胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是基于本發(fā)明發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷作用所提出的發(fā)明創(chuàng)造。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：胡椒堿可顯著抑制細(xì)菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，顯著抑制LPS+ATP誘導(dǎo)的促炎癥因子IL?1β和危險(xiǎn)信號(hào)分子HMGB1的釋放，并可有效防止細(xì)菌感染引起的多臟器損傷。目前臨床上尚無可有效防止細(xì)菌和真菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的特異性藥物。胡椒堿用于制備用于防止因感染而引起細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物的應(yīng)用，對臨床治療敗血癥等具有重要意義，可用于相關(guān)藥物開發(fā)。
【專利說明】
胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞焦亡是一種炎癥激活細(xì)胞的程序性死亡方式。具體來說，細(xì)菌和真菌等感染， 可造成肝臟等多臟器損傷，導(dǎo)致敗血癥性休克。多臟器損傷的原因是多方面的。最新的研究 表明，微生物感染以后，人體細(xì)胞(包括免疫細(xì)胞)借助其模式識(shí)別受體，識(shí)別病原相關(guān)分子 模式(如細(xì)菌的LPS)，細(xì)胞因此而激活，啟動(dòng)NF-κΒ和炎癥小體信號(hào)通路，促進(jìn)pro-IL-Ιβ等 炎癥因子(前體）的表達(dá)。在ATP等第二信號(hào)刺激下，前述被激活的細(xì)胞可快速焦亡，這被認(rèn) 為是多臟器損傷的直接原因之一。焦亡是快速的細(xì)胞死亡過程，是造成多臟器損傷和嚴(yán)重 敗血癥的重要原因。臨床上，嚴(yán)重?cái)⊙Y尚無特異性藥物可供治療，死亡率很高。而那些從 敗血癥中生存下來的患者，由于多臟器受到損傷，其主要臟器功能下降，免疫力差，日后仍 將面臨慢性疾病的困擾，包括體弱多病、認(rèn)知缺陷、預(yù)期壽命縮短等。因此，如何防止細(xì)胞焦 亡，防止嚴(yán)重?cái)⊙Y過程中的多臟器損傷，具有非常重要的醫(yī)學(xué)意義。
[0003] 胡椒堿(Piperine，本文簡稱PIP)是從黑胡椒(Piper nigrum)等胡椒科植物中提 取的生物堿，化學(xué)名為：（E，E)-1-[5-(l，3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-1-氧代-2,4-戊二烯基]-哌啶（分子式為C 17H19N03，分子量為285.34)，可溶于二甲亞砜(DMS0)、乙醇、氯仿等有機(jī)溶 劑。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
[0004]
[0005] 胡椒也是一味重要的中藥，入胃大腸經(jīng)，溫中散寒，下氣，消痰。主要用于治療胃腸 不適和癲癇等癥，包括胃寒嘔吐，腹痛泄瀉，食欲不振，癲癇痰多。胡椒堿在治療結(jié)腸炎方面 的用途（見CN103690537A)。
[0006] 胡椒堿對細(xì)胞焦亡的影響，目前尚未見諸報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和 多臟器損傷藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥 物中的應(yīng)用。
[0009] 所述的胡椒堿通過抑制促炎癥因子IL-Ιβ和危險(xiǎn)信號(hào)分子HMGB1的釋放進(jìn)而抑制 細(xì)胞焦亡。
[0010] 所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物包含可接受的輔料。
[0011] 所述的輔料優(yōu)選為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、 吸附載體、表面活性劑或潤滑劑。
[0012] 所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物還包含其他起配伍協(xié)同作用的有效成分。
[0013] 所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物可以為各種劑型，如片劑、顆粒劑、膠囊、 滴丸、緩釋劑、口服液、注射劑等。
[0014] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明是基于本發(fā)明發(fā)明人首先 發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷作用所提出的發(fā)明創(chuàng)造。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn):胡 椒堿可顯著抑制細(xì)菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，顯著抑制LPS+ATP誘導(dǎo)的促炎癥因子IL-Ιβ和危 險(xiǎn)信號(hào)分子HMGB1的釋放，并可有效防止細(xì)菌感染引起的多臟器損傷。胡椒堿的上述新的活 性與用途，尚未見公開文獻(xiàn)報(bào)道。目前臨床上尚無可有效防止細(xì)菌和真菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞 焦亡和多臟器損傷的特異性藥物。胡椒堿用于制備用于防止因感染而引起細(xì)胞焦亡和多臟 器損傷藥物的應(yīng)用，對臨床治療敗血癥等具有重要意義，可用于相關(guān)藥物開發(fā)。
【附圖說明】
[0015 ]圖1是胡椒堿作用于LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1后的細(xì)胞形態(tài)顯微鏡照 片圖；其中，BF表示明場狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài);Hoechst顯示所有細(xì)胞的細(xì)胞核;PI是一種細(xì)胞 核染料，可進(jìn)入死亡的細(xì)胞，PI染色表示細(xì)胞焦亡;Merge表示將Hoechst圖和PI圖合并。
[0016] 圖2是胡椒堿對LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1細(xì)胞焦亡影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 圖；**，Ρ〈0·01 ;***，Ρ〈0·001。
[0017] 圖3是胡椒堿對LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)細(xì)胞焦亡影響的統(tǒng) 計(jì)結(jié)果圖；*#，Ρ〈〇·〇〇1。
[0018] 圖4是胡椒堿作用于LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1后的免疫印跡分析結(jié)果 圖；A表示上清中HMGB1和pro-caspase-Ι的分泌情況，B表示細(xì)胞裂解物中HMGB1、pr〇-caspase-1 和 pro-IL-Ιβ 的表達(dá)情況。
[0019]圖5是胡椒堿作用于LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1后上清液中IL-Ιβ的分 泌情況的檢測結(jié)果圖；**，P〈〇. 01。
[0020] 圖6是胡椒堿作用于LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的免疫印跡分析結(jié)果 圖;A表示上清中IL-Ιβ和caspase-Ι的分泌情況，B細(xì)胞裂解物中pro-IL-Ιβ和pro-caspase-1的表達(dá)情況。
[0021] 圖7是小鼠經(jīng)胡椒堿灌胃及細(xì)菌感染后肝臟組織切片的顯微照片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0023]實(shí)施例中所用到的材料：
[0024]胡椒堿（純度>98%)購自廣東省藥品檢驗(yàn)所；胡椒堿溶于溶劑(體內(nèi)實(shí)驗(yàn)溶于含 2%Tween-80的PBS溶液，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)溶于DMS0中）。LPS、ATP、DMS0、Tween-80購自Sigma-Aldrich公司。細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等為Gibco公司產(chǎn)品。微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技 術(shù)（cytometric bead array，CBA)檢測試劑盒為BD Biosciences公司產(chǎn)品。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] (1)細(xì)胞培養(yǎng)及處理
[0027]小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A. 1細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10 %胎牛 血清和含 l〇〇U/ml 青霉素 (penicillin )、100μg/ml鏈霉素（streptomycin)的DMEM(完全培養(yǎng) 基）中。待細(xì)胞長至對數(shù)生長期，種于24孔板中，細(xì)胞密度為3 X104/孔(500μ1培養(yǎng)基），培養(yǎng) 24h。然后（換液)加入不同濃度的胡椒堿（1、5、10、20、40、80μπι 〇 1/L)各500μ1，預(yù)處理24h。再 加入50μg/ml LPS5yl，使其終濃度為500ng/ml，處理4h激活細(xì)胞。最后，細(xì)胞培養(yǎng)基換成含 0.1%FCS和5mmol/L ATP的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基體積為500μ1，ΑΤΡ處理時(shí)間為lh。
[0028] (2)焦亡細(xì)胞檢測及觀察
[0029] 經(jīng)上述處理，細(xì)胞發(fā)生焦亡。細(xì)胞經(jīng)500μ1終濃度為lμg/ml的碘化丙錠(PI)工作液 染色10min后，細(xì)胞核用Hoechst 33342(終濃度lμg/ml)染色顯示，在Zeiss熒光顯微鏡觀察 計(jì)數(shù)，該顯微鏡配有Zeiss Axio Cam MR R3cooled CCD相機(jī)，控制和分析軟件為ZEN software(Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Gduingen,Germany)〇
[0030] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0031] 紅色熒光(PI染色）表示該細(xì)胞已焦亡。結(jié)果如圖1、圖2所示，胡椒堿(PIP)劑量依 賴性地抑制LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞焦亡；**表示？〈0.01;***表示卩〈 0.001。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] (1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0034] L929細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)方法參照Monack Lab protocol (Stanford)，將1 X 108個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于底面積為500cm2的三角瓶中，培養(yǎng)基為DMEM完 全培養(yǎng)基，200ml。
[0035] 小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)的培養(yǎng)方法:C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，購自南 方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)頸椎脫白處死后，取其大腿骨，用注射器將骨髓細(xì)胞用DMEM培 養(yǎng)基沖出。得到的細(xì)胞用BM Mac培養(yǎng)基(80 % DMEM完全培養(yǎng)基+20 % L929細(xì)胞培養(yǎng)上清），培 養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)皿(密度為5 X106/皿，培養(yǎng)基體積為8-10ml)。培養(yǎng)3天，添加10ml新的培養(yǎng) 基;培養(yǎng)第5天，替換為上述新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)第7天，收集細(xì)胞，按常規(guī)方法凍存?zhèn)溆谩?br>[0036] (2)細(xì)胞焦亡的誘導(dǎo)方法
[0037]上述BMDM細(xì)胞，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基。按實(shí)施例1的方法種于24孔板，每孔培養(yǎng) 基體積為500μ1;培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)基替換為含不同濃度的胡椒堿(80、160ym〇l/L)的完全培 養(yǎng)基各500μ1，預(yù)處理4h，然后加入5μ1的LPS溶液(工作濃度50μg/ml)，使其終濃度為500ng/ ml，處理4h激活細(xì)胞。接著將培養(yǎng)基替換為含0.1%FCS和2mmol/L ATP的DMEM培養(yǎng)基(每孔 500μ1)，處理 0.5h。
[0038] (3)細(xì)胞焦亡的檢測方法：
[0039] 同實(shí)施例1。
[0040] (4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0041] 結(jié)果如圖3所示，胡椒堿(PIP)劑量依賴性地抑制小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞細(xì)胞焦 亡;**表示P〈0 · 01; ***表示P〈0 · 001。
[0042] 實(shí)施例3
[0043] 小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基種于直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，待細(xì) 胞進(jìn)入對數(shù)生長期，經(jīng)含不同濃度胡椒堿(20、40、80μπι 〇 1/L)的DMEM完全培養(yǎng)基(4ml/孔)預(yù) 處理24h;再加入40μ1 LPS溶液(工作液濃度50μg/ml，使其終濃度達(dá)到500ng/ml)處理4h;最 后將培養(yǎng)基替換為含〇. 1%FCS和4mmol/L ATP的DMEM培養(yǎng)基(4ml)處理lh。細(xì)胞經(jīng)上述處理 后，免疫印跡方法檢測其焦亡相關(guān)蛋白或信號(hào)分子的表達(dá)。從圖4可知，細(xì)胞經(jīng)LPS+ATP(圖 中的第三泳道)處理后，激活caspase-Ι (圖A，上清，pro-caspase-Ι加工為caspase-Ι活性形 式），并上調(diào)pro-IL-Ιβ的表達(dá);經(jīng)PIP預(yù)處理的細(xì)胞，可抑制LPS+ATP上調(diào)的caspase-Ι激活 和HMGB1 (細(xì)胞死亡時(shí)釋放到胞外的一種危險(xiǎn)信號(hào)分子)的釋放。
[0044] 實(shí)施例4
[0045]細(xì)胞處理方法同"實(shí)施例3"。由于J774A. 1細(xì)胞上清中IL-Ιβ的蛋白水平較低，難以 用免疫印跡方法檢測，因此本實(shí)驗(yàn)用BD公司的CBA檢測試劑盒檢測上清中IL-Ιβ的表達(dá)水 平。CBA方法檢測IL-Ιβ的方法完全按BD公司提供的方法進(jìn)行。從圖5可知，LPS+ATP誘導(dǎo)細(xì)胞 焦亡，釋放E-Ιβ;而經(jīng)PIP(80ymol/L)預(yù)處理的細(xì)胞，其E-Ιβ釋放水平受到抑制(有文獻(xiàn)表 明，IL-W的釋放總是伴隨著細(xì)胞死亡，但釋放機(jī)制尚不清楚）。
[0046] 實(shí)施例5
[0047] 小鼠 BMDM細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例2。細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基種于6孔板，待細(xì) 胞進(jìn)入對數(shù)生長期，經(jīng)含不同濃度胡椒堿(40、80、160ym 〇l/L)的DMEM完全培養(yǎng)基(2ml/孔） 預(yù)處理4h;再加入20μ1 LPS溶液（工作液濃度50μg/ml，使其終濃度達(dá)到500ng/ml)處理4h; 最后將培養(yǎng)基替換為含〇. 1 %FCS和3mmol/L ATP的DMEM培養(yǎng)基（1.2ml)處理0.5h。細(xì)胞經(jīng)上 述處理后，Western blotting方法檢測其焦亡相關(guān)蛋白或信號(hào)分子的表達(dá)。從圖6可知，細(xì) 胞經(jīng)LPS+ATP(圖中的第三泳道)處理后，激活caspase-Ι(左圖，上清），上調(diào)pro-IL-Ιβ的表 達(dá)(右圖，細(xì)胞裂解液）；經(jīng)PIP預(yù)處理的細(xì)胞，可抑制LPS+ATP上調(diào)的caspase-Ι激活（左、右 圖），以及上清中成熟IL-1邱勺釋放(左圖）。
[0048] 實(shí)施例6
[0049] (1)細(xì)菌培養(yǎng)
[0050] E.coli DH5a在Luria Broth(LB)培養(yǎng)基中搖菌過夜(37°C)，次日按10%菌液在新 鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)搖菌擴(kuò)增3h(37°C)。擴(kuò)增后的菌液在1824Xg離心力下離心10分鐘，PBS洗 滌后，重懸于PBS溶液備用。細(xì)菌密度用微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop 2000; Thermo Scientific)測定;對應(yīng)的菌落形成單位(colony forming units，CFU)由傳統(tǒng)LB瓊脂糖平 板涂布培養(yǎng)確定。
[0051 ] (2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0052] C57BL/6小鼠（購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性養(yǎng)殖一周后， 按20mg/kg體重胡椒堿灌胃3天(每天一次）后，腹腔接種E. coli細(xì)菌（2 X 109CFU/只）。細(xì)菌 感染后8h，處死小鼠，解剖，用4%中性甲醛溶液固定肝臟、大腸等重要臟器，脫水后石蠟包 埋，組織化學(xué)方法(HE染色)檢測器官損傷情況。
[0053] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0054] 顯微鏡下觀察組織切片，可觀察到：細(xì)菌感染引起器官損傷(壞死區(qū)）和炎癥細(xì)胞 浸潤，而"胡椒堿+細(xì)菌"處理組則上述癥狀顯著減輕。說明胡椒堿可有效緩解細(xì)菌感染引起 的多臟器損傷。圖7顯示各組動(dòng)物肝臟組織切片(Η.E.染色，20X物鏡）。
[0055]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用，其特 征在于:所述的胡椒堿通過抑制促炎癥因子IL-Ιβ和危險(xiǎn)信號(hào)分子HMGB1的釋放進(jìn)而抑制細(xì) 胞焦亡。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用，其特 征在于:所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物包含可接受的輔料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用，其特 征在于:所述的輔料為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、吸附 載體、表面活性劑或潤滑劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的應(yīng)用，其特 征在于:所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物還包含其他起配伍協(xié)同作用的有效成分。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的胡椒堿在制備抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷藥物中的 應(yīng)用，其特征在于:所述的抗細(xì)胞焦亡和多臟器損傷的藥物的劑型為片劑、顆粒劑、膠囊、滴 丸、緩釋劑、口服液或注射劑。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK106038563SQ201610427621
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】歐陽東云, 何賢輝, 梁譯丹, 徐麗慧, 李陳廣, 魏紅霞, 潘浩
【申請人】暨南大學(xué)