用合適的緩沖液收集、裂解，并將蛋白質(zhì)通過柱色譜分離，例如在DEAE-纖維素、磷酸纖維素、多聚核糖胞苷酸-瓊脂、羥磷灰石上進行，或通過電泳或免疫沉淀分離。另外，使用特異性抗體通過電泳可分離糖尿病介導(dǎo)蛋白。
糖尿病介導(dǎo)蛋白用于篩選能影響糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的化合物的用途本發(fā)明提供的方法用于篩選能影響糖尿病介導(dǎo)蛋白表達并因而影響哺乳動物糖尿病發(fā)病的化合物。用于篩選能影響一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白表達的藥物的一種模型是將可能有有益作用的化合物(包括抗過敏的寡核苷酸)施用給培養(yǎng)的細胞。有用的細胞是RIN、轉(zhuǎn)染的細胞或胰島細胞。然后可通過2D凝膠電泳分析試驗化合物對蛋白表達的作用。
另一種篩選模式是用有糖尿病發(fā)病危險的哺乳動物進行體內(nèi)篩選的方法。簡而言之，將具有增加的患糖尿病危險的哺乳動物(例如有糖尿病傾向的BB大鼠或NOD小鼠)與試驗化合物接觸，并測定與試驗化合物的接觸對糖尿病發(fā)病的作用。
可通過測定一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達并通過將糖尿病發(fā)作的時間與沒有糖尿病發(fā)展時的表達和時間比較可監(jiān)測整個發(fā)展期間糖尿病的發(fā)展。對一種或多種糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達的測定包括介導(dǎo)糖尿病蛋白本身、翻譯后的修飾產(chǎn)品和/或糖尿病介導(dǎo)蛋白降解產(chǎn)物。在一實施方案中，糖尿病介導(dǎo)蛋白的活化是通過測量糖尿病介導(dǎo)蛋白在試驗樣品中的表達水平進行測定的。合適的試驗樣品包括體液，如血液、尿液或腦脊髓液、或由其得到的液體，如血漿或血清。在一具體的實施方案中，蛋白質(zhì)在試驗樣品中的表達水平通過蛋白印跡分析測量。存在樣品中的蛋白質(zhì)通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到膜上，并用標記的蛋白質(zhì)特異性抗體進行探測。在另一具體的實施方案中，糖尿病介導(dǎo)蛋白的表達水平是通過RNA印跡分析測量的。從試驗樣品中分離多聚腺苷酸化的[poly(A)+]mRNA。將mRNA通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到膜上。用標記的cDNA探測該膜。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)的表達通過應(yīng)用于表達的mRNA的定量PCR進行測量的。
在又一方面，本發(fā)明提供鑒定能抑制或減少內(nèi)源的有害的蛋白表達的化合物的方法，以及通過施用治療有效量的能抑制或減少內(nèi)源的有害的蛋白表達的化合物來預(yù)防和/或治療糖尿病的方法。
本發(fā)明的糖尿病介導(dǎo)蛋白也用于篩選調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的試劑。因此，一方面，本發(fā)明的特點是鑒定調(diào)節(jié)糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的試劑，該方法包括以待測試劑孵育表達糖尿病介導(dǎo)蛋白的細胞，并測量待測試劑對糖尿病介導(dǎo)蛋白的合成、磷酸化、功能或活性的作用。當(dāng)糖尿病介導(dǎo)蛋白經(jīng)磷酸化激活時，待測試劑同糖尿病介導(dǎo)蛋白孵育和用伽馬-[32P]或[33P]-標記的-ATP(或其它的單核苷酸)或[32P]或[33P]-焦磷酸鹽(磷酸)或[32S]-蛋氨酸孵育，并測定磷酸化的速率。在另一實施方案中，待測試劑同以糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸表達載體轉(zhuǎn)染的細胞孵育，并以RNA印跡分析方法測量待測試劑對糖尿病介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)錄的作用。在進一步的實施方案中，用糖尿病介導(dǎo)蛋白的抗體以蛋白質(zhì)印跡分析方法測量待測試劑對糖尿病介導(dǎo)蛋白合成的作用。在另一實施方案中，試劑對糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的作用是通過用待測[32P]-ATP(或上述的其它放射化學(xué)試劑)和糖尿病介導(dǎo)蛋白的途徑中的底物孵育糖尿病介導(dǎo)蛋白進行測量的。所有的試驗結(jié)果都將與以[35S]-蛋氨酸正常標記的細胞進行比較以測定蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)。底物磷酸化的速率用本領(lǐng)域已知的方法測定。
術(shù)語糖尿病介導(dǎo)蛋白活性的調(diào)節(jié)包括激動和拮抗。本發(fā)明尤其用于篩選抑制有害蛋白活性的試劑。這類試劑用于治療或預(yù)防糖尿病。
治療應(yīng)用本發(fā)明提供通過應(yīng)用治療有效量的保護性糖尿病介導(dǎo)蛋白來預(yù)防和/或治療人糖尿病的方法。優(yōu)選地哺乳動物為有患糖尿病危險的人。
使用已鑒定的糖尿病介導(dǎo)蛋白和相關(guān)的糖尿病治療劑的藥物篩選在本發(fā)明的藥物篩選法中，已鑒定的保護性的或有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白用于鑒定能影響其表達的試驗化合物。如此鑒定的試驗化合物為預(yù)防、改善或延遲有患糖尿病危險受試者的糖尿病發(fā)作的候選治療劑。影響糖尿病介導(dǎo)蛋白的試驗化合物可以是，但不限于，至少一種選自核酸、化合物、蛋白質(zhì)、元素、脂質(zhì)、抗體、糖、同位素、碳水化合物、顯象劑、脂蛋白、糖蛋白、酶、可檢測的探測劑、和抗體或其片段、或它們的組合，如本文所述，它們可進行可探測的標記，如標記抗體。這些標記包括但不限于酶標記、放射性同位素或放射性化合物或元素、熒光化合物或金屬、化學(xué)發(fā)光性化合物和生物熒光化合物。
治療性化合物在本發(fā)明的藥物篩選法中是通過其誘導(dǎo)或增強保護性蛋白以致有患糖尿病危險的受試者的疾病發(fā)作被阻止或延遲的能力而鑒定。候選治療性化合物也可通過其阻止或減少有害蛋白表達以致有患糖尿病危險的受試者的疾病發(fā)作被阻止或延遲的能力而鑒定。作為治療性化合物的治療性核酸可具有，但不限于，至少一種下述的對靶細胞的治療作用抑制有害蛋白DNA序列的轉(zhuǎn)錄；抑制有害蛋白RNA序列的翻譯；抑制有害蛋白對應(yīng)的RNA或DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄；抑制蛋白翻譯后的修飾；誘導(dǎo)保護性蛋白對應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄；誘導(dǎo)保護性蛋白對應(yīng)的RNA序列的翻譯；誘導(dǎo)保護性蛋白對應(yīng)的RNA或DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄；核酸翻譯為蛋白質(zhì)或酶；將核酸并入靶細胞的染色體用于治療性核酸的組成型或短暫表達。治療性核酸的治療作用可包括，但不限于關(guān)閉有缺陷基因或?qū)ζ浔磉_進行加工，如反義RNA或DNA；抑制病毒的復(fù)制或合成；表達編碼治療性蛋白或修正缺陷蛋白的異源核酸的基因治療；修正RNA如hnRNA、mRNA、tRNA、或rRNA有缺陷的表達或表達不足；編碼藥物或前藥、或能在表達糖尿病介導(dǎo)蛋白或肽的病變或正常細胞內(nèi)產(chǎn)生作為藥物或前藥的化合物的酶；和任何已知的其它治療作用。本發(fā)明也包括通過提供編碼保護性的糖尿病介導(dǎo)蛋白的多核苷酸的基因治療法。本發(fā)明進一步包括通過施用有效量的抑制有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白體內(nèi)表達的多核苷酸來預(yù)防糖尿病的方法。
在本發(fā)明的治療方法中，對病人長期或短期應(yīng)用治療化合物。任選地，長期應(yīng)用保護性的蛋白并聯(lián)合應(yīng)用有效量的與該治療性化合物不同作用途徑的化合物。本發(fā)明的治療方法可與其它治療糖尿病的方法相結(jié)合。治療制劑在PCT/IB97/01627有記載，特在此全文引入作為治療制劑的說明和本領(lǐng)域已知的治療化合物的給藥方法，包括常規(guī)的和基因治療技術(shù)的參考。
人的糖尿病介導(dǎo)蛋白的鑒定和表征如下面的實施例所述，將從器官捐獻者胰腺分離的人朗格罕氏島在標準的培養(yǎng)條件下于RPMI 1640培養(yǎng)基中在下列重組細胞因子存在的情況下培養(yǎng)A＝僅有培養(yǎng)基；B＝培養(yǎng)基+150pg/ml白細胞介素-1β(IL-1β)(相當(dāng)于60U/ml)；C＝培養(yǎng)基+1500pg/ml IL-1β；D＝培養(yǎng)基+1000U/ml-IFN-γ+5000U/ml腫瘤壞死因子-α(TNFα)；E＝150pg/ml IL-1β+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα。
在標準的細胞培養(yǎng)條件下20小時，將細胞在[35S]-蛋氨酸存在下標記4小時。從細胞和培養(yǎng)基中分離出蛋白質(zhì)。從培養(yǎng)基得到的蛋白質(zhì)代表不與細胞因子接觸或與一種或多種細胞因子接觸后的分泌型蛋白質(zhì)。通過2-D凝膠電泳和質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)樣品。
對于分析凝膠，用于鑒定表達水平改變的蛋白質(zhì)，進行6個單獨的試驗，每個試驗用150個胰島。這可以構(gòu)造每種培養(yǎng)條件下的合成圖像。這樣通過這種方式將對照條件(A)和其它與細胞因子接觸的任何條件下(B-E)的結(jié)果進行比較和統(tǒng)計學(xué)評估可以鑒定胰島中的和分泌到培養(yǎng)基中的與對照條件相比被顯著增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)的一組蛋白。為了對在上述的凝膠分析中鑒定為增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)的斑點進行MS鑒定，制備定量的/制備型凝膠，每種試驗條件用100,000個胰島(以便在每個斑點上得到足量的蛋白進行MS鑒定)。這樣，將兩組各100,000個胰島在沒有細胞因子(A)或在3種細胞因子(E)存在的條件下進行培養(yǎng)，增加了讓所有的耳的蛋白點都能進行MS鑒定的可能性。
實驗給出下面的實施例是為了將如何制備和使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)、基因和試驗方法的完整的公開和說明提供給本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，而不是用來限制發(fā)明人所指的發(fā)明范圍。已作了很大的努力確保所用的數(shù)字(例如量、溫度等)的準確性，但仍包括一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份為重量份量，分子量為重量平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實施例1。材料和方法試劑克他命(Ketamin)購自Park-Davis(Barcelona，Spain)，xylazin購自Bayer(Lever-kusen，Germany)，Temgesic@購自Reckitt和Colemann(Hull，UK)。RPMI 1640、Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)，和DMEM購自Gibco，Paisley，蘇格蘭。RPMI 1640含11mmol D-葡萄糖，并補充了20mM HEPES緩沖液、100,000IU/l青霉素和100mg/l鏈霉素。可靠的重組人IL-1β由Novo Nordisk Ltd.(Bagsvaerd，Denmark)提供，特異活性為400U/ng。使用的其它試劑2-巰基乙醇、牛血清白蛋白(BSA)、Tris-HCL、Tris堿、甘氨酸，(Sigma，St.Louis，USA)；三氯乙酸(TCA)、磷酸、NaOH、甘油、正丁醇、溴酚藍、硝普鈉(SNP)，H3PO4和NaNO2(Merck，Darms tadt，Germany)；過濾器(HAWP 0.25mm孔徑)(Millipore，Boston，USA)；RNAse A，DNAse I(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ，USA)；[35S]-蛋氨酸(SJ 204，特異活性＞1.000Ci/mmol，含0.1％的2-巰基乙醇、Amplify@(Amersham International，Amersham，UK)；尿素(超高純)(Schwarz/Mann，Cambridge，MA，USA)；丙烯酰胺、二丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨(BioRad，Richmond，CA，USA)；兩性電解質(zhì)pH 5-7，pH 3.5-10，pH 7-9，pH 8-9.5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)；Nonidet P-40(BDH，Poole，UK)；兩性電解質(zhì)pH 5-7和十二烷基硫酸鈉(Serva，Heidelberg，Germany)；瓊脂(Litex，Copenhagen，Denmark)；乙醇(絕對濃度96％)(Danish Distillers，Aalborg，Denmark)；甲醇(Prolabo，Brione Le Blanc，F(xiàn)rance)；乙酸(技術(shù)質(zhì)量，99％冰乙酸)(Bie & Berntsen，Arhus，Denmark)和X-光膠片(CurixRP-2)(AGFA)。
人的樣品分離人胰島(Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Diabetes.(2000)；491819-29.Christensen等，Autoimmunity.(2000)；321-15以及Mose Larsen等，Diabetes.(2001)；501056-63)，人胰島由糖尿病研究所，細胞移植組，(Diabetes ResearchInst.，Division of Cellular Transplantation，Miami，F(xiàn)lorida，美國)提供。在培養(yǎng)幾天后，將胰島按上述的具體條件處理。在試驗的最后步驟中在2D-凝膠分析前將洗滌過的胰島和培養(yǎng)基/標記培養(yǎng)基直接(對于制備型凝膠)，或在樣品緩沖液中水解后(對于分析型凝膠)于-80℃下貯藏。
細胞因子激發(fā)將制備好的人胰島細胞在5種不同的試驗條件下培養(yǎng)A組在單獨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；B組在培養(yǎng)基+150pg/ml IL-1β(相當(dāng)于60U/ml)中培養(yǎng)；C組在培養(yǎng)基+1500pg/mlIL-1β中培養(yǎng)；D組在培養(yǎng)基+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα中培養(yǎng)；D組在150pg/ml IL-1β+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα中培養(yǎng)。將細胞在標準的條件下于37℃孵育20小時，接著用[35S]-蛋氨酸孵育4小時。收集細胞以進行2-D凝膠電泳和質(zhì)譜分析。收集每試驗組中標記的培養(yǎng)基以進行分泌蛋白質(zhì)的分析。
樣品的制備將用于分析的部分150胰島/條件在水解緩沖液中直接裂解，大部分在條件A和E下培養(yǎng)的用于上述制備凝膠和MS鑒定的胰島(100,000/條件)在研缽內(nèi)碾碎、再混懸于100ml DNAse I/RNAse A溶液中并經(jīng)凍/融兩次裂解。在第二次融化后，將樣品置于冰上30分鐘以便核酸消化，然后冷凍干燥過夜。在2D-凝膠分離前通過振搖將樣品溶解在120ml的裂解緩沖液(8.5M尿素，2％Nonidet P-40，5％2-巰基乙醇和2％兩性電解質(zhì)，pH范圍為7-9)中最少4小時。-蛋氨酸摻入量的測定通過向每組兩份同等樣品5ml的1∶10稀釋液中加入作為蛋白質(zhì)載體的10mg BSA(0.2mg/mlH2O)、接著加入0.5ml的10％TCA來定量測定[35S]-蛋氨酸摻入量。在經(jīng)0.25mm HAWP過濾器過濾之前讓其在4℃下沉淀30分鐘。將過濾器干燥并置入閃爍液體中計數(shù)。
2-D凝膠電泳該方法早有記載(O′Farrell等(1977)Cell 121133-1142)。簡而言之，第一種二維凝膠含4％丙烯酰胺、0.25％二丙烯酰胺和兩性電解質(zhì)。每種樣品的等數(shù)計量(106cpm)應(yīng)用到凝膠上。在放射性較低的情況下，必須調(diào)整與凝膠的曝光時間以便可比較的總的光密度。將樣品在等電聚焦(IEF；pH3.5-7)和非平衡pH-梯度電泳(NEPHGE；pH6.5-10.5)凝膠上分析。第二種二維凝膠含12.5％的丙烯酰胺和0.063％二丙烯酰胺，進行一整夜。電泳后，在干燥前用Amplify@固定和處理凝膠以便熒光顯像。使凝膠與X-光膠片接觸并在-70℃下暴光3-40天。每份凝膠暴光至少3次以補償X-射線的動態(tài)范圍的不足。將一些凝膠立即干燥并將凝膠暴露于磷光板(phosphorimaging plate)上以便捕獲影像。暴光3至15天(每份凝膠暴光1次，因為磷光顯像儀的動態(tài)范圍超過106)后，用AGFA ADC 70在板上讀數(shù)并將圖像以16bit文檔輸出以便分析。
MW和pI的測定蛋白質(zhì)的分子量用已知的蛋白質(zhì)的值以內(nèi)插法測定。界標(Landmark)蛋白質(zhì)通過下列中的一種或幾種技術(shù)鑒定免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)、質(zhì)譜、微序化或肽圖譜。
熒光圖象的計算機分析用BioImage@程序(6.1版)在Sun-sparc工作站進行計算機分析。首先，將熒光圖像或自顯影圖像掃描，通過BioImage@程序鑒定斑點并進行定量測定。接著將錨點(anchor points)置于凝膠上(每份凝膠相同的斑點被指定相同的錨點)，并要求計算機將凝膠相匹配。計算機匹配完后，進行人工編輯以確保正確的斑點分界線的鑒定、正確的計算機匹配能發(fā)現(xiàn)計算機程序初期不能發(fā)現(xiàn)的斑點和斑點的定量測定。最后，提取數(shù)據(jù)以便用Excel@電子制表軟件(Microsoft)計算。為避免IEF和NEPHGE亞組中重復(fù)的斑點的存在，在分析時忽略IEF凝膠堿性部分或NEPHGE凝膠酸性部分中重復(fù)的斑點。
統(tǒng)計學(xué)分析運用Student的t檢驗，P＜0.01被認為是有顯著性差異。
實施例2.糖尿病介導(dǎo)蛋白的表征質(zhì)譜在本發(fā)明的至少一份凝膠中在包括至少一種蛋白質(zhì)斑點的至少一個凝膠塊上原位消化。按照對Rosenfeld等(1992)Anal.Biochem.203173-179中方法改進后的方法制備凝膠，在Fey等(1997)Electrophoresis 181-12中有記載，兩篇文獻均在此具體引入作為參考。簡而言之，將凝膠迅速染色和脫色。用解剖刀將目的蛋白質(zhì)的凝膠帶切割下來，在-20℃下貯存在含UHQ水的微量離心管中，由此可獲得目的蛋白質(zhì)。通過在40％乙腈/60％的消化緩沖液中洗滌凝膠塊至少1小時直到除去考馬斯亮蘭染料從而將蛋白質(zhì)消化。
這樣洗滌除去了考馬斯亮蘭染料、凝膠緩沖液、SDS和鹽份。如有必要，可反復(fù)洗滌。然后將凝膠塊在真空離心機中干燥20-30分鐘直到收縮并在表面上變白。干燥的時間取決于凝膠塊的大小和厚度。將胰蛋白酶(或所用的酶)溶解在消化緩沖液中并取5ml加入到凝膠填料中(取決于待分析的凝膠中蛋白質(zhì)的量(0.1mg))。另外加入消化緩沖液直到凝膠塊在試管底部幾乎被緩沖液覆蓋，約10ml。然后將凝膠塊在37℃下孵育6小時或過夜，然后用70-100ml 60％乙腈/40％水孵育以2-6小時提取肽?？芍貜?fù)提取以增加回收率。然后將提取物凍干并在MALDI-MS分析前溶解在30％乙腈/2％TFA中。
實施例3.定量凝膠分析上述兩組二維凝膠分析產(chǎn)生表1-8中所列的人糖尿病介導(dǎo)蛋白數(shù)據(jù)庫的鑒定。這些蛋白質(zhì)通過用1500pg/ml IL-1β或細胞因子(150pg/mlIL-1β(β白細胞介素)、1000U/ml IFNγ(γ干擾素)和5000U/mlTNFα(α腫瘤壞死因子))的混合物處理人胰導(dǎo)而鑒定。
表1所列的所有細胞蛋白鑒定為當(dāng)用細胞因子處理[35S]-蛋氨酸標記的人胰島并在IEF凝膠分析蛋白時顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的表達改變的細胞蛋白。在表1、2和3各表中IL-1β1500是指用1500pg/ml IL-1β刺激?！毎蜃踊旌衔铩侵赣?50pg/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ和5000U/mlTNFα誘導(dǎo)的刺激。向上的箭頭表示在處理的細胞中蛋白質(zhì)以較高的量表達；向下的箭頭則相反。
表2所列的所有細胞蛋白鑒定為當(dāng)用細胞因子處理[35S]-蛋氨酸標記的人胰島并在NEPHGE凝膠上分析蛋白時顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的表達改變的細胞蛋白。
表3所列的所有分泌蛋白鑒定為當(dāng)用細胞因子處理[35S]-蛋氨酸標記的人胰島并在IEF凝膠上對蛋白進行分析時顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的表達改變的分泌蛋白。
表4所列的為被鑒定為在細胞因子激發(fā)時在IEF凝膠分析中顯示出表達改變的蛋白(cf.表1)并提供蛋白質(zhì)片段的質(zhì)譜分子量值。這些蛋白質(zhì)通過參考記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫中的其它種類的蛋白質(zhì)(包括氨基酸序列和核苷酸序列)進行鑒定。
表5所列的為被鑒定為在細胞因子激發(fā)時在NEPHGE凝膠分析中顯示出表達改變的蛋白(cf.表2)并提供蛋白質(zhì)片段的質(zhì)譜分子量值。這些蛋白質(zhì)通過參考記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫中的其它種類的蛋白質(zhì)(包括氨基酸序列和核苷酸序列)進行鑒定。
表6所列的為以IEF凝膠(cf.表1)鑒定的沒有任何已知蛋白相對應(yīng)的新的人胰島細胞蛋白并提供這些蛋白質(zhì)片段的質(zhì)譜分子量值。
表7所列的為以NEPHGE凝膠(cf.表2)鑒定的沒有任何已知蛋白相對應(yīng)的新的人胰島細胞蛋白并提供這些蛋白質(zhì)片段的質(zhì)譜分子量值。
表8所列的為以IEF凝膠(cf.表1)鑒定的沒有任何已知的蛋白相對應(yīng)的由人胰島細胞分泌的蛋白并提供這些蛋白質(zhì)片段的質(zhì)譜分子量值。
圖1顯示了兩份用[35S]蛋氨酸-標記的人胰島的二維凝膠圖像和按本文中描述的方法分離的蛋白質(zhì)。本文中或表中提到的蛋白質(zhì)都被標記以便參考。右邊給出了近似分子量的刻度。圖像的右邊是酸性面并覆蓋了標定的4到7的pH范圍。
圖2顯示了兩份用[35S]蛋氨酸-標記的人胰島的二維凝膠圖像和按本文中描述的方法分離的蛋白質(zhì)。本文中或表中提到的蛋白質(zhì)都被標記以便參考分子量刻度。圖像的右邊的酸性面并覆蓋了標定的6.5到10.5的pH范圍。
圖3顯示了兩份用[35S]蛋氨酸-標記的胰島分泌的人蛋白的二維凝膠圖像和按本文中描述的方法分離的蛋白質(zhì)。本文中或表中提到的蛋白質(zhì)都被標記以便以分子量的數(shù)值范圍為指示供參考。圖像呈現(xiàn)的是右邊的酸性面并覆蓋了標定的4到7的pH范圍。
表1以MS鑒定表征的、通過與其它種類的相關(guān)性鑒定的人胰島細胞蛋白和未曾鑒定的蛋白
表2以MS鑒定表征的、通過與其它物種的相關(guān)性鑒定的人胰島細胞蛋白和未曾鑒定的蛋白
表3在人胰島細胞培養(yǎng)基中檢測到的、以MS鑒定表征的蛋白和未曾鑒定的蛋白
表4以MS表征的人胰島細胞蛋白肽的分子量值從質(zhì)譜儀上直接讀出，因此與由這樣的儀器一般得到的準確性有關(guān)。這些質(zhì)量值來自從IEF凝膠上回收的人胰島細胞蛋白，并通過參考記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列)中的其它物種的蛋白質(zhì)進行鑒定。
IEF點724984.4406 1004.6172 1045.5750 1084.6248 1137.5220 1172.5513 1181.57871188.5267 1189.5705 1193.5450 1209.5364 1232.6502 1237.5782 1244.63901273.6111 1365.6163 1381.6246 1418.7151 1434.7000 1437.7885 1476.69721525.7884 1544.7837 1583.7063 1589.8061 1601.7708 1618.7619 1630.81951645.8241 1684.8527 1700.7857 1728.8839 1730.8908 1745.9084 1781.81471794.8168 1826.8641 1860.9918 1918.9139 1940.9287 1989.9645 2005.93352055.9358 2077.1362 2095.9846 2211.0999 2328.1808 2674.4376 3198.8492IEF點963903.5003 976.5949 1045.5749 1064.5752 1168.5158 1198.6904 1319.66041341.6072 1350.6473 1379.6844 1437.8828 1445.7037 1501.7661 1509.65831515.7456 1596.7730 1707.7736 1790.9116 1794.8513 1797.8409 1808.91381838.9222 1852.9407 1878.9424 1946.9897 2122.0285 2150.0260 2211.09992406.2399 2559.1687 2585.3182IEF點977842.5100 973.4918 1021.4022 1031.4738 1037.3794 1045.4938 1060.76761075.5956 1151.6148 1159.5482 1179.5398 1196.5457 1263.5613 1267.61121277.6170 1279.5629 1307.5846 1320.5246 1329.5717 1386.6334 1437.76411458.6907 1472.6424 1475.6892 1536.8279 1597.8518 1674.8387 1700.93371717.7814 1794.8163 1802.9448 1826.7513 1873.0013 1881.0435 1888.90441942.0398 1994.0735 2211.0999 2225.1090 2231.1803 2455.2958IEF點1421957.5447 1053.4829 1075.5106 1114.5114 1146.5867 1151.6223 1163.55301177.5601 1197.6195 1222.5030 1227.5776 1277.6330 1291.6297 1302.65201307.6147 1317.6238 1327.6099 1343.6147 1383.6003 1391.6233 1393.65141396.7482 1403.6989 1421.6244 1427.8312 1434.6764 1439.7253 1460.62491469.7214 1475.6805 1477.6583 1487.7037 1489.6919 1515.7063 1540.74101542.7700 1544.7626 1565.7587 1570.7737 1588.7486 1613.8336 1619.80791630.8408 1639.7890 1645.7757 1650.8568 1674.8047 1678.8083 1685.74861694.8735 1701.7636 1726.8556 1741.8646 1749.8863 1763.7788 1789.90341805.8828 1837.9159 1850.9476 1863.9118 1869.9458 1923.9277 1938.89681988.0785 1993.9638 2052.0445 2101.0154 2139.0677 2155.0785 2175.89642196.1696 2211.1000 2225.1153 2230.0816 2444.2075 2461.1385IEF點1861986.6183 1099.5910 1277.6498 1305.6530 1383.6670 1390.5687 1462.71081475.7014 1489.7417 1516.7727 1544.7517 1555.7811 1590.7901 1594.83111638.7729 1644.8520 1654.8019 1661.7714 1701.8654 1707.7328 1716.87881746.9048 1756.9955 1794.8406 1799.9569 1802.8989 1837.9500 1851.92451900.9804 1920.1066 1990.9681 1993.9618 2062.0419 2211.1082 2225.10142272.1417 2298.1959 2472.2712 2502.2031IEF點1923
1004.6256 1045.5750 1084.6033 1137.4897 1172.5717 1181.5737 1188.51631189.5777 1193.5510 1209.5453 1232.6509 1237.5933 1263.6638 1273.61301277.6849 1307.6799 1365.6431 1381.6188 1394.7306 1418.7243 1425.64241437.8278 1444.6997 1455.7280 1475.7475 1525.7932 1544.7815 1583.71301589.7876 1601.7387 1618.7568 1630.8242 1645.8190 1669.8494 1684.88601686.8789 1700.8011 1707.8472 1728.8715 1737.8908 1746.8984 1748.90941779.9697 1782.8774 1794.8152 1835.9384 1838.9265 1860.9665 1908.02601915.9525 1920.9264 1940.9263 1989.9395 2055.9253 2077.1037 2095.96382211.0999 2278.2563 2328.1495 3197.5962 3494.9900表5以MS表征的人胰島細胞蛋白肽的分子量值從質(zhì)譜儀上直接讀出，因此與由這樣的儀器一般得到的準確性有關(guān)。這些質(zhì)量值來自從NEPHGE凝膠上回收的人胰島細胞蛋白，并通過參考記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列)中的其它物種的蛋白質(zhì)進行鑒定。
NEPHGE點3081016.5065 1032.4876 1035.6038 1055.5031 1148.5696 1179.6000 1197.61751211.5699 1221.5578 1229.7271 1264.6730 1265.6893 1277.6546 1283.73851307.6327 1317.7154 1338.7857 1352.8162 1379.7060 1383.6587 1405.65571434.7509 1475.7249 1487.7638 1505.7494 1527.6946 1539.7651 1549.76661561.7328 1594.8652 1612.7713 1628.7452 1631.7017 1636.6749 1638.86141645.8028 1707.7680 1710.8218 1719.7991 1757.9016 1770.9237 1786.92091794.8343 1812.9308 1822.9402 1837.9966 1852.9594 1940.9424 1988.00631993.9935 2064.1358 2149.0169 2155.2298 2196.1764 2211.0999 2250.11192596.2598 2674.3040 3150.8016NEPHGE點3391009.3940 1171.5822 1179.5496 1226.4567 1277.6437 1320.6468 1383.63081405.4537 1411.7060 1426.7141 1437.8630 1471.7116 1475.7304 1483.69591493.6772 1501.7870 1542.8788 1592.6512 1596.7767 1638.8489 1695.82171707.7969 1715.8272 1778.8540 1794.8041 1797.8152 1819.8835 1823.92291838.9469 1851.9609 1878.9472 1940.9953 1962.8823 1978.9525 1993.99312018.0026 2211.1201 2225.1558 2274.1434 2283.1658 2299.2521 2344.37612383.9712 2402.2620 2406.3035 2431.0818 2705.2697 2719.1012 2731.34722807.4831NEPHGE點418822.4000 832.4732 842.5100 908.6270 928.4098 992.4582 1033.46021045.4933 1065.4224 1073.4967 1107.4692 1116.4852 1147.5546 1157.49591165.4439 1167.4800 1179.5001 1201.5553 1218.5409 1232.5022 1277.62041299.5559 1307.5788 1352.6447 1357.6185 1384.6983 1393.6325 1406.56871422.5837 1427.6627 1437.6719 1454.6286 1470.6347 1475.6829 1493.65741500.6009 1503.6764 1560.7424 1628.7381 1657.7530 1694.6866 1699.75471707.7213 1716.8199 1741.7043 1751.7916 1784.8936 1791.7001 1838.88551851.8301 1867.8840 1987.9418 2211.0999 2365.2112 2383.9402NEPHGE點474679.5296 706.4771 714.4944 730.4229 991.5260 1012.5126 1092.55791108.5016 1212.5737 1225.5337 1277.6968 1307.6588 1446.8720 1475.77481604.7245 1710.9075 1772.9576 1788.9636 1794.8920 1867.0268 2018.11372174.2120 2211.2344 2401.4191 2789.6777NEPHGE點536
853.5924 945.5755 978.5561 998.5303 1011.6255 1045.5785 1054.65951066.5559 1102.5904 1179.6000 1183.7368 1184.6987 1277.6972 1291.72931295.7841 1304.7071 1307.7127 1339.7158 1403.7144 1617.8575 1634.86041664.8766 1666.7879 1683.9517 1737.8633 1794.8280 1801.8590 1812.03731902.8723 1907.8546 1918.9088 1940.9273 1945.9582 1993.9928 2026.04342065.0661 2196.0354 2211.0999 2449.2132 2577.3710NEPHGE點635，842.5456 1011.6439 1036.5530 1045.5684 1048.6357 1064.5920 1071.50911082.6031 1092.5681 1106.6437 1157.5750 1179.6000 1232.6820 1277.70701307.6714 1314.7441 1320.5891 1323.6417 1338.7554 1350.6851 1357.69311383.6509 1389.6969 1396.6928 1401.6416 1407.7207 1429.6767 1434.76771461.6809 1475.7583 1493.7287 1535.8219 1620.8873 1638.8669 1657.78331665.9997 1702.8599 1707.7849 1709.8196 1716.8613 1724.9400 1757.91501794.8189 1829.8908 1838.9142 1851.9404 1867.9269 1940.9311 1959.92021993.9642 2047.0784 2150.0418 2211.0999表6以MS表征的人胰島細胞蛋白肽的分子量值從質(zhì)譜儀上直接讀出，因此與由這樣的儀器一般得到的準確性有關(guān)。這些質(zhì)量值來自從IEF凝膠上回收的人胰島細胞蛋白，并不能與記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列)中的任何蛋白質(zhì)匹配。
IEF點81045.6833 1179.6990 1277.8454 1475.8751 1794.9853 1816.9418 1833.93832211.3200 2225.3308 2231.4079 2239.3200 2249.2374 2298.4052 2721.56822807.6137 3340.0959IEF點370842.5100 995.5638 1009.5700 1023.5915 1045.4798 1155.5365 1254.57571264.5343 1275.5888 1348.5604 1419.6498 1475.6669 1794.7643 1940.91351950.0052 1993.9562 2211.0999 2403.2608IEF點4731008.2678 1094.4059 1151.4450 1208.4057 1254.4806 1267.4619 1277.48231285.4220 1315.4963 1355.4978 1375.5110 1383.4741 1475.5626 1488.60751497.5317 1506.5091 1555.6522 1589.7591 1607.6268 1615.6441 1624.66941668.7791 1697.7066 1700.8164 1706.8476 1716.7516 1761.7701 1794.71841826.7320 1838.8344 1853.8072 1880.9486 1919.9092 1922.8662 1940.84951993.9770 2034.9080 2107.0836 2211.0999 2225.1068 2231.2066IEF點524842.5100 1045.5152 1201.6168 1404.6128 1481.7153 1561.8987 1794.79331826.8585 1940.9415 2211.0999 2225.1233 2230.1675 2240.1371 2284.21282298.2138 2315.1913IEF點5351061.3738 1077.1038 1277.6330 1352.6221 1398.7634 1470.7513 1561.21421561.6867 1637.8923 1670.3631 1674.8225 1794.8100 1826.8587 1838.91661852.9038 1940.9301 1942.9249 1993.9472 2027.0373 2083.0422 2085.00982914.5719IEF點551
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1266.8593 1282.7904 1342.0994 1357.9284 1375.9517 1379.9293 1413.94921471.0408 1475.6861 1489.0704 1493.0714 1584.1187 1602.1516 1697.24011715.2577 1737.1939 1828.3534 1993.9914 2211.1000 2225.1434IEF點2408842.5100 1045.4988 1239.5138 1287.6241 1462.7030 1590.8423 1601.78671794.7912 1838.8872 1903.0143 1940.9054 1987.1174 1993.9468 2083.04612211.1000IEF點2411842.5100 870.5059 895.4053 995.5448 1009.5518 1023.5688 1045.48621179.4954 1201.5783 1234.5657 1263.5824 1277.6078 1307.5765 1314.67571325.6195 1383.6090 1404.5953 1427.7396 1434.6573 1458.6092 1460.68831462.6815 1475.6602 1478.6293 1512.7909 1524.8316 1564.6905 1576.69221580.6980 1611.7268 1638.7754 1649.7423 1660.7930 1700.7628 1707.72361716.7952 1725.7846 1743.8049 1754.9104 1762.7919 1766.7505 1794.77431826.7847 1837.8701 1855.8577 1900.9779 1940.9038 1993.9091 2011.91122016.0210 2027.1124 2082.9987 2152.9815 2196.1547 2201.1245 2211.10002284.1674 2298.1775 2315.1778 2402.2727 2521.3566IEF點13652973.5179 1036.4774 1060.5342 1065.4002 1090.4578 1157.5122 1179.52991193.5473 1263.6227 1277.6329 1307.6100 1320.5257 1383.6186 1421.61251434.6909 1458.6522 1475.6960 1493.6697 1513.7133 1532.7183 1638.81531657.7778 1707.7530 1716.8296 1784.6837 1796.9843 1837.9545 1851.91921941.9522 1993.9786 2054.1177 2150.1636 2184.0966 2211.0999 2225.12742383.9529 2400.0149 2510.1564IEF點140981151.6250 1187.5380 1211.6015 1252.6166 1263.6201 1267.6316 1277.63301302.6286 1307.6252 1329.6415 1340.5773 1383.6123 1424.6965 1460.70711475.6824 1487.7308 1535.8328 1555.7827 1589.7920 1613.8149 1638.84041647.7635 1663.3717 1700.9248 1707.7385 1716.8250 1743.8547 1778.93021794.7865 1837.9159 1851.9112 1872.9419 1881.0100 1922.9211 1933.95211940.9217 1964.9583 1987.0662 1993.9735 2035.0110 2082.9785 2184.10982196.1297 2211.0999 2225.1263 2230.1914 2239.1200 2250.0874 2314.1757表7以MS表征的人胰島細胞蛋白肽的分子量值從質(zhì)譜儀上直接讀出，因此與由這樣的儀器一般得到的準確性有關(guān)。這些質(zhì)量值來自從NEPHGE凝膠上回收的人胰島細胞蛋白，并不能與記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列)中的任何蛋白質(zhì)匹配。
NEPHGE點26842.5131 870.5369 1045.5217 1179.5371 1265.5405 1277.6271 1308.54571314.6746 1320.5417 1324.5497 1357.6471 1427.7444 1475.6748 1493.66611664.8418 1703.9330 1716.7841 1719.8587 1743.8199 1760.7887 1775.82731791.7874 1794.7814 1826.7590 1940.8930 1945.9745 1993.9401 2211.04532225.0987 2230.1019 2239.1267 2284.1508 2299.1526 2314.0976 2383.8783NEPHGE點351169.6652 1277.6525 1320.5251 1366.6936 1403.7316 1427.7965 1467.64931475.7490 1486.6881 1550.7053 1638.8392 1651.8001 1707.8210 1794.80891838.8934 1940.9146 1950.9534 1994.0184 2011.9465 2082.9935 2152.1050
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NEPHGE點3879806.4919 1029.6369 1036.5549 1045.5927 1065.5397 1087.5387 1090.59701115.5180 1157.6195 1165.5772 1175.6512 1179.6000 1198.6571 1201.67941205.6320 1232.6643 1243.6040 1277.7034 1297.6864 1300.5622 1307.66101314.7621 1320.5558 1323.6573 1330.7207 1337.6185 1340.7602 1344.73201383.6828 1426.7184 1434.7529 1438.8223 1441.7131 1469.7683 1475.75271493.7449 1535.8745 1634.8796 1638.8827 1656.7456 1675.8037 1707.78601716.8731 1728.8562 1743.8410 1759.8798 1785.9333 1794.8294 1804.84411838.9205 1990.1067 1994.0040 2211.1000NEPHGE點66001112.7125 1119.8876 1154.7604 1179.5853 1258.5560 1299.9739 1334.87591342.0311 1369.7625 1376.9353 1404.6771 1411.8281 1691.3292 1726.22451761.1320 1794.8996 2101.1599 2117.5243 2211.2240表8在人胰島細胞培養(yǎng)基中可檢測到的并以MS表征的蛋白肽的分子量值從質(zhì)譜儀上直接讀出，因此與由這樣的儀器一般得到的準確性有關(guān)。這些質(zhì)量值來自在培養(yǎng)基(如方法中所述)中培養(yǎng)人胰島后培養(yǎng)基中可檢測到的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)從IEF凝膠上回收。其肽的質(zhì)量值并不能與以相似的方法處理產(chǎn)生的肽匹配，如果有任何蛋白質(zhì)記錄在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列)。
IEF點122SPI842.5100 927.4963 973.5343 1066.4649 1109.4248 1165.5350 1179.55831213.6268 1234.6228 1263.6294 1277.6595 1300.4708 1307.6346 1315.62461320.5471 1357.6533 1365.5835 1379.6918 1383.6430 1390.6393 1400.63691405.6680 1421.6233 1427.7104 1434.7311 1475.7333 1493.6983 1497.75291513.7643 1639.9035 1657.7697 1699.8245 1707.7840 1716.8404 1745.83991797.0431 1819.0044 1834.9854 1837.9651 1993.9989 2096.1253 2114.10742129.9106 2211.0999 2224.2375 2239.1053 2249.0984 2367.2937 2383.95842509.2311 2705.2275 2872.5248 3314.3928IEF點123SPI842.5100 995.6139 1045.5020 1179.5325 1257.6289 1277.6396 1307.6108 1382.61041418.6783 1434.7291 1475.7101 1487.7178 1523.7513 1540.7742 1604.7757 1608.75951638.8370 1707.7398 1716.8473 1794.8201 1812.0723 1837.9388 1851.9256 1867.91821901.0100 1940.9715 1993.9586 2113.0096 2150.0818 2184.0996 2211.0999 2225.11032231.1825 2345.2339 2384.93041EF點1265PI842.5100 1023.6778 1095.6006 1137.7430 1164.6686 1198.6274 1204.6551 1217.65811277.6826 1291.6875 1308.6616 1313.6816 1366.7194 1371.7416 1383.6704 1428.79661439.7924 1444.7147 1475.7456 1487.7390 1570.8290 1619.8479 1629.8740 1638.85141662.8514 1674.8398 1679.8136 1684.8887 1692.8810 1707.7897 1794.8050 1824.96421837.9740 1852.9313 1867.9291 1869.9953 1896.0050 1902.0257 1940.9322 1953.04591962.9743 1993.9616 2151.0562 2158.1156 2169.0372 2184.0868 2211.1000 2283.21572297.1638 2345.2835 2748.3837IEF點1305P1842.5100 1036.5147 1075.5384 1082.5560 1107.5100 1165.5090 1179.5516 1198.65661277.6451 1303.6580 1307.6217 1329.6573 1393.6412 1455.6351 1475.7144 1487.70501515.7538 1638.8218 1657.7565 1704.8650 1707.7353 1758.8640 1790.8768 1794.7723
1799.8790 1811.8747 1837.9550 1839.9159 1872.9456 1914.0100 1941.9548 1993.95092047.0529 2054.0744 2150.0295 2184.0963 2211.0999 2250.0364 2383.9437IEF點135SPI842.5100 1271.6481 1343.6065 1413.7382 1440.6092 1452.6148 1515.7276 1571.79851692.8303 1709.7921 1794.8135 2211.1000IEF點140SPI842.5100 995.6118 1192.5588 1198.6323 1277.6308 1311.5802 1333.6658 1344.59901350.6185 1419.6963 1475.7224 1487.6666 1515.7236 1575.7435 1638.8524 1687.86741707.7437 1773.8513 1780.8198 1790.8845 1794.8104 1838.9057 1853.9362 1858.94841901.1178 1954.0130 1993.9445 2016.0588 2075.9670 2155.1313 2211.0999 2279.21902284.2035 2384.9802 2401.1453IEF點160SPI842.5100 944.4201 1045.4319 1093.3863 1121.4125 1179.4628 1195.4396 1277.56551297.5044 1302.5312 1307.5412 1320.4609 1350.5468 1383.5719 1475.6543 1556.65941638.8052 1650.7700 1657.7602 1684.7837 1707.7410 1794.7624 1812.8635 1838.92081851.8857 1872.9481 1931.9711 1993.9814 2211.0999 2225.1307 2383.9509 2389.2171IEF點218SPI842.5100 950.6771 995.4745 1021.4311 1043.4929 1045.4833 1060.51281109.4391 1126.4305 1142.4871 1157.5613 1179.5079 1199.4923 1210.52031220.5043 1234.6055 1263.6086 1277.6299 1286.5597 1300.4350 1302.61751307.5960 1314.7119 1320.5066 1329.5849 1353.6598 1357.6076 1365.54601383.5880 1393.6262 1427.7609 1434.7341 1475.6921 1493.6654 1545.77371553.7960 1700.7823 1707.7831 1714.8079 1716.8088 1726.8174 1794.79791825.9672 1838.9224 1922.9490 1933.9836 1940.9304 1987.0506 1993.96882005.0097 2083.0669 2211.0999 2225.1217 2230.1991 2239.1338 2283.25172297.1804 2344.3708 2367.2739 2384.1822 2401.2136 2662.6332 3077.67263095.4811 3339.9445 3349.7509IEF點248SPI842.5100 995.5661 1192.5533 1198.6455 1344.5956 1419.6789 1424.7739 1515.74731704.8844 1794.8113 1869.9654 1902.0689 1940.9132 1952.9542 1959.9920 2016.10832153.1172 2155.0712 2211.1000 2279.1779 2284.1800 2344.2439 2402.2584IEF點277SPI842.5100 944.5108 989.5777 1032.5590 1137.6793 1180.5632 1277.6210 1325.65291335.6512 1349.6238 1363.6523 1366.7033 1398.7028 1467.7336 1475.7235 1538.84411602.7634 1636.8005 1638.8129 1652.7675 1670.9066 1703.8669 1719.9301 1743.80321758.8949 1794.7991 1839.8938 1931.1572 1940.9432 1993.9414 2030.0920 2153.03952176.9849 2211.0999 2284.1637 2298.1739 2345.2744IEF點304SPI842.7320 2211.6199 2225.6395 2284.7376 2346.7681IEF點314SPI1747.1466 1929.2249 2040.3318 2079.2340 2292.4766 2309.5383 2338.5453 2367.6507IEF點338SPI842.5100 1277.6344 1298.6552 1302.6274 1307.5972 1329.6478 1381.7755 1398.66031426.7642 1475.7128 1487.6784 1523.7645 1602.7505 1638.8279 1707.7565 1742.84191758.8799 1784.7091 1794.7915 1812.0358 1838.9245 1851.9135 1867.8992 1941.95941966.0151 1969.0193 1993.9537 2150.0574 2176.0349 2184.0894 2211.0999 2225.11842286.1485 2299.1497 2331.1452 2361.1860 2383.9924 2501.1805 2509.2701 2580.31952643.3333 2702.2667 2707.2342 2718.2130 2723.3186 2808.3617 2832.346權(quán)利要求
1.一種診斷包括人類的哺乳動物的糖尿病的方法，該方法包括測定取自所述哺乳動物的生物樣品內(nèi)的至少一種標記蛋白的存在與否或表達水平，其中該標記蛋白選自a) 表1、2和/或3中定義的蛋白質(zhì)；和b) 表1、2或3中蛋白質(zhì)的修飾體或衍生物，它與表1、2或3中的蛋白質(zhì)有至少80％的序列同源性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的方法包括確定選自下列中的至少一種標記蛋白增加的表達(增量調(diào)節(jié)的標記蛋白)a) 表1和/或2和/或3中定義的并用上箭頭標記的蛋白質(zhì)；和b) a)中蛋白質(zhì)的修飾體或衍生物，它與a)中的蛋白質(zhì)有至少80％的序列同源性。
3.權(quán)利要求1或2任一項的方法，其中所述生物樣品選自尿液、血液、唾液、淋巴液和組織。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述組織為胰腺組織。
5.一種測定包括人的哺乳動物患糖尿病傾向的方法，該方法包括測定取自所述哺乳動物的生物樣品內(nèi)的至少一種標記蛋白的存在與否或相對表達水平，其中該標記蛋白選自a) 表1、2和3中定義的蛋白質(zhì)；和b) 表1、2或3中蛋白質(zhì)的修飾體或衍生物，它與表1、2或3中的蛋白質(zhì)有至少80％的序列同源性。
6.一種測定人患糖尿病傾向的方法，該方法包括a) 測定取自人體的生物樣品內(nèi)至少一種標記蛋白增加的表達，所述的標記蛋白選自i)表1、2和/或3中定義的增量調(diào)節(jié)的蛋白，和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中蛋白有至少80％的序列同源性；b) 測定取自人體生物樣品內(nèi)至少一種標記蛋白減少的表達，所述的標記蛋白選自i)表1、2和/或3定義的減量調(diào)節(jié)的蛋白，和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)蛋白有至少80％的序列同源性；或c) a)與b)中測定的組合。
7.權(quán)利要求1、5或6中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中至少一種標記蛋白選自a) 所述的生物樣品的蛋白中在聚丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)出的量明顯低于或明顯高于對照品的一種或多種蛋白；b) 在所述生物樣品蛋白的聚丙烯酰胺凝膠上存在而在對照品的聚丙烯酰胺凝膠上不存在的一種或多種蛋白；和c) 在所述生物樣品蛋白的聚丙烯酰胺凝膠上不存在而在對照品的聚丙烯酰胺凝膠上存在的一種或多種蛋白。
8.一種治療包括人類的哺乳動物的糖尿病的方法，包括改變選自下列中的至少一種標記蛋白的表達a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
9.一種治療包括人類的哺乳動物的糖尿病的方法，包括對所述的人施用選自下列中的至少一種化合物a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3中的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 與a)和/或b)中的蛋白有同樣功能的蛋白；d) 編碼a)、b)或c)中蛋白的核苷酸序列；e) a)、b)或c)的蛋白的抗體；f) 能結(jié)合a)、b)或c)的蛋白的核酸片段；和g) 能結(jié)合a)、b)或c)的蛋白的化合物。
10.一種預(yù)防或延遲包括人的哺乳動物糖尿病發(fā)病的方法，包括給所述的人施用a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性；c) a)和b)中定義的蛋白的模擬物；d) 編碼a)和/或b)中定義的蛋白的核苷酸序列；e) a)和/或b)中定義的蛋白的抗體；f) 能結(jié)合a)和/或b)的蛋白的核酸片段；和/或g) 能結(jié)合a)和/或b)中定義的蛋白的化合物。
11.一種測定物質(zhì)對治療糖尿病具有治療性效果的可能性的方法，包括在將測試模型暴露于所述物質(zhì)之前和之后測定選自下列中的一種或多種蛋白的表達水平a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
12.一種測定化合物治療糖尿病的效果的方法，包括測定選自下列中的一種或多種蛋白的表達水平a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3中的蛋白有至少80％的序列同源性。
13.一種測定用于治療糖尿病的化合物效果水平的方法，包括在將試驗?zāi)Ｐ捅┞队谒鑫镔|(zhì)之前和之后測定選自下列中的一種或多種蛋白的表達水平a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
14.一種測定患糖尿病或易患糖尿病的包括人類的哺乳動物的糖尿病的特征或誘因的方法，包括相對一種模型確定選自下列的蛋白的表達水平a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
15.一種基本純的蛋白，選自a) 表1、2和3中的蛋白；和c) 與a)中蛋白有至少80％序列同源性的蛋白。
16.一種核酸片段，包括編碼表1、2或3中定義的蛋白或與其有至少80％序列同源性的蛋白的核苷酸序列。
17.一種與根據(jù)權(quán)利要求16的核酸片段或其部分或其互補鏈雜交的核酸片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求16-17中任一項的核酸片段用于檢測選自下列的肽的存在的用途a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
19.能結(jié)合選自下列的蛋白的抗體a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
20.權(quán)利要求19的抗體，所述抗體為多克隆抗體。
21.權(quán)利要求19的抗體，所述抗體為單克隆抗體。
22.權(quán)利要求19-21中任一項的抗體用于檢測選自下列的蛋白的存在的用途a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
23.一種診斷包括人類的哺乳動物的糖尿病或糖尿病遺傳傾向的測試試劑盒，包括a) 一種特異性結(jié)合選自下列的至少一種標記蛋白的結(jié)合工具i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；或該結(jié)合工具為至少一種所述標記蛋白的抗體、能結(jié)合至少一種所述標記蛋白的核酸片段或能結(jié)合至少一種所述標記蛋白的化合物；b) 一種檢測所述結(jié)合工具與至少一種所述標記蛋白或與至少一種所述核酸片段結(jié)合，若有的話，或結(jié)合的水平的工具，和c) 一種將與結(jié)合工具的結(jié)合，若有的話，或結(jié)合的水平是否表示個體哺乳動物有患糖尿病的較高可能性或有患糖尿病的遺傳傾向相關(guān)聯(lián)的工具。
24.一種測定物質(zhì)的效果的方法，該方法包括使用哺乳動物，例如人，其中哺乳動物是通過運用權(quán)利要求1-7中的任一項的方法確定為有患糖尿病的較大可能性或有患糖尿病的遺傳傾向的個體，該方法包括將所述的物質(zhì)施用給所述個體并測定該物質(zhì)的效果。
25.一種藥物組合物，包括a) 能調(diào)節(jié)核酸片段表達的物質(zhì)，該核酸片段編碼選自下列的蛋白的至少片段i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；b) 選自下列的標記蛋白i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 選自下列的蛋白的衍生物、同源物或模擬物i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；d) 選自下列的蛋白的抗體i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；e) 能結(jié)合選自下列的標記蛋白的核酸片段、衍生物或模擬物(如PNA)i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；f) 能結(jié)合選自下列的標記蛋白的化合物i)表1、2和/或3中定義的蛋白；和ii)i)中蛋白的修飾體或衍生物，它與i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；
26.用作藥物，如用于治療或預(yù)防糖尿病的權(quán)利要求25的藥物組合物。
27.選自下列的化合物在制備用于治療或預(yù)防糖尿病的藥物中的用途a) 表1、2和/或3中定義的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修飾體或衍生物，它與表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 與a)和/或b)中的蛋白有同樣功能的蛋白；d) 編碼a)、b)或c)中蛋白的核苷酸序列；e) a)、b)或c)中蛋白的抗體；f) 能結(jié)合a)、b)或c)的蛋白的核酸片段、衍生物或模擬物(例如PNA)；和g) 能結(jié)合a)、b)或c)的蛋白的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供人分沁型和非分沁型糖尿病介導(dǎo)蛋白質(zhì)，包括保護性的和有害的糖尿病介導(dǎo)蛋白質(zhì)，以及編碼上述蛋白質(zhì)的多核苷酸，用于鑒定能改變糖尿病介導(dǎo)蛋白質(zhì)表達的試驗化合物的藥物篩選法，通過施用能改變糖尿病介導(dǎo)蛋白質(zhì)表達的化合物來預(yù)防或改善糖尿病的方法。
文檔編號C07K14/47GK1856708SQ03811434
公開日2006年11月1日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月20日
發(fā)明者P·M·拉森, S·J·菲, J·納魯普, A·E·卡爾森 申請人:普賴德普羅特奧米克斯公司